CN108977385B - 一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用，本发明涉及一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用。本发明的目的是要解决现有在防治灰霉病、茎腐病以及稻瘟病防治上存在着农残隐患的问题，本发明的产几丁质酶的米修链霉菌为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为CGMCC No.15332。本发明的应用是指在粮食作物病害防治上的应用。菌株A2对大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病均有很好的拮抗作用，无农药残留，不产生抗药性。本发明应用于环境微生物技术领域。

Description

一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用。
背景技术
大豆、玉米和水稻是我国主要粮食作物，也是最主要的经济作物。大豆灰霉病会侵染大豆整个生长时期，引发大豆病害；玉米茎腐病在玉米产区是较为普遍发生的一种系统侵染的土传病害；水稻稻瘟病是水稻生产上威胁最大的病害之一。目前控制大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病的主要方法仍是以化学农药为主，但是鉴于化学农药存在着农残隐患，为提高大豆、玉米以及水稻的品质，探索防治灰霉病、茎腐病以及稻瘟病的新方法已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是要解决现有在防治灰霉病、茎腐病以及稻瘟病防治上存在着农残隐患的问题，提供了一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用。
本发明一株产几丁质酶的米修链霉菌为米修链霉菌(Streptomycesmisionesis.)A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为CGMCC No.15332。
本发明一株产几丁质酶的米修链霉菌的应用是指在粮食作物病害防治上的应用。
本发明采用野生稻根际土壤中进行产几丁质酶菌株的分离纯化：
初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10-1、10-2、10-3浓度的稀释液各80μL，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)
复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出产几丁质酶的米修链霉菌Streptomycesmisionesis.A2，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定A2菌株的生理生化特征发现，A2菌株的接触酶阴性，甲基红反应为阴性，V-P反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对NaCl的耐受性为10％。
利用基因组提取试剂盒(FastDNASpin Kit for Soil)提取菌株的基因组，进行16SrDNA的扩增。PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到Genbank。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用MEGA5.1软件中Neihbor-Joinhing构建系统发育进化树。A2菌株与米修链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2。
本发明提供了在野生稻根际土壤中筛选得到具有几丁质酶活且对大豆灰霉病、玉米茎腐病有抑制作用的米修链霉菌菌A2菌株，保藏编号为CGMCC NO.15332，它是在江西东乡不同地点的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病拮抗效果好的菌株，经大量的实验证明，菌株A2不仅具有几丁质酶活，且对大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病有很好的拮抗作用，A2发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.8％，对茎腐病的抑制效果达到89.4％，对稻瘟病的抑制效果达到73.1％。
本发明利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远
附图说明
图1为A2菌株在PDA平板上的形态图；
图2为A2菌株分子鉴定聚类图谱；
图3为A2菌株与灰霉病的拮抗效果图；
图4为A2菌株与茎腐病的拮抗效果图；
图5为A2菌株与稻瘟病的拮抗效果图；
图6为A2发酵液和灰霉病特效素对灰霉病抑制效果图；
图7为A2发酵液和甲基托布津对茎腐病抑制效果图；
图8为A2发酵液和稻瘟灵对稻瘟病抑制效果图；
图9为A2发酵液和灰霉病特效素对灰霉病抑制效果的对比图；其中a为A2发酵液，b为灰霉病特效素；
图10为A2发酵液和甲基托布津对茎腐病抑制效果的对比图；其中a为A2发酵液，c为甲基托布津；
图11为A2发酵液和稻瘟灵对稻瘟病抑制效果的对比图；其中a为A2发酵液，d为稻瘟灵。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一株产几丁质酶的米修链霉菌为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为CGMCC No.15332。
本实施方式采用野生稻根际土壤中进行产几丁质酶菌株的分离纯化：
初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10-1、10-2、10-3浓度的稀释液各80μL，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)
复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出产几丁质酶的米修链霉菌Streptomycesmisionesis.A2，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定A2菌株的生理生化特征发现，A2菌株的接触酶阴性，甲基红反应为阴性，V-P反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对NaCl的耐受性为10％。
利用基因组提取试剂盒(FastDNASpin Kit for Soil)提取菌株的基因组，进行16SrDNA的扩增。PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到Genbank。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用MEGA5.1软件中Neihbor-Joinhing构建系统发育进化树。A2菌株与米修链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2。
本实施方式利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远
具体实施方式二：本实施方式一株产几丁质酶的米修链霉菌的应用是指在粮食作物病害防治上的应用。
本实施方式提供了在野生稻根际土壤中筛选得到具有几丁质酶活且对大豆灰霉病、玉米茎腐病有抑制作用的米修链霉菌菌A2菌株，保藏编号为CGMCC NO.15332，它是在江西东乡不同地点的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病拮抗效果好的菌株，经大量的实验证明，菌株A2不仅具有几丁质酶活，且对大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病有很好的拮抗作用，A2发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.8％，对茎腐病的抑制效果达到89.4％，对稻瘟病的抑制效果达到73.1％。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：粮食作物为大豆、玉米和水稻。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：产几丁质酶的米修链霉菌应用在对大豆灰霉病的抑制上。其他与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：产几丁质酶的米修链霉菌应用在对玉米茎腐病的抑制上。其他与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：产几丁质酶的米修链霉菌应用在对水稻稻瘟病的抑制上。其他与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2的筛选方法为：初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10-1、10-2、10-3浓度的稀释液各80μL，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)
复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出产几丁质酶的米修链霉菌Streptomycesmisionesis.A2，A2菌株在PDA平板上的形态图如图1所示，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定A2菌株的生理生化特征发现，A2菌株的接触酶阴性，甲基红反应为阴性，V-P反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对NaCl的耐受性为10％。
利用基因组提取试剂盒(FastDNA Spin Kit for Soil)提取菌株的基因组，进行16SrDNA的扩增。PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到Genbank。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用MEGA5.1软件中Neihbor-Joinhing构建系统发育进化树。A2菌株与米修链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2。
具体实施方式八：本实施方式米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2的鉴定：
1.生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定A2菌株的生理生化特征发现，A2菌株的接触酶阴性，甲基红反应为阴性，V-P反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对NaCl的耐受性为10％。
表1菌株A2的生理生化特性
Figure BDA0001756412840000051
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2.分子鉴定
利用基因组提取试剂盒(FastDNA Spin Kit for Soil)提取菌株的基因组，进行16SrDNA的扩增。PCR通用引物为：27F(5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ˊ)，1492R(5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ)，反应体系25μL，Premix version 2.0 12.5μL，27F(10nM)1μL，1492R(10nM)1μL，DNA模板1μL，无菌水不足至25μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min。
PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到Genbank。DNA序列如SEQ ID NO：1所示。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用MEGA5.1软件中Neihbor-Joinhing构建系统发育进化树(图2)。A2菌株与米修链霉菌菌属的同源性最高，达99％，最终命名为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2。
对本实施方式的产几丁质酶的米修链霉菌Streptomyces ansochromogenes.F7在粮食作物病害防治上的功能性验证：
试验1：平板对峙法对大豆灰霉病、玉米茎腐病和水稻稻瘟病拮抗作用
采用平板对峙法，测定拮抗菌株对灰霉病、茎腐病和稻瘟病的抑菌活性。先将灰霉病、黑斑病和稻瘟病分别在PDA平板上进行活化，挑选长势旺盛的病原菌平板。用打孔器制成直径为7mm的菌饼，倒置于PDA平板，将拮抗菌菌株的菌饼接种在距病原菌约2cm处，其中以不接拮抗菌的平板为对照，每组3个重复，置于26℃下恒温培养箱中培养2-6天，观察抑菌圈的大小(图3，图4，图5)。并在第2，4，6天的时候记录病原菌的菌落最小半径以及对照菌落的半径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照菌落半径×100
从不同天数的抑菌率数据来看，A2菌株在第6天时对灰霉病的抑制效果最佳达到90.6％，对茎腐病的抑制效果达67.1％，对稻瘟病的抑制效果达86.9％。
试验2：A2发酵液分别和灰霉病特效素、甲基托布津和稻瘟灵对灰霉病、茎腐病和稻瘟病的抑制效果
A2发酵液的制备：250ml三角瓶中装入100ml发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖10.0g，酵母浸膏7.5g加蒸馏水定容至1000ml)，121℃下高压灭菌。在超净工作台中将A2菌饼接入到冷却的液体培养基中，于160rpm恒温震荡摇床中发酵培养3天后，得到发酵液，将发酵液3500rpm离心5分钟收集菌体，无菌水洗涤2次后重悬浮无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释浓度为107-8cfu/ml，备用。
农药稀释液制备：将市售灰霉病特效素(北美农大)和甲基托布津(70％)(北美农大)和稻瘟灵(北美农大)按照使用说明稀释500-1000倍，为了验证A2对病原菌的抑制效果，我们对灰霉病特效素、甲基托布津和稻瘟灵分别进行了250倍稀释和500倍稀释。
拮抗试验：分别取100μLA2的发酵滤、250倍灰霉病特效素稀释液、500倍灰霉稀释液、250倍70％甲基托布津稀释液、500倍70％甲基托布津稀释液、250倍稻瘟灵稀释液、500倍稻瘟灵稀释液分别涂布于PDA平板，平皿中央分别接种7mm灰霉病、茎腐病、稻瘟病病原菌的菌饼，以无菌水为对照(图6，图7，图8)，每组3个重复，26℃下恒温培养，在第2，3，4，5天测量病原菌的直径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-病原菌菌落直径)/对照菌落直径×100％
结果显示：由于500倍稀释的灰霉病特效素和甲基托布津以及稻瘟灵几乎对灰霉病和茎腐病以及稻瘟病无抑制效果，因此仅在图中比较了A2发酵液和250倍稀释液的灰霉病特效素、甲基托布津和稻瘟灵的抑制作用(图9，图10，图11)，其中随着天数的增加A2发酵液对灰霉病和茎腐病以及稻瘟病的抑制效果逐渐增强。在第5天时，A2发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.8％，对茎腐病的抑制效果达到89.4％，对稻瘟病的抑制效果达到73.1％。而灰霉病特效素和甲基托布津以及稻瘟灵的效果随着天数的增加逐渐降低，灰霉病特效素和甲基托布津均在第2天的抑制效果最好，分别为68％、36.8％和15.38％。
序列表
<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所
<120>一株产几丁质酶的米修链霉菌及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213>米修链霉菌（Streptomyces misionesis.）
<400> 1
gccccttgcc gggtgcttac acatgcagtc gaacgatgaa gcccttcggg gtggattagt 60
ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgccctgcac tctgggacaa gccctggaaa 120
cggggtctaa taccggatat gaccgtcttg ggcatccttg acggtgtaaa gctccggcgg 180
tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtgaggt agtggctcac caaggcgacg 240
acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc 360
gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgagagtg 420
acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt gtcacgtcgg 540
ttgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcagtcgat acgggcaggc tagagttcgg 600
taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg 660
gtggcgaagg cggatctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca 780
ttccacgttg tccgtgccgc agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa 900
ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac accggaaagc attagagata 960
gtgcccccct tgtggtcggt gtacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtccc gtgttgccag caggcccttg 1080
tggtgctggg gactcacggg agaccgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt 1140
caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga 1200
gctgcgatac cgtgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc 1260
tgcaactcga ccccatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga 1380
agccggtggc ccaacccctt gtgggaggga gcttcgaagg tgacccgatt g 1431
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物27F的核苷酸序列。
<400> 2
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物1492R核苷酸序列。
<400> 3
GGTTACCTTG TTACGACTT 19

Claims (1)

1.一株产几丁质酶的米修链霉菌在粮食作物病害防治上的应用，其特征在于所述粮食作物病害为大豆灰霉病、玉米茎腐病或水稻稻瘟病；
所述产几丁质酶的米修链霉菌为米修链霉菌(Streptomyces misionesis.)A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为CGMCC No.15332。
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