CN106434409B - 一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌OsiLf-2 - Google Patents

一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌OsiLf-2 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌Streptomyces hydrogenans OsiLf‑2，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.11673。该菌体外能对至少5种不同生理小种的稻瘟病菌有很好的拮抗作用。其发酵液也具有较强的拮抗稻瘟病菌能力，而且抗菌活性很稳定。该菌或其发酵液在生物防治水稻稻瘟病、开发新型安全无毒的绿色农药等方面具有较大的应用潜力。

Description

一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌OsiLf-2
技术领域
本发明涉及植物内生放线菌与生物防治领域，具体涉及一株具有拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌的分离及抗性相关研究。
背景技术
水稻稻瘟病是指由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的一种水稻真菌病害。稻瘟病菌生存能力很强及传播广泛的特点，使其成为对水稻危害最为严重的病害之一。目前对稻瘟病的防治主要包括抗病品种选育和药剂防治。但是长期大量使用化学农药，污染环境，损害人类健康，还导致病原菌产生抗药性。稻瘟病菌的遗传背景复杂且易变异，使得水稻抗病品种难以跟上致病菌生理小种的变异速度，在3-5年后就丧失抗病性。而采用以农业可持续化发展为宗旨的生物防治方法，利用有益微生物及其代谢产物控制稻瘟病菌，相对来说更加安全高效。
内生菌是可以在其整个或部分生长周期中稳定定殖在植物内部的微生物菌群。与根际和土壤微生物相比，内生菌生长在植物内部而不会与土壤菌产生生存竞争。而且，内生菌在长期的协同进化过程中，与植物形成了互利互惠的关系。它可以直接抵抗病菌的侵染或通过促进寄主植物的生长或诱发免疫反应来间接提高植物抗病性。目前报到的用于稻瘟病生物防治的抗病性内生菌大多是易培养的细菌和真菌类群，较难分离的内生放线菌则报道较少。但放线菌作为抗生素的主要来源，其生防潜能更大。
发明内容
本发明提供了一株具有防治稻瘟病潜力的水稻内生放线菌OsiLf-2，该菌株分离自稻瘟病发病区的水稻叶部，已于2015年11月16日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo. 11673，分类命名为产水链霉菌Streptomyces hydrogenans，发明人将其命名为OsiLf-2，经检测存活。该菌16sRNA的Genbank登录号为KU350524。
本发明所得菌株生长能力较强，易于培养。在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上生长时，气生菌丝黄白色，呈放射状生长，分枝较多，不产生可溶性色素。扫描电镜观察发现其孢子呈连续棒状结构。该菌株在pH为6.0-12.0和温度为20℃-40℃环境中均可良好生长；能使淀粉水解，酪蛋白水解，明胶液化，能产生过氧化氢酶；能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、甘露醇、柳醇。
发明所得菌株能对至少5种不同生理小种的稻瘟病菌有较好拮抗作用，能明显抑制菌丝生长，其对稻瘟病菌生长抑制率最高达83%。
发明所得菌株发酵液有较好的抗稻瘟病菌活性，培养温度为35℃或培养基pH为7的发酵液抗稻瘟病菌活性较好。当其生长量达到最大时，其发酵液的抗稻瘟病菌能力也基本达到最强，其后随着培养时间的增加，抗性也能保持稳定。发酵液用蛋白酶K、低温、强光照和紫外处理一个小时仍然保持完整的活性； 100℃处理一个小时仍然保留了大部分的活性；强酸和强碱处理一个小时，也能保持较好的抗菌活性。
上述特征表明本发明提供的内生放线菌OsiLf-2，具有较强的抗真菌活性，且其抗菌成分药效持久、稳定，在生物防治水稻稻瘟病和开发新型、高效的农用新药物等方面具有较大的开发潜力。
附图说明
图1：本发明菌株OsiLf-2的菌落形态图（A）及扫描电子显微镜观察图（B）；
图2：本发明菌株OsiLf-2的系统进化树；
图3：本发明菌株OsiLf-2对5种不同生理小种稻瘟病菌的抑制情况，A- E.稻瘟病菌对照；F-J.OsiLf-2对5种不同生理小种的稻瘟病菌的抑制；
图4：稻瘟病菌RB3在扫描电子显微镜下，未经OsiLf-2处理（A）和经OsiLf-2处理的（B）菌丝体形态；
图5：本发明菌株OsiLf-2在不同培养条件下的生长量及抗稻瘟病菌活性（A.不同培养时间；B.不同培养基pH；C.不同培养温度）。
具体实施方式
实施例1：OsiLf-2菌株的分离、纯化和筛选
取湖南亚华种业科学研究院浏阳大围山基地易感籼稻品种，将发病不严重的叶片洗净，植物表面消毒，干燥后置于甘露醇大豆琼脂培养基（MS）上，置于27℃培养，待内生放线菌长出，再结合划线分离法在固体马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上获得其纯培养物。采用平板对峙法，将分离得到的菌株与稻瘟病菌同时接种到PDA固体平板上，放入霉菌培养箱中28℃倒置培养，每天观察，筛选出拮抗真菌效果最明显的菌株OsiLf-2，其对稻瘟病菌菌丝抑制率最高达83%，见附图3。
实施例2：OsiLf-2菌株的生物学鉴定
1．菌株形态特征
（1）菌落形态特征：将OsiLf-2单菌落划线接种至PDA固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱，28℃培养，3天以内长出无色基生菌丝和气生菌丝，菌落表面平滑、边缘呈褶皱。3天后长出黄白色白色孢子覆盖在菌落上。见附图1A。
（2）菌体形态特征：用插片法培养该菌，在电子显微镜下观察其气生菌丝及孢子情况，见附图1B。
2. OsiLf-2菌株16S rRNA分析
采用革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒（Shanghai Generay Biotech Co.,Ltd）的方法，抽提菌株基因组DNA，以该DNA为模板，采用放线菌16S rRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R），扩增出菌株的16S rRNA片段并测序，将得到的16S rRNA序列与Eztaxon的核酸数据库进行Blast同源性比对(http://www.ezbiocloud.net)，与数据库中已知放线菌Streptomyceshydrogenans的16S rRNA全长序列的相似性达到了100%，保守区序列的相似性达到100%，将该菌株鉴定为链霉菌属，命名为产水链霉菌Streptomyces hydrogenans OsiLf-2。使用软件MEGA5.0采用邻近结合法（neighbor-joining method）制作OsiLf-2的系统进化树，见附图2。
实施例3：OsiLf-2菌株对不同生理小种稻瘟病菌的抑制
采用平板对峙法，在直径为90mm的培养皿中心接种不同生理小种稻瘟病菌。其中RB3，61，62，SO7来自湖南亚华种子有限公司，Guy11来自湖南省农业科学院。刮取活化好的OsiLf-2在距离病原真菌30mm的位置上划一直线。28℃倒置培养7天以上，结果见附图3，OsiLf-2对稻瘟病菌RB3、61、62、Guy11、SO7的抑制率分别为74.1%、74.6%、82.9%、83.0%、80.6%。
实施例4：OsiLf-2菌株对稻瘟病菌RB3菌丝体的影响
取平板对峙实验中接近放线菌边缘和对照组中相对应位置的稻瘟病菌RB3菌块，经过戊二醛和锇酸固定后，洗脱干燥处理并喷金，置于扫描电子显微镜下观察菌丝体的形态变化，结果见附图4，可见经OsiLf-2处理后的稻瘟病菌RB3的菌丝体出现了明显的畸形和菌丝断裂。
实施例5：OsiLf-2菌株在不同培养条件下的生长情况及其发酵液抗稻瘟病活性
采用菌丝生长速率法测定菌株的生长情况。将OsiLf-2接种至酵母麦芽提取物液体培养基（ISP2）中，在28℃，150r/min震荡培养条件下培养10天，每天取出一定量的菌液，8000rpm离心10min取出上清液，菌体烘干至恒重并称重。上清液经0.22um无菌过滤膜过滤后按10%的比例加入PDA培养基中，混合均匀倒置平板并接种稻瘟病真菌，28℃倒置培养7天以上。
检测不同培养条件对菌株生长和发酵液的抗稻瘟病活性的影响，皆采用ISP2液体培养基，150r/min震荡培养。温度梯度选择20℃-40℃， pH=7；pH梯度选择pH=6-pH=12，28℃。其结果见附图5，可见本发明菌株OsiLf-2在不同的培养条件下均表现出一定的抗稻瘟病菌活性，且培养温度为35℃或培养基pH为7的时候发酵液抗稻瘟病菌活性较大。
实施例6：OsiLf-2菌株发酵液抗菌活力稳定性研究
将OsiLf-2接种至ISP2液体培养基中，在28℃，150r/min震荡培养条件下培养5天，菌液经8000rpm离心10min得到上清液，将上清液分别置于1）-20℃、37℃、70℃、100℃、121℃条件下分别处理1小时；2）pH=2、pH=14条件下处理1小时，3）分别用1mg/ml的蛋白酶K、8000 lx的强光照射、70uW/cm2的紫外照射处理1小时。将处理过后的上清液按实施例5的方法检测其稻瘟病活性。其结果见表1，可见经不同物理化学法处理后的OsiLf-2发酵液依然保持了较好的抗稻瘟病活性，具备良好的稳定性。
表1 本发明所述内生放线菌OsiLf-2的发酵液抗真菌物质的稳定性实验结果：
处理方式 菌丝生长抑制率 (%)
未处理 63
热处理
37℃，1h 62
50℃，1h 63
70℃，1h 61
100℃，1h 49
121℃，1h 20
低温处理
-20℃,1h 64
酶处理
蛋白酶 K 61
光处理
强光照,1h 63
紫外照射,1h 62
酸碱处理
pH=2 1h 58
pH=14 1h 30

Claims (3)

1.一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌，所述水稻内生放线菌为产水链霉菌（Streptomyces hydrogenans），保藏号为CGMCC No. 11673。
2.如权利要求1所述的水稻内生放线菌在防治水稻稻瘟病上的应用。
3.如权利要求1所述的水稻内生放线菌发酵液在防治水稻稻瘟病上的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058125B (zh) * 2017-03-21 2019-08-13 三峡大学 一株具有稻瘟病拮抗作用的黑曲霉及其应用
CN106834194B (zh) * 2017-03-28 2018-02-23 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法
CN108101625A (zh) * 2017-12-01 2018-06-01 芮志行 一种用于防治水稻稻瘟病的肥料的制备方法
CN110218671A (zh) * 2019-05-29 2019-09-10 江苏师范大学 一株产水链霉菌及其在生物防治中的应用
CN110140762A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 江苏师范大学 一种番茄生物保鲜剂、其制备方法及其使用方法
KR102350360B1 (ko) * 2019-10-31 2022-01-12 재단법인 경기도경제과학진흥원 스트렙토마이세스 하이드로제나스 배양액 추출물을 이용한 항염증용 조성물
CN111670769B (zh) * 2020-04-23 2022-05-06 湖南大学 一种提高水稻抗逆性的方法
CN114214231B (zh) * 2021-12-15 2023-07-07 湖南省微生物研究院 一株水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75及其应用
CN114752538B (zh) * 2022-05-25 2023-07-21 湖南大学 具有土壤改良功能的油茶内生放线菌及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974464B (zh) * 2010-10-18 2012-07-04 中国科学院南海海洋研究所 一种链霉菌及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺
CN104195064B (zh) * 2014-06-20 2016-09-28 湖南大学 一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌

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