CN117402792A - 一株具有免疫激活特性的蜡样芽孢杆菌及其诱导抗病的应用 - Google Patents

一株具有免疫激活特性的蜡样芽孢杆菌及其诱导抗病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有免疫激活特性的蜡样芽孢杆菌及其诱导抗病的应用。本发明涉及微生物领域，具体涉及一株具有免疫激活特性的蜡样芽孢杆菌及其诱导抗病的应用。本发明的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YK87，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27640。盆栽试验结果表明，菌株YK87发酵液的浸种、灌根处理对黄瓜角斑病防效分别为61.30％、60.25％；灌根处理对黄瓜白粉病防效为80.76％；灌根处理对黄瓜褪绿黄化病毒病(CCYV)防效为59.49％，具有显著的诱导抗病效果，可作为生防菌具有巨大的潜力。

Description

一株具有免疫激活特性的蜡样芽孢杆菌及其诱导抗病的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株具有免疫激活特性的蜡样芽孢杆菌及其诱导抗病的应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，可通过诱导植物产生抗病性来保护植物免受病原体侵害。近年来，越来越多的研究表明利用蜡样芽孢杆菌可以提高植物的抗性，并且有望成为一种新的、有效的植物防治技术。蜡样芽孢杆菌产生的一些细胞外物质，如胞外多糖、蛋白质和次生代谢产物等，可以诱导植物产生一系列的反应，从而增强植物的抗病性。这些反应包括激活植物的免疫系统、增强植物细胞壁的稳定性、促进植物生长发育等等。
基于以上背景，筛选具有生防潜力并且对植物病害表现出明显抗病效果的蜡样芽孢杆菌可以为植物病害的防治提供新型生防资源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何诱导植物抗病能力、抑制或防治植物的侵染性病害。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株蜡样芽孢杆菌。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCCNo.27640，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.27640。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有上述蜡样芽孢杆菌和/或所述蜡样芽孢杆菌的代谢物。
上述菌剂可为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌可为病原真菌或病原细菌：
所述病原真菌可为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)，灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，茄链格孢(Alternaria solani)，茄匍柄霉(Stemphylium solani)或辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)；
所述病原细菌可为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdalipv.lachryrnans)，西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)或茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
所述病害可为：1)黄瓜角斑病；2)黄瓜白粉病；3)瓜类褪绿黄化病毒病。
本发明还提供了前文所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将前文所述的蜡样芽孢杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
上述菌剂的活性成分可为上述蜡样芽孢杆菌和/或上述蜡样芽孢杆菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
上述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述代谢物可从所述蜡样芽孢杆菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述蜡样芽孢杆菌的无菌代谢物或所述蜡样芽孢杆菌的含菌代谢物。所述蜡样芽孢杆菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述蜡样芽孢杆菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述蜡样芽孢杆菌即得到所述蜡样芽孢杆菌的无菌代谢物。所述蜡样芽孢杆菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述蜡样芽孢杆菌，收集发酵液，该发酵液即为所述蜡样芽孢杆菌的含菌代谢物。
本发明还提供了一种生物有机肥，所述生物有机肥含有前文所述蜡样芽孢杆菌或所述蜡样芽孢杆菌的代谢物的菌剂。
本发明还提供了前文所述的蜡样芽孢杆菌在制备下述任一的产品中的应用：
1)用于防治植物病害的菌剂，所述病害为黄瓜角斑病、黄瓜白粉病或/和瓜类褪绿黄化病毒病；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)，立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，茄链格孢(Alternaria solani)，茄匍柄霉(Stemphylium solani)或辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)；
所述病原细菌为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdalipv.lachryrnans)，西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)，丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)或茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
本发明还提供了培养前文所述蜡样芽孢杆菌的方法，包括将所述蜡样芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
本发明还提供了前文所述蜡样芽孢杆菌或所述的菌剂在栽培黄瓜中的应用。
本发明还提供了栽培黄瓜的方法，包括下任一种方法：
1)向栽培黄瓜幼苗喷施前文所述蜡样芽孢杆菌或所述的菌剂；
2)采用前文所述蜡样芽孢杆菌或所述的菌剂中将栽培黄瓜种子进行浸种处理。
本发明还提供了前文所述的蜡样芽孢杆菌在防治黄瓜角斑病、黄瓜白粉病或/和瓜类褪绿黄化病毒病和/或提高黄瓜产量中的应用。
本发明从健康大田土壤分离筛选到一株蜡样芽孢杆菌YK87。菌株YK87在LB平板表现为菌落呈灰白色或黄白色，表面光滑洁净，有较强的黏附性。经Biolog测定和多基因系统发育分析，鉴定菌株为蜡样芽孢杆菌。盆栽试验结果表明，菌株YK87发酵液的浸种、灌根处理对黄瓜角斑病具有显著的诱导抗病效果，防效分别为61.30％、60.25％；菌株YK87发酵液的灌根处理对黄瓜白粉病具有显著的诱导抗病效果，防效为80.76％；菌株YK87发酵液灌根处理对黄瓜褪绿黄化病毒病(CCYV)具有显著的诱导抗病效果，防效为59.49％。
综上所述，菌株YK87是一株具有诱导植物抗病能力的潜在生防应用潜力的蜡样芽孢杆菌，这是首次系统全面的报道的从种子处理、灌根处理下，对黄瓜细菌、真菌、病毒多种病害均有明显诱抗效果的蜡样芽孢杆菌，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为菌株YK87 LB平板菌落照片(A)及扫描电镜形态图(B)。
图2为YK87的多基因系统发育树。
图3不同菌株浸种处理对黄瓜种子胚芽中不同激素途径的标志基因及相关植物抗病基因的相对表达分析。P＜0.01(**)表示具有极显著性差异；0<Log2<1：上调表达；Log2>1：显著上调表达。
图4为YK87对不同细菌、真菌病原菌的拮抗能力分析。CK为只培养真菌的菌饼。
图5为蜡样芽孢杆菌YK87浸种诱导处理对黄瓜角斑病的防治效果。其中A：YK87灌根处理；B：氟唑活化酯(FBT)灌根处理；C：对照处理。
图6为蜡样芽孢杆菌YK87灌根诱导处理对黄瓜角斑病的防治效果。其中A：YK87灌根处理；B：氟唑活化酯(FBT)灌根处理；C：对照处理。
图7为接种两周后蜡样芽孢杆菌YK87灌根诱导处理对黄瓜白粉病的防治效果。其中A：YK87灌根处理；B：氟唑活化酯灌根处理；C：对照处理。
图8为接种八周后蜡样芽孢杆菌YK87灌根诱导处理对黄瓜白粉病的防治效果。其中A：YK87灌根处理；B：氟唑活化酯灌根处理；C：对照处理。
图9为蜡样芽孢杆菌YK87灌根诱导处理对黄瓜褪绿黄化病毒(CCYV)病的防治效果。其中A：YK87灌根处理；B：氨基寡糖素灌根处理；C：对照处理。
图10为黄瓜病毒病的特异性引物扩增结果。其中1：CGMMV(黄瓜绿斑驳花叶病毒)；2：WMV(西瓜花叶病毒)；3：ZYM(小西葫芦黄花叶病毒)；4：MYSV(甜瓜黄斑病毒)；5：SqMV(南瓜花叶病毒)；6：CCYV(瓜类褪绿黄化病)；7：MNSV(甜瓜坏死斑点病毒)；8：PNRS(李属坏死环斑病毒)；M：5000bp的Maker。
保藏说明
菌种名称：蜡样芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus cereus
菌株编号：YK87
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2023年6月15日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.27640。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的病原真菌具体可为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，茄链格孢(Alternaria solani)，茄匍柄霉(Stemphyliumsolani)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)；病原细菌可为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdali pv.lachryrnans)，西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)，丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)，茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)。
下述实施例中的西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)已记载于：赵彦杰,李宝聚,石延霞等.瓜类蔓枯病的发生与防治[J].中国蔬菜,2008(02):56-57+70。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已记载于：李磊,陈利达,黄艺烁,谢学文,石延霞,柴阿丽,李宝聚.马铃薯黑痣病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用.农业生物技术学报,2021,29(07):1417-1425。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的茄链格孢(Alternaria solani)，已记载于：郭润婷,石延霞,赵倩等.莴笋链格孢叶斑病病原鉴定[J].植物病理学报,2018,48(03):418-422。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的茄匍柄霉(Stemphylium solani)已记载于：谢学文,陈利达,曹金强,韩道杰,石延霞,柴阿丽,李磊,李宝聚.茄匍柄霉菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.植物病理报,2021,51(04):618-625.DOI:10.13926/j.cnki.apps.000717。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)已记载于：江厚春,吕国华,石延霞等.用选择性培养基检测辣椒种子疫霉菌[J].中国蔬菜,2011(06):58-61。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的扁桃假单胞流泪致病变种Pal-nm002(Pseudomonas amygdalipv.lachryrnans)已记载于：苑宝洁,李磊,张红杰,石延霞,柴阿丽,谢学文,李宝聚.黄瓜细菌性角斑病拮抗细菌的筛选及其防治效果.中国生物防治学报,2022,38(02):421-427.DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2021.06.016。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已记载于：柴阿丽,帕提古丽,郭威涛,石延霞,谢学文,席先梅,李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报,2019,46(01):182-192。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的西瓜嗜酸菌(Acidororax citrulli)已在文献“田惠、谢学文、李焕玲、魏松红、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(七十)砧木南瓜种传细菌性果斑病的发生及防治.中国蔬菜2014,(05):65-66.”中公开,公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得,以重复本申请。不可作为其它用途使用。
下述实施例中的茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)已在文献“康华军,柴阿丽,石延霞谢学文,袁军海,李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痴病菌的四重PCR检测方法.园艺学报2018,45(11):2254-2264.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的对照菌株FZB42已记载于：朱碧春，解淀粉芽胞杆菌FZB42诱导的籼稻9311抗病相关信号通路的研究，2017，南京农业大学.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的氟唑活化酯已记载于：张晓慧,谢学文,李宝聚等.5％氟唑活化酯乳油对西瓜甜瓜白粉病的诱导抗病效果评价[J].果树学报,2018,35(01):101-107.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请。不可作为其它用途使用。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
实施例1、高效诱抗菌株的分离、筛选
从陕西大荔县的大田根际土壤中分离到138株细菌株。分离方法如下：
1、菌株分离保藏
称取大田根际土壤10g，溶于90mL无菌水中，28℃恒温摇床振荡处理30min，使其充分混匀。将混匀的土样按照10-1至10-5进行梯度稀释，分别吸取100μL稀释浓度为10-3、10-4、10-5的悬浮液涂布NA平板(蛋白胨10.0，牛肉粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼酯粉15.0g/L，溶质为水，pH值7.2±0.2)，每浓度涂3个平板，28℃恒温培养24h后，挑取不同形态的单菌落于无菌NA平板上划线纯化，至长出形态相同的单菌落。单菌落纯化后甘油管保藏备用。
2、黄瓜种子催芽诱导
摇瓶培养步骤1中获得的不同单菌落，培养至浓度为1×108CFU/mL，得到各菌的菌悬液(包括菌体和发酵上清液)。将其稀释100倍后，加入10mL到含有滤纸片的培养皿内，放入30粒黄瓜种子，置于培养箱内，28℃，催芽36h，统计出芽率。出芽率计算公式为：出芽率＝(出芽黄瓜种子数/总的黄瓜种子数)×100％。
3、黄瓜种子播种
处理组：将浸种处理后出芽的黄瓜种子种植于128孔育苗钵内于温室内培养，待黄瓜幼苗长至1片真叶时，准备接种病原菌扁桃假单胞流泪致病变种Psl-nm002菌株。
健康对照为：使用无菌水进行浸种但不接病原菌处理；清水对照为：使用无菌水进行浸种，且接种病原菌。其他培养条件同处理组。
4、病原菌菌悬液的制备
待播种后的黄瓜苗长至1片真叶时，从-80℃冰箱取出保存的供试扁桃假单胞流泪致病变种Pal-nm002。取出在冰浴中融化，28℃活化于LB平板，转接于LB液体培养基进行200r·min-1。菌悬液浓度约为106cfu/mL，备用。
5、病原菌接种
将培养好的浓度为106cfu/mL的菌株Pal-nm002菌悬液，用微量喷雾器接种1片真叶期黄瓜。分别放置于保湿柜中，保持温度20℃左右，相对湿度90％ RH，待黄瓜植株发病，观察发生室内健康对照是否发病记录病情指数。
6、病害调查
接种病原菌后每天进行观察，记录发病情况，确定发病级别。叶片发病严重程度分级标准：每株调查两片子叶，以每张叶片病斑面积占整个叶片面积的百分率进行分级。
病情分级标准：
0级：无病斑；
1级：病斑占叶面积的5％以下；
3级：病斑占叶面积的6％～25％；
5级：病斑占叶面积的26％～50％；
7级：病斑占叶面积的51％～75％；
9级：病斑占叶面积的75％以上。
数据处理：采用Excel 2010计算各菌株处理的黄瓜叶片的病情指数。
病害指数＝[∑(各等级的病叶数×相对等级的代表值)/(总叶数×最高等级的代表值)]×100。
防效(％)＝((对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数)×100。
7、试验结果
(1)活体筛选
通过浸种处理黄瓜种子的方式，从138株菌株中筛选到对黄瓜角斑病具有明显防效的12株候选菌株。具体菌株信息见表1。由表1可知，编号为YK87的菌株对黄瓜角斑病的防效最高，达到67.0％。
表1、12株生防细菌对黄瓜角斑病的防效测定
注：数据为平均值。
实施例2、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YK87的鉴定及保藏
1、菌株YK87的形态学观察
将上述实施例1中筛选的防效最高的菌株YK87在LB平板上培养36小时后，观察菌落形态。结果如图1中A和B所示，菌落形态呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，表面呈毛玻璃状，直径约5-7mm，有较强的黏附性。通过扫描电镜观察菌株YK87呈杆状，长约2-3mm，宽1-1.5mm，周身有鞭毛。
2、菌株YK87的生理生化测定
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》的方法，对菌株YK87进行革兰氏染色、生长温度试验、耐盐性试验、游动性试验、接触酶试验、V-P试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验等生理生化试验。
检测结果如表2所示。结果表明，菌株YK87为革兰氏阴性菌，适宜pH 5-6，适宜NaCl含量为1％，有游动性。接触酶、V-P和明胶液化反应为阳性，柠檬酸盐利用、淀粉水解和硝酸盐还原反应为阴性。
表2、菌株YK87生理生化反应
注：+表示该实验结果为阳性；-表示该实验结果为阴性。
3、Biolog测定
挑取菌株YK87单菌落接种至LB培养基试管斜面上，28℃培养24h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENIII试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株YK87进行唯一碳源利用测定。
结果如表3所示：菌株YK87可以利用蔗糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、α-D-葡萄糖、L-海藻糖等，不能利用龙胆二糖、L-鼠李糖、D-甘露糖等。
表3、利用BIOLOG GENIII试剂条测定菌株YK87的唯一碳源利用
生理生化指标(BIOLOG) 结果 生理生化指标(BIOLOG) 结果
葡聚糖 W α-D-葡萄糖 +
D-麦芽糖 + D-甘露糖 -
D-海藻糖 + D-果糖 -
D-纤维二糖 W D-半乳糖 W
龙胆二糖 - 3-Methyl葡萄糖 +
蔗糖 + D-海藻糖 +
D-松二糖 W L-海藻糖 +
水苏糖 - L-鼠李糖 -
D-蜜三糖 - D-丝氨酸 +
α-D-乳糖 - 丙三醇 +
4、多基因系统发育树构建
用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，天根生化科技(北京)有限公司生化科技(北京)有限公司生化科技(北京)有限公司)提取菌株YK87的基因组DNA后，分别利用细菌16SrDNA基因、gyrA、gyrB和rpoD基因对其序列进行PCR扩增，各基因扩增的引物序列信息见表4。PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。所得PCR扩增产物送博迈德生物公司进行序列测定。用MEGA6.0比对后采用最大似然法构建系统发育树(图2)，明确菌株YK87的分类地位，分析其遗传关系。
表4、多基因鉴定所需引物序列及产物信息
菌株YK87具有核苷酸序列是序列表中序列1的16S rDNA，具有核苷酸序列是序列表中序列2的gyrA基因、具有核苷酸序列是序列表中序列3的gyrB基因和具有核苷酸序列是序列表中序列4的rpoD基因。基于16S rDNA基因、gyrA、gyrB和rpoD基因构建菌株YK87的多基因系统发育树将其鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
5、菌株YK87的保藏
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YK87，已于2023年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.27640。以下简称蜡样芽孢杆菌CGMCC No.27640或菌株YK87。
实施例3、YK87浸种处理对黄瓜种子中植物抗病相关基因表达量分析
1、菌株YK87生防菌剂的制备及浸种处理黄瓜种子：
将-80℃保藏的菌株YK87采用划线法在LB平板上活化，28℃培养1d后，挑取单菌落转接摇菌管内，28℃，180rpm，培养24h后，获得YK87菌剂(包括菌体和发酵液)，浓度为1×108CFU/mL。
黄瓜种子用2％的NaClO溶液浸泡消毒10min后，用无菌水冲洗干净，晾干备用。使用OD值1.0的YK87菌剂稀释100倍后，采用实例1中的浸种处理方式催芽黄瓜种子24小时，每组重复3次。
2、植物RNA提取
将步骤1中处理的黄瓜种子用于RNA提取。用液氮将植物组织迅速冷冻，并尽快研磨。研磨后的样品通过植物RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司生化科技(北京)有限公司，DP419)进行RNA提取。将提取到的RNA使用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)反转录得到cDNA。
其中基因组DNA去除体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，Total RNA 2μL，RNase Free dH2O 5μL，42℃2min。
反转录体系为：基因组DNA去除体系反应后的反应液10μL，5×PrimeScriptBuffer2(for Real Time)4μL，PrimeScriptRT Mix I 1μL，RT Primer Mix 4 1μL，Rnase FreedH2O 4μL。反应条件为37℃15min，85℃5s。反转录结束后对样品进行稀释，使其达到100ng/μL，用于qPCR。
3、RT-qPCR的对黄瓜相关防御基因的转录分析
通过荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)对基因表达情况进行测定。所用引物见表5，qPCR在96-well Fast Thermal Cycling plate中进行扩增，总反应体系为20μL：SYBRPremix EX TaqTM(2x)10μL，上游引物(20μM)0.4μL，下游引物(20μM)0.4μL，ROX ReferenceDye II(50×)0.4μL，cDNA 2.0μL，H2O 6.8μL。
表5、植物防御基因分析的RT-qPCR引物序列信息
反应条件如下：1)95℃30s，95℃10s，60℃34s；2)95℃15s，60℃60s，95℃15s 40个循环；72℃，10min后，4℃保存。每个样品设置3个重复，以无菌水代替模板DNA作为阴性对照，实时监测并录荧光信号的变化。以内参基因ACT作为标准，进行目的基因相对定量，计算采用2-ΔΔCt法：相对表达量＝2-ΔΔCt＝2-{[CtE-CtF]-[CtA-CtB]}。其中，CtA为处理前待测基因Ct值；CtB为处理前参照基因Ct值；CtE为处理后待测基因Ct值；CtF为处理后参照基因Ct值。
结果如图3所示，以植物免疫中的水杨酸、茉莉酸/乙烯激素途径的关键合成基因为靶标，验证了菌株YK87的浸种处理可激活茉莉酸(AOS)/乙烯(EIN2)途径标志基因的显著上调表达以及诱导植物抗病相关的病程蛋白基因(PR1)显著上调的表达，且本结果中的对照菌株FZB42与已报道的文献(朱碧春，解淀粉芽胞杆菌FZB42诱导的籼稻9311抗病相关信号通路的研究，2017，南京农业大学)结果相一致，表明菌株YK87种子浸种诱导处理可激活植物免疫系统，以增强抗病性。
实施例4、蜡样芽胞杆菌YK87对常见9种病原细菌及真菌的拮抗能力分析
采用滤纸片法培养法测定蜡样芽孢杆菌YK87对4株病原细菌以及6株病原真菌进行拮抗能力分析。
选取植物病原菌为病原真菌或病原细菌，病原真菌具体可为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，茄链格孢(Alternariasolani)，茄匍柄霉(Stemphylium solani)和辣椒疫霉菌(Phytophthora capsiciLeonian)；病原细菌可为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdalipv.lachryrnans)，西瓜嗜酸菌(Acidororax citrulli)，丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)和茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
拮抗能力分析具体方法如下：
细菌拮抗能力分析：将培养48小时的上述不同病原细菌发酵液稀释至108CFU/mL，取100μL在NA平板上涂布后晾干。平板中间贴滤纸片，取5μL蜡样芽胞杆菌YK87菌剂(包括菌体和发酵液，菌体浓度为：1×108CFU/mL)，加入到滤纸片上，置于28摄氏度培养箱中培养48小时，测定抑菌圈直径。每个处理重复3次。抑菌率(％)＝抑菌直径/对照菌落直径×100。
真菌拮抗能力分析：在实验组PDA平板中央接种直径8mm的真菌菌饼，28℃培养24h后，采用十字交叉法在距平板中央3cm处相对的4点分别滴加5μL蜡样芽胞杆菌YK87(含量为1×108cfu·mL-1)的菌剂培养液，以只培养真菌的菌饼为对照组(CK)，28℃培养5d，每个处理重复3次，每次重复3个平板。
结果如图4所示：YK87对9种常见植物细菌及真菌病原菌均不具有明显拮抗效果，从侧面佐证了以黄瓜角斑病(病原细菌可为扁桃假单胞流泪致病变种)为靶标筛选的菌株YK87在盆栽生测下的防效机制为诱导植物系统抗性。
实施例5、菌株YK87诱导处理方法对黄瓜角斑病的防效测定
1、菌株YK87浸种诱导处理方法对黄瓜角斑病的防效测定
1)挑取蜡样芽孢杆菌YK87单菌落接种于LB培养基中，28℃下振荡培养，获得蜡样芽孢杆菌YK87菌剂，浓度为1×108cfu·mL-1。
2)挑取黄瓜角斑病病菌(Pseudomonas amygdali pv.lachryrnans)单菌落接种于NB培养基(蛋白胨10.0，牛肉粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，溶质为水，pH值7.2±0.2，25℃)中，28℃下振荡培养至浓度为1×108cfu·mL-1备用。
3)参照实施例1的处理方法处理种子，种子播种后在两叶一心期对黄瓜接种1×106CFU/mL的菌株扁桃假单胞流泪致病变种Pal-nm002菌剂(包括菌体和发酵液)，放置于保湿柜中，保持温度26℃左右，待黄瓜植株发病，相对湿度90％ RH，观察室内健康对照是否发病，记录病情指数。以氟唑活化酯(FBT)为药剂对照，以无菌水浸种处理为阴性对照。参照实施例1的处理方法处理种子。病情分级标准如下，本实验重复3次生测结果。
病情分级标准：
0级：无病斑；
1级：病斑占叶面积的5％以下；
3级：病斑占叶面积的6％～25％；
5级：病斑占叶面积的26％～50％；
7级：病斑占叶面积的51％～75％；
9级：病斑占叶面积的75％以上。
数据处理：采用Excel 2010计算各菌株处理的黄瓜叶片的病情指数。
病情指数＝[∑(各等级的病叶数×相对等级的代表值)/(总叶数×最高等级的代表值)]×100。
防效(％)＝((对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数)×100。
结果显示(表6和图5中A-C)：采用YK87菌剂浸种方式进行诱导处理的黄瓜对角斑病的防效高达60.41％，高于对照药剂氟唑活化酯的防效(49.73％)。
表6、蜡样芽孢杆菌对黄瓜角斑病的防治效果
处理 病情指数 相对防效/％
黄瓜角斑病菌+YK87 27.21±1.13a 60.41±0.38b
黄瓜角斑病菌+氟唑活化酯 34.55±2.61b 49.73±0.78a
黄瓜角斑病菌 68.73±6.26c -
2、菌株YK87灌根诱导处理方法对黄瓜角斑病的防效测定
1)挑取蜡样芽孢杆菌YK87单菌落接种于LB培养基中，28℃下振荡培养，获得蜡样芽孢杆菌YK87菌剂，浓度为1×108cfu·mL-1。
2)挑取黄瓜角斑病病菌(Pseudomonas amygdali pv.lachryrnans)单菌落接种于NB培养基中，28℃下振荡培养至浓度为1×108cfu·mL-1备用。
3)接种：在一片真叶期时，使用浓度为1×108cfu/mL的菌株YK87发酵液，稀释100倍后进行灌根诱导，每棵黄瓜苗灌根50mL，每五天诱导1次，共诱导3次。使用氟唑活化酯(FBT)为对照药剂，以喷施清水为阴性对照。在第3次诱导完成3天后，采用喷雾法接种浓度为1×106cfu/mL扁桃假单胞流泪致病变种Pal-nm002菌液，接种后保湿观察。
4)调查：待黄瓜出现明显的角斑病症状后，调查各处理的病情指数(调查方法参考实例2)，并计算防效。
结果显示(表7和图6中A-C)：采用YK87灌根的方式进行诱导处理的黄瓜对角斑病的防效高达61.97％，高于对照药剂氟唑活化酯的防效(42.18％)。
表7、蜡样芽孢杆菌对黄瓜角斑病的防治效果
处理 病情指数 相对防效/％
黄瓜角斑病菌+YK87 21.26±1.73a 61.97
黄瓜角斑病菌+氟唑活化酯 30.92±3.42b 42.18
黄瓜角斑病菌 54.47±1.31c -
实施例6、YK87灌根诱导处理方法对黄瓜白粉病的防效测定
1、挑取蜡样芽孢杆菌YK87单菌落接种于LB培养基中，28℃下振荡培养，获得蜡样芽孢杆菌YK87菌剂，浓度为1×108cfu·mL-1。
2、选择山东寿光蔬菜种植地区的上一茬严重发生白粉病的地块进行试验。
3、接种：在一片真叶期时，使用浓度为1×108cfu/mL的YK87菌剂，稀释100倍后进行灌根诱导，每棵黄瓜苗灌根50mL，每五天诱导1次，共诱导3次。使用浓度为20mg/L的氟唑活化酯(FBT)为对照药剂，以喷施清水为阴性对照。
4、调查：第3次诱导完成后，待黄瓜自然感染白粉病后，调查各处理的病情指数(调查方法参考实例2)，并计算防效。本实验共进行两次调查。分别在接种完成后的第2周以及第8周。
结果显示：采用YK87灌根的方式进行诱导处理的黄瓜，在诱导处理两周后发生白粉病，第一次的调查结果显示YK87灌根处理对白粉病的防效高达80.76％，高于对照药剂氟唑活化酯的防效(51.92％)(表8和图7中A-C)；随后在接种后的第8周，结果期的黄瓜再次发生白粉病，第二次的调查结果显示YK87灌根处理对白粉病的防效依然可达58.87％，高于对照药剂氟唑活化酯的防效(25.58％)(表9和图8中A-C)，说明微生物诱导的持效期远高于化学药剂处理。
表8、接种2周后蜡样芽孢杆菌YK87对黄瓜白粉病的防治效果
处理 病情指数 相对防效/％
黄瓜白粉病菌+YK87 8.82±1.73a 80.76
黄瓜白粉病菌+氟唑活化酯 22.05±4.58b 51.92
黄瓜白粉病菌 45.86±2.63c -
表9、接种8周后蜡样芽孢杆菌对黄瓜白粉病的防治效果
处理 病情指数 相对防效/％
黄瓜白粉病菌+YK87 17.59±2.33a 58.87
黄瓜白粉病菌+氟唑活化酯 28.15±1.31b 25.58
黄瓜白粉病菌 37.82±2.63c -
实施例7、YK87灌根诱导处理方法对黄瓜病毒病(瓜类褪绿黄化病毒)的防效测定
1、挑取蜡样芽孢杆菌YK87单菌落接种于LB培养基中，28℃下振荡培养，获得蜡样芽孢杆菌YK87菌剂，浓度为1×108cfu/mL。
2、选择寿光地区(北纬36.8°，东经118.8°)上一茬严重发生的瓜类褪绿黄化病毒病的地块进行试验。
3、接种：在一片真叶期时进行灌根诱导，在一片真叶期时，使用浓度为1×108cfu·mL-1的菌株YK87发酵液，稀释100倍后进行灌根诱导，每棵黄瓜苗灌根50mL，每五天诱导1次，共诱导3次。使用氨基寡糖素2000倍稀释液为对照药剂。以清水灌根为阴性对照。
4、调查：第3次诱导完成后，待黄瓜自然条件下感染该病毒后，调查各处理的病情指数，并计算防效。分级标准如下：
0级：无症状；
1级：植株叶片出现轻微花叶，叶片不变形，病株不矮化；
3级：植株越三分之一的叶片部分花叶，少数叶片轻微变形；
5级：植株二分之一叶片花叶，部分叶片变形；或病株矮化为正常的三分之二至四分之三；
7级：植株大部分叶片严重花叶、变形，主侧脉坏死，病株矮化为正常的二分之一至三分之二；
9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，植株死亡。
数据处理：采用Excel 2010计算各菌株处理的黄瓜的病情指数。
病害指数＝[∑(各等级的病株数×相对等级的代表值)/(总株数×最高等级的代表值)]×100。
防效(％)＝((对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数)×100。
5、鉴定：采用实例3中步骤2的试验方法进行植物病毒RNA的提取，通过反转录试剂盒(FP313-01，天根生化科技(北京)有限公司)将RNA反转录为cDNA后，使用瓜类病毒的特异性引物进行病毒鉴定。相关引物信息如表10所示。
表10、常见瓜类病毒相关特异性引物序列信息
结果如表11和图9中A-C所示：采用菌株YK87灌根的方式进行诱导处理的黄瓜，在诱导处理4周后黄瓜感染病毒病，YK87灌根处理对病毒病的防效高达59.49％，高于对照药氨基寡糖素的防效(52.90％)。
表11、蜡样芽孢杆菌对黄瓜病毒病的防治效果
处理 病情指数 相对防效/％
黄瓜病毒病+YK87 15.70±2.39b 59.49
黄瓜病毒病+氨基寡糖素 18.25±1.93b 52.90
黄瓜病毒病 38.76±4.78a -
经不同瓜类病毒病的的特异性引物鉴定后，结果如图10所示，确定本实验的小区黄瓜苗感染的病毒病为瓜类褪绿黄化病毒，与该区域上一茬口发生的为同一类病毒病。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.蜡样芽孢杆菌，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.27640，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27640。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌和/或所述蜡样芽孢杆菌的代谢物；
所述菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌具体为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)，立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，茄链格孢(Alternaria solani)，茄匍柄霉(Stemphylium solani)或辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)；所述病原细菌为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdali pv.lachryrnans)，西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)，丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)或茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)。
所述病害为：1)黄瓜角斑病；2)黄瓜白粉病；3)瓜类褪绿黄化病毒病。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
4.生物有机肥，其特征在于：所述生物有机肥含有权利要求1所述蜡样芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂。
5.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在制备下述任一产品中的应用：
1)用于防治植物病害的菌剂，所述病害为黄瓜角斑病、黄瓜白粉病或/和瓜类褪绿黄化病毒病；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌具体为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)，立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，茄链格孢(Alternaria solani)，茄匍柄霉(Stemphylium solani)或辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)；所述病原细菌为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdali pv.lachryrnans)，西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)，丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)或茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)。
6.培养权利要求1所述蜡样芽孢杆菌的方法，包括将所述蜡样芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
7.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在栽培黄瓜中的应用。
8.栽培黄瓜的方法，包括如下任一种方法：
1)向栽培黄瓜幼苗喷施权利要求1所述蜡样芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂；
2)采用权利要求1所述蜡样芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂中将栽培黄瓜种子进行浸种处理。
9.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在防治黄瓜角斑病、黄瓜白粉病或/和瓜类褪绿黄化病毒病和/或提高黄瓜产量中的应用。
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