CN110551649B - 一株拮抗植物乳杆菌及其在防治草莓灰霉病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌CM‑3及其在防治草莓灰霉病中的应用，保藏号为CGMCC No.17920。该菌株是从健康草莓果实发酵液中分离筛选得，经确定菌株属于植物乳杆菌，实验证明其对引起灰霉病的灰葡萄孢霉具有显著抑制效果，同时在实体实验方面，亦体现出良好的生防能力。有利于为草莓灰霉病的绿色防控生产提供高效拮抗微生物菌种及应用技术，从而全面提高草莓品质。

Description

一株拮抗植物乳杆菌及其在防治草莓灰霉病中的应用
技术领域
本发明公开了一种草莓采后病害生物防治技术，具体涉及一种植物乳杆菌及其在防治草莓灰霉病中的应用。
背景技术
草莓(Fragaria ananassa Duchesne)属于蔷薇科，草莓属，以其色、香、味俱佳的优势被誉为“水果皇后”，是世界性水果之一。草莓果肉多汁，营养价值高，生长周期短，见效快，经济效益高，正成为我国果树业和设施农业中发展最快的新兴产业，种植面积逐年增加。但草莓作为一种无坚硬外果皮的浆果，果肉组织柔嫩且无抗震能力，在采摘和采后的运输贮藏过程中极易受机械损伤而遭受病原菌侵害引起腐烂变质。
灰霉病是草莓开花后危害最严重的一种真菌性病害，该病害由灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)侵染引起，主要危害果实、果梗、花萼、叶片和叶梗，在草莓生产中严重降低了果实的产量和品质。目前生产上防治果蔬灰霉病仍以化学防治为主，虽然防治效果比较显著，但是长期大量使用化学农药造成了病原菌产生抗药性、农药残留及环境污染等系列问题。生物防治以其环境友好，成本低、无污染等特点被人们所重视，因此筛选和利用拮抗微生物生物防治草莓灰霉病成为研究的热点。
发明内容
发明目的：本发明提供一种植物乳杆菌及其在防治草莓灰霉病中的应用，该菌株是从健康草莓果实发酵液中分离筛选得，经确定菌株属于植物乳杆菌，实验证明其对引起灰霉病的灰葡萄孢霉具有显著抑制效果，同时在实体实验方面，亦体现出良好的生防能力。以期为草莓灰霉病的绿色防控生产提供高效拮抗微生物菌种及应用技术，从而全面提高草莓品质。
技术方案：本发明所述的一种植物乳杆菌及其在防治草莓灰霉病中的应用。本发明所述植物乳杆菌CM-3，经鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年6月12日，保藏编号为CGMCC No.17920；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
所述植物乳杆菌CM-3的分离，将草莓果实清洁表面后，用消毒溶液浸泡，最后用无菌水淋洗2-5次，用无菌滤纸吸干水分；将果实充分研磨成浆，取果浆加入到MRS液体培养基中，富集培养后取其发酵液，以无菌生理盐水稀释，将稀释液涂布于MRS琼脂培养基上，培养后进行菌株分离所得。
所述植物乳杆菌CM-3的分离，草莓果实清洁表面是使用的70％乙醇。
所述植物乳杆菌CM-3的分离，消毒溶液为2％次氯酸钠。
菌悬液，包含所述的植物乳杆菌CM-3。
所述植物乳杆菌CM-3或所述的菌悬液在防治草莓灰霉病中的应用。
有益效果：本发明从健康草莓果实发酵液中分离筛选得到一株对引起灰霉病的灰葡萄孢霉具有显著抑制效果，同时对草莓灰霉病展现出了显著的防治效果，同时具有环境友好，成本低、无污染等优势。
附图说明
图1是菌株16S rDNA基因扩增电泳和系统发育树；
图2是植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉的拮抗作用(左为空白对照；右为植物乳杆菌CM-3处理)；
图3是植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉菌丝生长的影响(左为空白对照；右为植物乳杆菌CM-3处理)；
图4是植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉菌丝形态的影响(400×)(左为空白对照；右为植物乳杆菌CM-3处理)；
图5是植物乳杆菌CM-3对草莓灰霉病发病率的影响；
图6是植物乳杆菌CM-3对草莓灰霉病病斑直径的影响；
图7是植物乳杆菌CM-3对草莓灰霉病的防治效果(A为空白对照；B为植物乳杆菌CM-3处理)。
具体实施方式
实施例1
乳酸菌的分离
将草莓果实用70％乙醇清洁表面后，用2％次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水淋洗3次，用无菌滤纸吸干水分。将果实充分研磨成浆，取10mL果浆到90mL MRS液体培养基中，富集培养24h后取其发酵液，以无菌生理盐水按10倍稀释法稀释，将各级稀释液分别涂布于MRS琼脂培养基上，在37℃培养24h后进行菌株分离。
根据生长出的菌落形状、颜色、大小、边缘、突起、透明度等特征，挑取单菌落划线纯化培养。
菌悬液的制备
将MRS固体斜面活化好的乳酸菌菌种接种于液体MRS培养基中，置于37℃，培养24h。传代培养2次后以4％接种量(v/v)接种于MRS液体培养基中，置于37℃，培养24h。冷冻离心获得菌体(8000rpm,15min,4℃)，用无菌生理盐水洗涤两次后用相同体积的生理盐水重悬菌体备用。
乳酸菌的筛选
用直径为8mm的打孔器将在25℃培养14d的灰葡萄孢霉菌落边缘打取菌饼，放置在PDA固体平板的中心，在距菌饼25mm的四周放置4片直径为6mm的滤纸片，分别在滤纸片上接种20μL菌悬液，以等体积的无菌生理盐水为对照。25℃恒温培养7d观察灰葡萄孢霉的生长情况。
乳酸菌的鉴定
(1)DNA提取：
细菌基因组DNA提取试剂盒由北京TIANGEN公司提供。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃冰箱保存备用。
(2)16S rDNA扩增：
16S rDNA扩增采用细菌通用引物，其上游引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，下游引物1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’)。
PCR反应体系(50μL)：2μL DNA模板，4μL dNTP(2.5mM)，引物(10mM)各1.5μL，5μL10×Buffer，0.2μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，ddH2O 35.8μL。
PCR扩增条件为：首先94℃预变性4min；然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
序列相似性和系统发育分析
登陆NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，将所得序列与GenBank核酸序列数据库中已知序列进行比较，相似度在98％以上的可以认为是同一种。将序列提交到GenBank核酸序列数据库获得登录号。用MEGA5.05软件进行比对分析和系统发育分析。
植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉菌丝生长量的影响
在50mL液体PDA培养中加入4块8mm灰葡萄孢霉菌块，分别加入3mL无菌生理盐水和植物乳杆菌CM-3菌悬液，在22℃、100rpm条件下，培养72h。同时用纱布过滤收集菌丝，烘干后称量菌丝重量。
植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉菌丝形态的影响
挑取不同处理培养的灰葡萄孢霉菌丝在光学显微镜下进行菌丝形态观察。
植物乳杆菌CM-3对草莓灰霉病发病率和病斑直径的影响
挑选外观无机械伤且成熟度一致的草莓果实用70％酒精溶液进行表面消毒，待自然晾干后，用灭菌针在果实赤道部位刺一个深度3mm直径3mm的伤口。处理组在伤口处加30μL植物乳杆菌CM-3菌悬液，对照组加等量体积的无菌生理盐水。2h后在伤口处分别再加入15μL的灰葡萄孢霉孢子悬液(5×104spore/mL)，待菌液吸收后，置于20±1℃，85-90％RH的环境中贮藏6d，统计发病率和病斑直径。
实施例2
菌种的鉴定
将对灰葡萄孢霉具有显著抑制活性的菌株CM-3的16S rDNA序列与NCBI数据库的序列作比对，进行同源性分析，结果见图1。由图1可知，菌株CM-3与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)同源性最高，相似度为100％。因此，可以初步确定菌株CM-3属于植物乳杆菌。将菌株CM-3的16S rDNA序列提交到GenBank核酸序列数据库获得登陆号为MG948567。于2019年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17920。
植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉的拮抗效果
由图2所示，对照组菌丝生长旺盛、菌丝浓密，铺满培养皿；接有植物乳杆菌CM-3菌悬液的培养皿上，菌丝未铺满，长势较弱。说明了植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉的拮抗效果明显。
植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉菌丝生长量的影响
从图3可以看出，对照组的菌丝生长旺盛，肉眼可见菌丝大量生长，产孢量较高，颜色较深，而加入植物乳杆菌CM-3菌悬液的处理组中草莓灰霉病菌基本没有生长，肉眼仅见少量菌丝。经烘干后，对照组的菌丝重量为2.8685g，处理组的菌丝重量仅为0.0562g，显著低于对照组，说明植物乳杆菌CM-3能够显著抑制灰葡萄孢霉菌丝的生长。植物乳杆菌CM-3对灰葡萄孢霉菌丝形态的影响
由图4所示，空白对照的灰葡萄孢霉菌丝细长且粗细均匀，表面光滑，分支少，间节长；而与植物乳杆菌CM-3共同培养的灰葡萄孢霉菌丝呈现明显的形态异常：菌丝变得非常短、非常细。
植物乳杆菌CM-3对草莓灰霉病发病率和病斑直径的影响
由图5和图6所示，在整个贮藏期内，植物乳杆菌CM-3菌悬液的处理组的发病率和病斑直径均显著低于对照组(P<0.05)。第6天，对照组的发病率比处理组高了48.23％，病斑直径比对照组高了40.88％。植物乳杆菌CM-3菌悬液处理组在整个贮藏期内对果实灰霉病都展现出良好的控制效果。同时结合图7可以看出，植物乳杆菌CM-3对草莓灰霉病具有显著的防治效果。

Claims (3)

1.一种防治草莓灰霉病的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CM-3，保藏号为CGMCC No.17920。
2.一种菌悬液，其特征在于包含权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CM-3。
3.如权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CM-3或权利要求2所述的菌悬液在防治草莓灰霉病中的应用。
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