CN114958624B - 一种黄孢原毛平革菌jx1及其筛选方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种黄孢原毛平革菌JX1及其筛选方法、应用。本发明所提供的黄孢原毛平革菌为Phanerochaete chrysosporium JX1，于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022081。本发明是从大蒜鳞芽中筛选到的黄孢原毛平革菌JX1，对大蒜根腐病原菌具有很强的抑制效果；相比传统的化学农药防治大蒜根腐病，基于黄孢原毛平革菌JX1开发的生物防治法更加绿色、环保，有助于降低生产成本，提高产品质量；能够产生良好的经济效益和生态效益，为下一步进行菌肥开发与利用奠定良好基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种黄孢原毛平革菌JX1及其筛选方法、应用。
背景技术
大蒜的根腐病是当前大蒜生产中的常见主要病害，已成为影响大蒜产品品质，降低大蒜产品产量的主要病害，且随着连年种植，病原微生物残留于土壤、大蒜体内，逐年积累，导致大蒜病害逐年加重。
当前，大蒜根腐病在生产上的防治主要以化学农药为主，但长期、反复和大量使用农药，不仅引起环境污染、农残增加，直接危害人类健康；同时，农药杀伤其他微生物，破坏生态平衡。因此急需寻求一条新的安全有效的植物病害防治途径。
植物生防菌是一类潜力巨大、应用前景广阔的资源微生物，生产上已作为生物防治剂或生长调节剂，在替代或减少农药的使用、改善农业生态系统、保持植物微生态系统的生物多样性，实现农业可持续发展起到重要作用。生物防治是当前植物病害绿色防治的发展趋势。
CN 105820963 A公开了一种黄孢原毛平革菌及其应用，可用于实现现场修复石油污染土壤或油泥以及酚酸类物质积累的经济作物连作土壤的生物改良。现有技术中，尚未有将黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）作为生防菌进行应用的相关记载。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）JX1。
本发明还提供了上述黄孢原毛平革菌JX1的筛选方法。
本发明的另一目的为提供了上述黄孢原毛平革菌JX1在防治大蒜根腐病中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了下述技术方案：
本发明提供了一种黄孢原毛平革菌JX1，所述黄孢原毛平革菌为Phanerochaete chrysosporiumJX1，于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO: M 2022081。
本发明所提供的的黄孢原毛平革菌JX1的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种黄孢原毛平革菌JX1的筛选方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜大蒜鳞芽进行冲洗、超声振荡、消毒；
（2）将消毒后的大蒜鳞芽切块，放置在PDA 培养基表面进行培养；
（3）培养结束后，从分离平板上挑取菌落并接种在新的PDA 培养基上，反复进行纯化培养直至获得单一菌株，即黄孢原毛平革菌JX1，保种备用。
进一步的，步骤（1）中，所述超声振荡采用去离子水，时间为 6~12 min；所述消毒为在无菌环境下依次用75%乙醇浸泡20~40 s，次氯酸钠溶液浸泡1~3 min，无菌水冲洗3~5次。
进一步的，步骤（2）中，所述切块后的组织块大小为1.0~2.5cm；所述培养的条件为28℃下培养5~7d。
进一步的，步骤（3）中，所述纯化培养的条件为28 ℃下培养5~7d。
本发明还提供了一种黄孢原毛平革菌JX1在防治大蒜根腐病中的应用。
本发明筛选得到的黄孢原毛平革菌JX1的菌落表现为：菌落正面白色，背面黄色，表面平坦，较干燥；白色菌丝呈扩散状生长；生长快，菌丝细长，分生孢子呈圆形或椭圆形。
本发明筛选得到的黄孢原毛平革菌JX1用于大蒜根腐病防治时，将黄孢原毛平革菌JX1菌液灌根于大蒜的根部周围或与其邻近的土壤中。
本发明所述的黄孢原毛平革菌JX1菌液，包含上述黄孢原毛平革菌JX1，还包含黄孢原毛平革菌JX1培养液。应用过程中：菌液中的微生物有效量为0.8×108~1.2×108cfu/mL；菌液中的微生物有效量为1×108cfu/mL；菌液的培养条件为：在28°C下恒温培养5d。
本发明筛选得到的黄孢原毛平革菌JX1的生物防治法与其它生物菌剂防治法相比，菌株种类单一且高效，更加绿色、环保。
本发明的有益效果为：
（1）本发明是从大蒜鳞芽中筛选到的黄孢原毛平革菌JX1，对大蒜根腐病原菌具有很强的抑制效果；
（2）相比传统的化学农药防治大蒜根腐病，基于黄孢原毛平革菌JX1开发的生物防治法更加绿色、环保，有助于降低生产成本，提高产品质量；
（3）针对大蒜种植生产过程中常见的病害根腐病的防治，本发明提供的基于黄孢原毛平革菌JX1的生物防治法与其它通用式的防治法相比，更加简单高效；
（4）本发明制备的黄孢原毛平革菌菌剂既能有效减轻大蒜根腐病的发生，产生良好的经济效益和生态效益，为下一步进行菌肥开发与利用奠定良好基础。
菌种保藏信息
保藏时间：2022年1月17日，
保藏单位：中国典型培养物保藏中心，
保藏编号：CCTCC NO: M 2022081，
保藏单位地址：中国武汉，武汉大学，
邮政编码：430072
分类命名：Phanerochaete chrysosporiumJX1。
附图说明
图1为黄孢原毛平革菌JX1的拮抗效果图。
图2为黄孢原毛平革菌JX1菌落特征和菌体形态图。
图3为黄孢原毛平革菌JX1的PCR电泳检测图。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1 黄孢原毛平革菌JX1的筛选
（1）样品采集
样品来源：从自山东省嘉祥县大蒜种植基地采集健康的大蒜植株样品，装入无菌塑料袋中，立即带回实验室分离。
供试病原菌：大蒜根腐病原菌由本实验室分离保存。
马铃薯蔗糖培养基（PDA)制备方法：土豆去皮洗净，称取200g，切成小块，加水煮沸30min，用四层纱布过滤，加入蔗糖20g，琼脂20g，加水定容到1000mL，灭菌后备用。
（2）样品中的真菌分离
A：取新鲜大蒜鳞芽先用自来水冲洗1min，再用去离子水超声振荡 10 min，再在无菌环境下依次用75%乙醇浸泡30 s，次氯酸钠溶液浸泡2 min，无菌水冲洗5次，对大蒜鳞芽进行表面消毒；
B：将经过表面消毒的大蒜鳞芽在超净工作台切成长约1cm3的组织块，放置在PDA培养基表面，在28 ℃下培养5～7d；
C：分别吸取稀释的混合液100μL涂布于PDA 培养基上，PDA 平板放置于培养箱中在28℃下培养5～7d。
D：培养结束后，从分离平板上挑取菌落接种在新鲜的PDA培养基上，反复进行纯化培养，直至获得单一菌株，即黄孢原毛平革菌JX1，并保存备用。
实施例2 拮抗菌筛选
采用平板对峙法进行拮抗大蒜根腐病的黄孢原毛平革菌JX1（简称拮抗菌JX1）的筛选，在PDA平板中央点接大蒜根腐病病原真菌，拮抗菌JX1接种在距离病原真菌边缘2cm处，置于28°C继续培养5d，测量抑菌直径，计算抑菌率。平板对峙结果见表1和图1所示。
抑菌率(％)＝(菌落直径-抑菌直径)/菌落直径×100％。
实施例3拮抗菌JX1的鉴定
（1）形态观察
将筛选分离到的拮抗菌JX1接种到PDA培养基上，28℃培养5天后观察菌落形态。挑取菌丝进行菌体显微观察，参照《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定。黄孢原毛平革菌JX1菌落特征和菌体形态图如图2所示。
（2） ITS序列分析
将纯化培养好的菌株用真菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。采用真菌通用引物：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3），ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板0.5μL，110×Buffer 2.5μL，dNTP1μL，酶0.2μL，上下游引物各0.5μL，加双蒸H2O至25μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94℃变性45 sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，DNA 片段经胶回收试剂盒回收，将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。
图3为PCR电泳检测图，将拮抗真菌黄孢原毛平革菌JX1用ITS序列的通用引物进行扩增，然后进行序列分析。该真菌的片段长度约为614 bp。
序列分析比对结果如表2所示：
表2 序列分析比对
将菌株ITS序列用BLAST同源性分析，菌株JX1与Phanerochaete chrysosporium(黄孢原毛平革菌)表现出最高相似度（100%）且聚在一支，结合菌落形态及显微观察结果，该菌株被鉴定为Phanerochaete（毛平革菌属），Phanerochaete chrysosporium（黄孢原毛平革菌）。
效果实施例
黄孢原毛平革菌JX1防治大蒜根腐病田间试验，具体如下：
1试验材料
将实施例1保存的拮抗大蒜根腐病的黄孢原毛平革菌JX1（简称拮抗菌JX1）转接到马铃薯蔗糖液体培养基中，放于28℃，恒温摇床中180rpm培养5d，制成浓度为1×108cfu/mL的菌悬液。枯草芽孢杆菌由邢台思倍特生物科技有限公司生产，稀释500倍液使用；哈茨木霉菌由北海业盛旺生物科技有限公司生产，稀释500倍液使用。
马铃薯蔗糖液体培养基制备方法：土豆去皮洗净，称取200g，切成小块，加水煮沸30min，用四层纱布过滤，加入蔗糖20g定容到1000mL，灭菌后备用。
2试验方法
选择大蒜根腐病发病严重的地块，设置4个处理：
处理1：清水对照（CK)；处理2：黄孢原毛平革菌JX1菌液；处理3：枯草芽孢杆菌；处理4：哈茨木霉菌。
以上处理均采用灌根方法进行施用，隔7天灌根1次，施用量为20mL/株；共施用3次。每个处理设置3次重复，每个重复40棵大蒜植株。最后1次施药后第7d调查各处理大蒜根腐病发病情况。计算病株率和防治效果。
发病株率（%）=病株数/调查总株数×100
防治效果（%）=（对照病株率-药剂处理后病株率）/对照病株率×100。
3试验结果
不同菌剂处理对大蒜根腐病的防治效果，结果如表3所示。
表3不同菌剂处理对大蒜根腐病防治效果
由上表可以看出，用枯草芽孢杆菌处理的大蒜植株发病率为45.00%，与对照（CK）相比，枯草芽孢杆菌对大蒜根腐病的相对防效达到了44.90%；用哈茨木霉处理的大蒜植株发病率为47.50%，与对照（CK）相比，哈茨木霉对大蒜根腐病的相对防效达到了41.84%；上述处理中黄孢原毛平革菌JX1对大蒜根腐的防治效果最好，相对防效达56.13%。
<110>济宁市农业科学研究院
<120>一种黄孢原毛平革菌JX1及其筛选方法、应用
<160>1
<210>1
<211>614
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
CGGAAGGATC ATTAACGAGT AACTGAACAG GTTGTAGCTG GCCTCTCGGG GCATGTGCAC 60
GCCTGGCTCA TCCACTCTTC AACCTCTGTG CACTTGTTGT AGGTCGGTAG AAGAGCGAGC 120
ATCCTCTGAT GCTTTGCTTG GAAGCCTTCC TATGTTTTAC TACAAACGCT TCAGTTTAAG 180
AATGTCTACC TGCGTATAAC GCATCTATAT ACAACTTTCA GCAACGGATC TCTTGGCTCT 240
CGCATCGATG AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT GAATTGCAGA ATTCAGTGAA 300
TCATCGAATC TTTGAACGCA CCTTGCGCTC CCTGGTATTC CGGGGAGCAT GCCTGTTTGA 360
GTGTCATGGT ATTCTCAACC TTCATAACTT TTTGTTATCG AAGGCTTGGA CTTGGAGGTT 420
GTGCTGGCTT CTAGTCGAGT CGGCTCCTCT TAAATGTATT AGCGTGAGTG TAACGGATCG 480
CTTCGGTGTG ATAATTATCT GCGCCGTGGT CGTGAAGTAA CATAAGCTTG CGCTTCTAAC 540
CGTCCTTCAG TTGGACAACT TACTTTGACA TCTGACCTCA AATCAGGTAG GACTACCCGC 600
TGAACTTAAG CATA 614
Claims (3)
1.一种黄孢原毛平革菌JX1，其特征在于，所述黄孢原毛平革菌为Phanerochaete chrysosporium JX1，于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2022081。
2.根据权利要求1所述的黄孢原毛平革菌JX1，其特征在于，所述黄孢原毛平革菌JX1的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的黄孢原毛平革菌JX1在防治大蒜根腐病中的应用。
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