CN116042458B - 一株核粒链霉菌sm3-7及其在防治玉米茎基腐病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株核粒链霉菌SM3‑7，涉及生物防治技术领域，保藏编号为CGMCC No.25866，分类命名为Streptomyces sclerogranulatus。该菌株于2022年9月30日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明核粒链霉菌SM3‑7，对玉米茎腐病的病原菌拟轮枝镰孢菌具有明显的抑制作用，并对玉米常见病原菌玉米平脐蠕孢、细极链格孢、直帚枝杆孢、禾谷镰孢菌、大斑凸脐蠕孢、禾生炭疽菌和/玉蜀黍平脐蠕孢具有广谱抑制效果，具有被开发为生防药剂的潜能。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，更具体的说是涉及一株核粒链霉菌SM3-7及其在防治玉米茎基腐病中的应用。
背景技术
玉米Zea mays L.为禾本科Poaceae玉蜀黍属Zea L.植物，是我国第一大粮食作物，中国每年的玉米产量超过2.6亿吨，占全国粮食产量近40%，在全国粮食生产中占有举足轻重的地位，但以玉米茎基腐病为主的玉米病害一直对玉米产业构成严重威胁。玉米茎基腐病又名玉米青枯病、玉米茎腐病，是一种世界性的玉米土传病害，在我国玉米主产区时有发生，特别近年来，随着玉米秸秆还田、保护性耕作等耕作制度的变化，重迎茬面积不断增加，使得玉米茎基腐病逐渐加重。据统计，玉米茎基腐病一般年份发病率约为15%~20%，在多雨年份，我国部分玉米产地的发病率最高可达70%，严重时造成产量损失高达50%。目前，玉米茎基腐病的防治主要依靠化学防治和抗病品种，但由于玉米品种的多样性及差异性，导致针对性的品种抗病很难实现；而化学防治中主要以三唑类杀菌剂为主，这类制剂的长期施用易导致病原菌抗药性的产生，以及农药残留、环境污染和土壤微生物种群减少等一系列问题。
生物防治作为植物病害防治的发展方向之一而备受关注，但可供选择的生防菌株资源仍相对较少，因此筛选出更多对玉米茎基腐病病原菌具有拮抗作用的高效生防菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株核粒链霉菌SM3-7，该菌株对玉米茎腐病的病原菌拟轮枝镰孢菌具有明显的抑制作用，并对玉米常见病原菌玉米平脐蠕孢、细极链格孢、直帚枝杆孢、禾谷镰孢菌、大斑凸脐蠕孢、禾生炭疽菌和/玉蜀黍平脐蠕孢具有广谱抑制效果，具有被开发为生防药剂的潜能。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株核粒链霉菌SM3-7，保藏编号为CGMCC No. 25866。于2022年9月30日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。核粒链霉菌SM3-7分类命名为Streptomyces sclerogranulatus。
一种生物菌剂，包括上述菌株或者包括上述菌株的活性成分。
一种工程菌株，以上述菌株为基础构建而得。
本发明的另一目的是，提供上述菌株或上述生物菌剂或上述工程菌株在防治玉米病害中的应用。
优选的，所述玉米病害为玉米茎基腐病、玉米圆斑病、玉米叶枯病、玉米黑束病、玉米穗腐病、玉米大斑病、玉米炭疽病和/或玉米小斑病。
优选的，所述玉米病害由拟轮枝镰孢菌、玉米平脐蠕孢、细极链格孢、直帚枝杆孢、禾谷镰孢菌、大斑凸脐蠕孢、禾生炭疽菌和/或玉蜀黍平脐蠕孢引起。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供的核粒链霉菌（Streptomyces sclerogranulatus）SM 3-7（1）不仅对玉米茎腐病病原菌拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）具有很强的抑菌作用，还对玉米圆斑病、玉米叶枯病、玉米黑束病、玉米穗腐病、玉米大斑病、玉米炭疽病和玉米小斑病等常见玉米病害均具有较好的抑制效果。（2）田间实验证明，核粒链霉菌SM 3-7发酵液接种玉米植株后21 d能有效防治玉米茎腐病。3）核粒链霉菌SM 3-7易于培养，其发酵液粗提物易于提取制备，且相比化学药剂，具有低毒、无污染、低残留及不易产生抗药性等优点。因此，核粒链霉菌SM 3-7具有被开发为生防菌制剂的潜力，对玉米真菌病害防治具有良好的市场应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为菌株SM 3-7对玉米茎腐病病原菌的抑菌效果；其中 A为抑菌带宽；B为抑菌圈；
图2为菌株SM 3-7在高氏一号培养基上的培养特征及孢子形态；其中A为菌落形态，B为孢子形态；
图3为根据菌株SM 3-7的16s rDNA序列为基础构建的系统发育树；
图4为 菌株SM 3-7对玉米常见病害的抑菌活性（病原菌依次为：A：玉米圆斑病；B：玉米叶枯病；C：玉米黑束病；D：玉米穗腐病；E：玉米大斑病；F：玉米炭疽病；G：玉米小斑病）；
图5 菌株SM 3-7发酵液对玉米茎腐病的防治效果（良玉99，上：14 d；下：21 d，A、D：CK；B、E：处理1；C、F：处理2）；
图6 菌株SM 3-7发酵液对玉米茎腐病的防治效果（全玉1233，上：14 d；下：21 d，A、D：CK；B、E：处理1；C、F：处理2）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 核粒链霉菌（Streptomyces sclerogranulatus）SM 3-7的分离、鉴定及保藏
样品：土壤样品采集自福建省莆田市仙游县游洋镇玉米种植基地（纬度：25°37'26.4", 经度118°49'8.4"），将采集的样品带回实验室进行拮抗菌的分离培养。
1、分离：采用稀释涂布法分离土壤样品中的细菌，将1 g风干好的土壤样品加入装有9 mL无菌水的10 mL试管中，在28℃、180 r/min条件下震荡30 min，静置10 min后，依次以10倍梯度稀释成10-2、10-3和10-4的稀释液，取100 μL各梯度稀释液涂布于含0.1%青霉素的高氏一号培养基平板，后倒置于28 ℃恒温培养6 d，挑取培养基上的单菌落进行转接纯化，纯化菌株置于4℃冰箱保存备用。
2、筛选：以玉米茎基腐病病原菌拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides为靶标菌，采用对峙培养法和抑菌圈法筛选拮抗菌。
初筛：将分离到的拮抗链霉菌接种至距平板正中心25 mm的四个方向，28℃恒温培养2 d后，在PDA平板培养基中心接入纯化好的5 mm靶标菌菌饼，置于28℃恒温培养6 d，从中筛选抑菌带宽大于5 mm的菌株进行复筛。
复筛：取5 mL拟轮枝镰孢菌孢子悬液（1×107 CFU/mL）加入95 mL 45 ℃左右的PDA培养基中，摇匀，倒入培养皿中，每20 mL一皿，制成含拟轮枝镰孢菌的平板。取初筛菌株，接种到装有50 mL PDA液体培养基的三角瓶中，28℃、220 r/min条件下振荡培养2 d后，冷冻离心（10000 r/min, 4℃）20 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤得到无菌发酵液；在含菌的PDA平板上选择合适的间距用直径6 mm的打孔器打孔, 取100 μL滤液注入小孔内，静置30 min后，置于28℃恒温培养4 d，测量抑菌圈直径并记录实验结果。每处理重复3次。
通过以上方法，从玉米根际土壤中共分离到22株菌株，将分离得到的菌株与拟轮枝镰孢菌做生长对峙试验，初筛获得3株出抑菌带宽大于5 mm的菌株用于复筛。经过复筛，从中筛选出1株对拟轮枝镰孢菌的抑菌效果最好的菌株，其抑菌带宽为10.50±0.50 mm，抑菌圈直径为28.03±0.45 mm，将其命名为SM 3-7（参见附图1）。
3、鉴定：
（1）形态特征：采用国际菌株鉴定的常用7种培养基进行鉴定，成分如表1所示，将SM 3-7接种至以上7种培养基，置于28℃恒温培养箱倒置培养，7 d后观察菌株在不同培养基上的孢子丝及可溶性色素颜色，如表2所示。
表1培养基成分
表2菌株形态特征
观察所见菌株SM 3-7在7种培养基上均可生长，均有气生菌丝体及基质菌丝体产生，并能产生可溶性色素。菌株SM 3-7在高氏1号培养基上，28℃培养7 d后生长良好，培养初期菌落呈淡黄色、无气丝、边缘不规则、表面有凹凸不平；培养后期菌落呈淡黄至黄色、气丝白色带黄色（参见附图2A），孢子呈圆或椭圆形，长约1.3~1.7 μm，宽约0.4~0.5 μm，呈链状聚集（参见附图2B）。
生理生化特性：参照《链霉菌鉴定手册》（中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社, 1975: 17-66）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 349-388）中所述方法，对菌株SM 3-7的生理生化特征进行鉴定，结果如表3所示。
表3生理生化特性
结果显示，在生理生化特性测试中，拮抗菌SM 3-7可以利用木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、棉子糖为碳源，可以使淀粉水解、牛奶凝固、明胶液化，但不产生H2S。
分子生物学鉴定：菌株SM 3-7于高氏一号液体培养基中，28℃、220 r/min条件下培养5 d后，冷冻离心（10000 r/min, 4℃），弃去上清液，取沉淀菌体用细菌基因提取试剂盒提取总DNA。采用16S rDNA基因通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ IDNO.1;1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO.2），对目标基因组DNA进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；将所测序列进行 BLAST 同源性比对，从GenBank数据库获得相关菌株的16S rDNA基因序列，在MEGA 7.0上用Neighbor-joining分析法构建系统发育进化树。
结果表明：将所测序列于美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上的数据库资源进行Blast比对分析，发现该序列片段与Genbank中链霉菌属Streptomyces sp.的多个种均具有较高同源性，其中与核粒链霉菌S. sclerogranulatus模式菌株具有较高的同源性（登录号：MG669348、EF063468、MK367601）相似度分别达到100%、99.93%和99.45%，从Genbank数据库中选取近缘源链霉菌菌株的16S rDNA基因序列构建系统发育树。结果表明菌株SM 3-7在基于16S rDNA的系统发育树中与核粒链霉菌聚为一支（参见附图3）。
综合菌株形态特征和生理生化特征检测的初步鉴定结果，结合16S rDNA序列分析，最终确定菌株SM 3-7为核粒链霉菌（Streptomyces sclerogranulatus）。
该菌株SM 3-7已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年09月30日，分类命名为Streptomyces sclerogranulatus，保藏编号为CGMCC No. 25866。
实施例2 核粒链霉菌SM3-7广谱抗菌效果的测定
供试菌株及培养基：禾谷镰孢菌
F. graminearun
、大斑凸脐蠕孢
Exserohilum turcicum
、玉蜀黍平脐蠕孢
Bipolaris maydis
、玉米平脐蠕孢
Bipolaris zeae
、禾生炭疽菌
Colletotrichum graminicola
、细极链格孢
Alternaria tenuissima
、直帚枝杆孢
Sarocladium strictum
。用于植物病原菌培养的培养基为PDA培养基。
抑菌活性的测定：采用对峙培养法测定，将菌株SM 3-7接种至距平板正中心25 mm的四个方向，28℃恒温培养2 d后，在PDA平板培养基中心接入纯化好的5 mm靶标菌菌饼，置于28℃恒温培养，6 d后测定该菌株CM3-7对7种玉米常见病病原菌的抑菌带宽（参见附图4），试验设3次重复，结果如表4所示。
表4菌株SM 3-7对供试植物病原菌的抑制带宽
以上结果表明，菌株SM 3-7对玉米上的7种病原菌均有强抑制作用，可见菌株SM3-7的抑菌谱较广。
实施例3菌株CM3-7生物防效盆栽试验
1、菌株SM 3-7发酵液制备：将菌株SM 3-7接种到装有100 mL PDA液体培养基的三角瓶中，28℃、220 r/min条件下振荡培养至孢子浓度为1×108 CFU/mL。
2、拟轮枝镰孢菌孢子液制备：取3片5 mm拟轮枝镰孢菌菌饼接种到装有100 mLPDA液体培养基的三角瓶中，28℃、220 r/min条件下振荡培养至孢子浓度为1×107 CFU/mL。
3、防效测定：玉米品种分别为高抗品种‘良玉99’和高感品种‘全玉1233’。选择高度为20 cm的玉米健康植株进行防效测定，实验设3个处理，分别为在植株根茎部位灌根接种玉米茎基腐病病原菌拟轮枝镰孢菌孢子液20 mL，接种2 d后分别喷施20 mL 无菌水（CK）、核粒链霉菌SM 3-7发酵液（处理1）和1000倍45%咪鲜胺溶液（处理2，阳性对照）。每处理30株，3个重复。接种后第14 d和21 d统计病情指数，计算防效。
病情指数=Σ（各级病株数×各级级数）/（调查总株数×5）×100；
防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100 %。
4、病情分级标准的制定：
0级，无病斑；
1级，茎基部病斑不超过茎部1/4，或1/4以下叶片萎蔫；
2级，茎基病斑占茎部1/4至1/2，或枯黄叶片占全株叶片1/4至1/2；
3级，茎基部变软，或枯黄叶片占全株叶片1/2至2/3；
4级，茎基部软腐，或枯黄叶片占全株叶片2/3以上；
5级，玉米全株叶片枯死，植株倒伏死亡。
通过以上方法，菌株SM 3-7对玉米茎基腐病的盆栽实验结果表明，玉米品种“良玉99”和“全玉1233”在接种菌株SM 3-7发酵液后，玉米叶片长势好，茎部病斑少，发病程度轻（参见附图5、6）。经统计，接种第14 d， SM 3-7发酵液对 ‘良玉99’和‘全玉1233’上玉米茎基腐病的防效分别达到77.28%和76.12%；接种第21 d，SM 3-7发酵液对 ‘良玉99’和‘全玉1233’上玉米茎基腐病的防效分别达到72.20%和71.89%，与1000倍45%咪鲜胺的防治效果相比更高。结果说明该拮抗菌对拟轮枝镰孢菌引起的玉米茎基腐病具有抑制作用，表现出良好的应用潜力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一株核粒链霉菌（Streptomyces sclerogranulatus）菌株SM3-7，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC No. 25866。
2.一种生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的核粒链霉菌菌株SM3-7。
3.权利要求1所述核粒链霉菌菌株SM3-7或权利要求2所述生物菌剂在防治玉米病害中的应用，其特征在于，所述玉米病害为拟轮枝镰孢菌所致的玉米茎基腐病。
4.权利要求1所述核粒链霉菌菌株SM3-7或权利要求2所述生物菌剂在拮抗植物病原菌中的应用，其特征在于，所述植物病原菌为拟轮枝镰孢菌、玉米平脐蠕孢、细极链格孢、直帚枝杆孢、禾谷镰孢菌、大斑凸脐蠕孢、禾生炭疽菌和/或玉蜀黍平脐蠕孢。
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