CN109810922B - 一株梨干枯病拮抗菌、生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株对梨干枯病有防效的拮抗菌LKYHC‑2，属于莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)，其16S rDNA核苷酸序列长度为1390bp，于2018年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.16838。本发明的拮抗菌LKYHC‑2在LB固体培养基上菌落呈乳白色，中间凹陷，凹陷不明显，不透明，菌落有褶皱，菌落产生红色色素，革兰氏阳性菌，杆状，有芽孢。所述拮抗菌LKYHC‑2可用于防治梨干枯病，其中对梨干枯病病原菌菌丝的相对抑制率为88.84％，田间用拮抗菌LKYHC‑2对梨干枯病防治后，病斑治愈率为66.67％，病斑复发率为13.33％。该拮抗菌对环境、人畜安全，解决了梨干枯病防治中长期使用化学药剂产生抗药性的问题。

Description

一株梨干枯病拮抗菌、生物菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及菌株领域，具体涉及一株梨干枯病拮抗菌、生物菌剂及其应用。

背景技术

我国是世界栽培梨的三大起源中心(中国中心、中亚中心和近东中心)之 一，已有3000多年的栽培历史，是世界上最大的梨生产和消费国，占世界20％ 左右的人口，生产和消费世界上70％的梨，可以说梨在我国水果产业体系中具 有举足轻重的作用。然而随着梨产业的发展，各种梨病害的发生严重影响了梨 的品质和产量，影响我国梨产业的健康发展。国内发生较为普遍的梨主要病害 有黑斑病、黑星病、轮纹病、梨锈病等，对其防治主要集中于抗性品种选育， 化学药剂使用等方面。梨干枯病是近年来发现的梨树重要枝干病害之一，在我 国大部分梨区均有发生，如河北、河南、山东、山西、江苏、浙江、云南、甘 肃、东北三省均有发生和危害。该病害是富士拟茎点霉(Phomopsisfukushii) 引起的梨树干部病害，主要危害树干基部，多在嫁接部位开始发病，发病初期 病斑为暗绿色，后变为黑褐色，病部逐渐失水干枯、萎缩、凹陷，病斑自下而 上发展，病部与健部交界处产生明显裂痕，病斑围绕颈部一半以上时，树叶开 始变色，上部树枝逐渐枯萎，造成部分枝条枯死，严重时整个植株死亡。一般 情况幼树发病严重，成年树发病较少。近年来，随着日、韩梨品种的大量引进、 改接，梨干枯病呈现偏重早发、大面积重发的趋势，如不加以控制有扩大发展 的趋势。

目前，有关梨干枯病防治的主要采用化学防治方法，而化学农药的大量使 用，容易引发环境污染、破坏生态、影响食品安全等负面影响。近年来，国家 关于高毒农药、农药残留的政策相继出台，着力推广生物农药，一方面增加了 生物农药在农药应用中的比重，另一方面随着人们对食品安全问题及环保意识 的加强，使得食品安全也成为生物农药应用的一个主要趋势。这使得研究开发 利用生物农药成为梨干枯病防治的重要研究课题。

生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或 抑制的制剂，具有安全、高效、无污染等特点，与保护生态环境和社会协调发 展的要求相吻合，是未来农药发展主要趋势，是符合我国农业生产持久稳定发 展要求的长期策略。拮抗细菌作为一种具有丰富资源的微生物类群，普遍存在 于自然界中，其繁殖种类多，代谢功能各异，是一类有着广泛实际用途的微生 物资源，在植物病害生物防治中很有开发应用前景。目前拮抗细菌研究和应用 较多的主要有芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp)、土壤 放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)以及其他一些细菌。芽孢杆菌(Bacillus sp.) 属细菌在自然界中广泛存在，它们具有生长快，营养需求简单，产芽孢，抗逆 性强等优点，目前已有多种细菌菌株成功地被开发成产品并得到推广。目前还未见莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)在梨干枯病防治中的研究报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株梨干枯病拮抗菌，该梨干枯病拮抗菌 对梨干枯病具有较好的防治效果，对环境、人畜安全，解决了梨干枯病防治中 长期使用化学药剂产生抗药性的问题，以梨干枯病拮抗菌为活性成分，可制备 抗梨干枯病的生物农药。

为实现上述目的，发明人从梨树种植区耕作土壤中分离得到一株对梨干枯 病有防效的拮抗菌LKYHC-2，通过鉴定证明其为莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)，其16SrDNA核苷酸序列长度为1390bp，已于2018年11月29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为：CGMCC No.16838。本发明的拮抗菌LKYHC-2在LB固体培养基上菌落呈乳白色，中 间凹陷，凹陷不明显，不透明，菌落有褶皱，菌落产生红色色素，革兰氏阳性 菌，杆状，有芽孢。

所述拮抗菌LKYHC-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

所述拮抗菌LKYHC-2在生长代谢过程中分泌产生了蛋白酶、淀粉酶及羧 甲基纤维素酶，从而水解了培养基中的蛋白质、淀粉及羧甲基纤维，导致菌落 周围出现透明降解圈，从而实现对梨干枯病病原菌的抑制。

所述拮抗菌LKYHC-2可应用于防治梨干枯病的生物菌剂，所述拮抗菌 LKYHC-2作为活性成分。

拮抗菌LKYHC-2的菌种通过培养基培养得到的培养物或发酵培养液在拮 抗梨干枯病菌中的应用，所述拮抗菌LKYHC-2发酵培养液的制备方法为：将 拮抗菌LKYHC-2接种到NB液体培养基中，在温度为28℃的条件下以150 r/min的速率振荡培养3d，得到发酵培养液。

本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明提供了一株对梨干枯病病菌具 有抑制作用的LKYHC-2菌株，解决了梨干枯病防治中长期使用化学药剂促使梨 干枯病病菌产生抗药性的问题；同时可以将本申请的LKYHC-2菌株作为活性成 分制成生物农药，防治梨干枯病，对环境、人畜安全，并且增加梨的产量，使农 民增收，具有重大的经济效益。

附图说明

图1为本发明莫海威芽孢杆菌LKYHC-2在LB固体培养基上的菌落形态。

图2为本发明莫海威芽孢杆菌LKYHC-2的格兰氏染色下的形态特征 (40×)。

图3为莫海威芽孢杆菌LKYHC-2对梨干枯病病原菌的抑制效果；图3中 A为对照组；B为菌株LKYHC-2对峙正面；C为菌株LKYHC-2对峙背面。

图4为本发明莫海威芽孢杆菌LKYHC-2在淀粉培养基上产生的透明圈。

图5为本发明莫海威芽孢杆菌LKYHC-2在酪蛋白培养基上产生的透明圈。

图6为本发明莫海威芽孢杆菌LKYHC-2在羧甲基纤维素培养基上产生的 透明圈。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域 的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是， 对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若 干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例主要筛选并鉴定拮抗菌，具体筛选和鉴定过程如下所示：

1.试验方法

(1)菌株分离

采用稀释涂布法分离土壤中的拮抗细菌。土样采自武威市林业科学研究 院梨园，风干过筛(2mm筛目)的土样取10g，放入250mL锥形瓶中加入90 mL无菌水于80℃水浴30min，再充分振荡30min，10倍比稀释，趁悬浮液 沉降静止前再吸10mL加入另一90mL灭菌水的三角瓶中振荡摇匀，并依次 稀释成浓度为10^-1g/mL、10^-2g/mL、10^-3g/mL、10^-4g/mL、10^-5g/mL、10^-6g/mL 的悬浮液。最后取10^-4g/mL、10^-5g/mL浓度的悬浮液0.5mL加入已备好的PDA 培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同形态菌落纯化，于4℃保 存备用。

(2)菌株筛选

采用平板对峙法对拮抗菌进行初步选。用直径0.5mm的打孔器将活化的 梨干枯病病原菌接种于PDA培养基中心，同时用接种针将所选拮抗细菌菌株 接种于PDA培养基，每皿点接4个供试菌株，各点位置成十字形。以只接梨 干枯病病原菌的处理为对照。28℃下培养，对照长满全皿时，记录抑菌圈大 小，选取有抑菌作用的菌株复筛，复筛方法同上，最终筛选出抑制效果最好 的1株拮抗菌进行鉴定。

采用以下公式计算菌株LKYHC-2对梨干枯病病原菌生长的相对抑菌率， 每处理重复三次。相对抑制率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径 ×100％。

所述病原菌由本人从甘肃省武威市凉州区梨园中感染梨干枯病的梨树发 病部位分离、纯化获得。

(3)菌株的鉴定

形态学特征：所选拮抗细菌培养特征、菌体形态描述参照《常见细菌系 统鉴定手册》。

菌株的16S rDNA基因序列扩增及序列分析：采用SK8255试剂盒(生 工，上海)提取菌株DNA。采用细菌通用引物以27F(5'-AGTTTGATCMT GGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')(生工生物工程(上 海)股份有限公司合成)为上、下游引物扩增拮抗菌株LKYHC-2的16S rDNA。 对所得PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，对 所得供试菌株的16S rDNA基因序列，运用NCBI数据库中的BLAST工具软件，进行DNA序列同源性比较。

2.试验结果

(1)选择1株拮抗活性最好的菌株，命名为LKYHC-2，其平板对峙试验 结果见图3A、图3B和图3C，可以看出菌株LKYHC-2对梨干枯病病原菌具 有很好的抑制作用；菌株LKYHC-2对梨干枯病病原菌的抑制率如表1，其相 对抑制率为88.84％。

表1拮抗菌LKYHC-2菌株对梨干枯病病原菌的拮抗作用

对照菌落半径(cm)	处理菌落半径(cm)	相对抑制率(％)
			4.3	0.48	88.84

(2)菌株LKYHC-2的形态特征

拮抗菌LKYHC-2形态特征如图1所示，拮抗菌LKYHC-2在LB固体培 养基上菌落呈乳白色，中间凹陷，凹陷不明显，不透明，菌落有褶皱，菌落产 生红色色素，革兰氏阳性菌，杆状，有芽孢(如图2所示)。

(3)菌株LKYHC-2的16S rDNA基因序列扩增及序列分析

菌株LKYHC-2的16S rDNA基因序列，如核苷酸序列表中的SEQ ID NO: 1所示。将所测序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：菌株 LKYHC-2的16S rDNA基因序列与Bacillus mojavensis(MF662401，JF496257， KR999925)的相似性最高，为99％，依据文献，两菌株的序列一致性大于99％ 应归类为同一物种。再结合上述形态学特征，将拮抗菌LKYHC-2鉴定为莫海 威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)。

实施例2

本实施例主要对菌株LKYHC-2拮抗机理进行试验。

1.试验方法

将培养1d的拮抗菌株LKYHC-2点接在酪蛋白培养基、淀粉培养基、羧 甲基纤维素培养基上，每皿接3株菌，30℃培养5d，观察菌落周围有无透明 圈产生，其中淀粉培养基在观察之前应滴加数滴碘液；纤维素酶活性的测定用 1g/L的刚果红染10～15min，然后，倒掉染液，再用1mol/L的NaCl浸 泡15min。

其中，所述酪蛋白培养基(1000mL)：脱脂奶粉20g，酵母浸膏5g，葡 萄糖5g，琼脂16g，水1000mL，pH 7.0。

所述淀粉培养基(1000mL)：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，葡糖糖5g， NaCl 5g，牛肉膏5g，琼脂16g，水1000mL，pH 7.0。

所述羧甲基纤维素培养基：CMC-Na 5.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，K₂HPO₄0.25g，琼脂16g，水1000mL。

2.试验结果

菌株LKYHC-2拮抗机理研究结果如图4、图5、图6所示。菌株LKYHC-2 在淀粉培养基、酪蛋白培养基和羧甲基纤维素上菌落周围有明显的透明圈产生， 表明该菌株在生长代谢过程中分泌产生了蛋白酶、淀粉酶及羧甲基纤维素酶， 从而水解了培养基中的蛋白质、淀粉及羧甲基纤维，导致菌落周围出现透明降 解圈。初步推测菌株LKYHC-2可利用蛋白酶、淀粉酶和羧甲基纤维素酶的作 用抑制梨干枯病的发生发展。

实施例3

本实施例对菌株LKYHC-2进行田间试验。

1.试验方法

2017年4月，将梨干枯病病原菌接种到梨幼树干部，7月份开展菌株 LKYHC-2田间防治试验，选择代森锰锌及清水处理为对照。涂药前彻底刮除 梨树枝条上的病斑组织，刮除面积超出病斑0.5～1.0cm，然后分别涂抹 LKYHC-2发酵液、代森锰锌及清水，每10d涂抹1次，共涂抹3次，翌年4 月份调查，统计各处理梨树枝条上的病斑治愈率、病斑复发率。

所述LKYHC-2发酵液的制备：将拮抗芽孢杆菌LKYHC-2接种到NB液 体培养基中，28℃、150r/min振荡培养3d，制成LKYHC-2发酵液，用无菌 水稀释浓度为1×10⁸CFU/mL。

所述NB液体培养基配方：蛋白胨10g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，水 1000mL，pH值7.2。

2.试验结果

菌株LKYHC-2对梨干枯病的田间防治效果如表2所示。菌株LKYHC-2 对梨干枯病的治愈率66.67％，比药剂代森锰锌低8.33个百分点，比清水对照 高52.38个百分点；菌株LKYHC-2对防治梨干枯病的复发率13.33％，比药剂 代森锰锌高6.19个百分点，比清水对照低58.1个百分点。说明菌株LKYHC-2 为活性菌，可作为梨干枯病生物防治的一种拮抗菌在生产实践中应用，可用于 制备生物农药，防治梨干枯病。

表2 LKYHC-2对梨干枯病的田间防治效果

涂抹处理	病斑治愈率(％)	病斑复发率(％)
			LKYHC-2	66.67b	13.33b
代森锰锌	75a	7.14c
			清水	14.29c	71.43a

表2中数据为平均值。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05 水平差异显著。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限 于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化 或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例 和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 武威市林业科学研究院

<120> 一株梨干枯病拮抗菌、生物菌剂及其应用

<141> 2019-02-26

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1390

<212> DNA

<213> 莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)

<400> 1

gcacgtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tgcttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420

ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

tccttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc aaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtgcg 1390

Claims (8)

1.一株梨干枯病拮抗菌，其特征在于：该菌株为莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)LKYHC-2，其16S rDNA核苷酸序列长度为1390bp，于2018年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.16838。

2.根据权利要求1所述的一株梨干枯病拮抗菌，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌LKYHC-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种如权利要求1所述的梨干枯病拮抗菌应用于防治梨干枯病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌LKYHC-2对梨干枯病病原菌具有抑制作用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌LKYHC-2在生长代谢过程中分泌产生了蛋白酶、淀粉酶及羧甲基纤维素酶，水解了培养基中的蛋白质、淀粉及羧甲基纤维，导致菌落周围出现透明降解圈，从而实现对梨干枯病病原菌的抑制。

6.一种用于防治梨干枯病的生物菌剂，其特征在于：以权利要求1所述的梨干枯病拮抗菌作为活性成分的生物菌剂。

7.一种如权利要求1所述梨干枯病拮抗菌的菌种通过培养基培养得到的培养物或发酵培养液在拮抗梨干枯病菌中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌LKYHC-2的发酵培养液的制备方法为：将莫海威芽孢杆菌LKYHC-2接种到NB液体培养基中，在温度为28℃的条件下以150r/min的速率振荡培养3d，得到发酵培养液。

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