CN112760258B - 一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用 - Google Patents

一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用。本发明提供了皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)ZF390，其保藏编号为CGMCC No.20322。本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的发酵产物。本发明还保护含有皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌剂。本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在抑制致病菌中的应用。本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在防治致病菌引起的植物病害中的应用。本发明提供了皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390，可用于抑制植物致病菌，从而防控植物致病菌引起的植物病害。

Description

一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativas L.)是一种重要的水果型蔬菜，是设施蔬菜主要栽培种类。近年来，随着设施黄瓜种植规模的不断扩大，细菌性病害的发生越来越普遍，对我国黄瓜产业造成了严重的经济损失。果胶杆菌(Pectobacterium)可引起黄瓜、马铃薯、大白菜、马蹄莲、魔芋、郁金香等多种植物的软腐病，具有十分广泛的寄主范围。从经济学上讲，软腐病是影响全球植物的最具破坏力的十大细菌性病害之一。黄瓜细菌性软腐病发病后传播速度快，危害范围广，目前化学药剂不能有效防治该病害，并且容易造成环境污染、引起食品安全等问题，因此开展黄瓜细菌性软腐病生物防治的研究尤为重要和迫切。
利用生防菌来防治植物病害，因其低成本、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点。因此，筛选能高效防治黄瓜细菌性软腐病的生防菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用。
本发明提供了皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)ZF390，已于2020年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.20322。皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)ZF390简称为皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390。
本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的发酵产物。
所述发酵产物包括发酵上清也包括菌体。
本发明还保护含有皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌剂。
本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在抑制致病菌中的应用。
本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在制备致病菌抑制剂中的应用。
本发明还保护一种致病菌抑制剂，其活性成分为皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂。
本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用。
本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在防治致病菌引起的植物病害中的应用。
本发明还保护皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂在制备产品中的应用；所述产品的功能为防治致病菌引起的植物病害。
本发明还保护一种产品，其活性成分为皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390或所述发酵产物或所述菌剂；所述产品的功能为防治致病菌引起的植物病害。
以上任一所述致病菌可为植物致病菌。
以上任一所述致病菌可为致病真菌或致病细菌。
以上任一所述致病菌可为果胶杆菌。
以上任一所述致病菌可为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种。
以上任一所述致病菌可为软腐病致病菌。
以上任一所述致病菌可为黄瓜细菌性软腐病致病菌。
以上任一所述植物病害可为软腐病。
以上任一所述植物病害可为黄瓜细菌性软腐病。
以上任一所述植物可为黄瓜。
以上任一所述植物可为新泰密刺黄瓜。
以上任一所述致病真菌可为：多主棒孢、尖孢镰孢、辣椒炭疽、辣椒疫霉、茄匍柄霉、西瓜壳二孢、灰葡萄孢或立枯丝核。
以上任一所述致病细菌可为：丁香假单胞菌番茄致病变种、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、密执安棒杆菌马铃薯环腐亚种、丁香假单胞菌流泪致病变种、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、密执安棒杆菌密执安亚种、葡萄土壤杆菌或燕麦嗜酸菌西瓜亚种。
以上任一所述菌剂中，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌浓度可为1×107cfu/mL-1×109cfu/mL，具体可为1×108cfu/mL。
以上任一所述发酵产物中，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌浓度可为1×107cfu/mL-1×109cfu/mL，具体可为1×108cfu/mL。
在某一实施例中，所述菌剂的制备方法可为如下：皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL。
在某一实施例中，所述发酵产物的制备方法可为如下：皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL。
以上任一所述菌剂中，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌浓度可为1×105cfu/mL-1×107cfu/mL，具体可为1×106cfu/mL。
以上任一所述发酵产物中，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌浓度可为1×105cfu/mL-1×107cfu/mL，具体可为1×106cfu/mL。
在某一实施例中，所述菌剂的制备方法可为如下：皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，然后用蒸馏水稀释至100倍体积。
在某一实施例中，所述发酵产物的制备方法可为如下：皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，然后用蒸馏水稀释至100倍体积。
以上任一所述菌剂中，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌浓度可为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL，具体可为1.45×107cfu/mL。
以上任一所述发酵产物中，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的菌浓度可为1×108cfu/mL-1×1010cfu/mL，具体可为2.12×109cfu/mL。
在某一实施例中，所述菌剂制备方法可为如下：①挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养18h，然后用LB液体培养基调整菌浓度，得到OD600为0.6的菌悬液；②取步骤①得到的菌悬液，以3％接种量接种于发酵培养基中，28℃、240r/min振荡培养24h；③取步骤②得到的发酵液，用蒸馏水稀释至100倍体积。发酵培养基：乳糖15g，酵母粉15g，MgSO4·7H2O 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
在某一实施例中，所述菌剂制备方法可为如下：①挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养18h，然后用LB液体培养基调整菌浓度，得到OD600为0.6的菌悬液；②取步骤①得到的菌悬液，以2％接种量接种于初始发酵培养基中，28℃、180r/min振荡培养24h；③取步骤②得到的发酵液，用蒸馏水稀释至100倍体积。初始发酵培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，NaCl 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)具有良好生物活性，能产生多种抗生素，对植物病原菌具有很好的抑制作用，可促进植物生长，诱导植物产生系统抗性，影响根际微生物群落等。目前还没有皮尔瑞俄类芽孢杆菌防治黄瓜细菌性软腐病的报道。本发明提供了皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390，可用于抑制植物致病菌，具有广谱性，从而防控植物致病菌引起的植物病害。
附图说明
图1为实施例1中采用双层培养法检测各个供试菌对致病菌的拮抗活性的结果。
图2为实施例1中采用喷雾法检测各个供试菌对致病菌的活体防效的结果。
图3为实施例1中菌株ZF390的形态照片。
图4为实施例1中菌株ZF390的16S rDNA系统发育树。
图5为实施例2中真菌抑菌谱测定的结果。
图6为实施例2中细菌抑菌谱测定的结果。
图7为实施例3中皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的酶活测定结果。
图8为实施例4中皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390拮抗物质合成基因测定的结果。
图9为实施例5中皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390发酵工艺的优化的结果。
图10为实施例6中皮尔瑞俄类芽胞杆菌ZF390发酵液防效与其它药剂防效对比的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的培养基，如无特殊说明均为自然pH。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的发酵液指的是整个发酵体系，包括发酵上清也包括菌体。
胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense)，为黄瓜细菌性软腐病菌，记载于如下文献：郑斐、李磊、石延霞、谢学文、柴阿丽、程有普、李宝聚.水生拉恩氏菌ZF7分离鉴定及其促生防病效果研究.植物病理学报，2019，49(6)：836-845.”中公开。公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
LB固体培养基的组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
LB液体培养基的组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL。
NB液体培养基的组成：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL；pH7.0。
PDA培养基的组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
WA培养基的组成：琼脂5g，蒸馏水1000mL。
实施例1、皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的分离、筛选、鉴定及保藏
一、菌株分离
从黑龙江、四川、河北、内蒙古、山东省的马铃薯根际土壤中分离细菌菌株，共分离得到1200株纯培养的细菌菌株。
具体方法如下：称取马铃薯根际土壤10g，溶于90mL无菌水中，28℃、180r/min振荡处理30min，使其充分混匀；将混匀的土样80℃水浴10min后，按照10-2至10-5进行梯度稀释，分别吸取100μL稀释后的悬浮液涂布LB固体培养基平板(每个稀释度涂布3个平板)，28℃恒温培养2d后，挑取形态不同的细菌菌落在LB固体培养基上进行平板划线纯化，然后编号保存。
二、菌株筛选
1、离体筛选
供试菌：步骤一分离的1200株细菌菌株。
致病菌：胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种。
采用双层培养法分别检测各个供试菌对致病菌的拮抗活性。82株供试菌对致病菌具有明显的抑制作用，平板上出现明显抑菌圈，部分供试菌的抑菌效果见图1。
具体方法如下：①挑取供试菌单菌落接种于LB液体培养基，28℃、180r/min振荡培养至菌浓度为1×108cfu/mL，即为供试菌菌悬液；②在PDA培养基平板中心接种5μL供试菌菌悬液，28℃培养24h后将培养皿倒置，在通风橱中向每个培养皿里加入3mL氯仿，静置12h以灭活供试菌；③将致病菌接种于NB液体培养基，28℃、180r/min振荡培养至菌浓度为1×108cfu/mL，即为致病菌菌悬液；④向4mL WA培养基中加入100μL致病菌菌悬液，混匀后倒入完成步骤②的PDA培养基平板上，作为上层，然后28℃培养24h，然后观察并测量抑菌圈大小。
2、活体筛选
供试菌：步骤1筛选出的82株细菌菌株。
致病菌：胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种。
采用喷雾法分别检测各个供试菌对致病菌的活体防效。部分结果见表1和图2。结果显示，菌株ZF390可有效降低黄瓜植株发病的病情指数，防效达到76.47％，与阳性对照的防效相当。菌株ZF390可以在活体植株上发挥生防效果，具有开发潜力。
表1拮抗菌株对黄瓜细菌性软腐病盆栽防治效果
Figure BDA0002918569530000051
Figure BDA0002918569530000061
具体步骤：①挑取致病菌单菌落接种于NB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，即为致病菌菌液；②挑取供试菌单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，然后用蒸馏水稀释至100倍体积，即为供试菌菌液；③将致病菌菌液喷雾接种于一叶一心时期的新泰密刺黄瓜幼苗上(每15株幼苗喷施200mL)，培养24小时，然后喷雾接种供试菌菌液(每15株幼苗喷施300mL)，正常培养，待空白对照处理组植株完全发病后调查其他处理组的病情指数和防效。以山东省乳山韩威生物科技有限公司的4％春雷霉素可湿性粉剂(登记证号：PD20100329)的1000倍液作为供试菌菌液的阳性对照，以蒸馏水作为供试菌菌液的空白对照(CK)。设置3次重复试验，每次重复试验中每种处理15株幼苗。
病级分类标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；5级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×最高级数的代表值)。防效(％)＝100×(空白对照处理组病情指数-其他处理组病情指数)/空白对照处理组病情指数。
三、菌株ZF390的鉴定
1、形态学鉴定
菌株ZF390在LB固体培养基上呈乳白色，单菌落较小，菌落表面无褶皱，边缘不规则，有粘性。菌体细胞呈杆状，周生多根鞭毛，表面较为光滑，无明显褶皱。形态照片见图3。
2、生理生化鉴定
将菌株ZF390划线接种于LB固体培养基，28℃培养24h，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对生理生化特征进行鉴定。
结果见表2。菌株ZF390为革兰氏阳性细菌，在28℃-37℃条件下均可生长，15℃时不能生长。培养基含盐量为1％时可正常生长，含盐量为4-8％时不能生长。可以利用甘露糖、明胶、山梨醇和果胶，不能利用柠檬酸盐。硝酸盐还原反应和淀粉水解反应均为阳性。
表2菌株ZF390生理生化特性
Figure BDA0002918569530000071
3、Biolog测定
挑取菌株ZF390单菌落接种至LB固体培养基试管斜面上，28℃培养24h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENIII试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF390进行唯一碳源利用的测定。
BIOLOG唯一碳源利用结果见表3。
表3利用BIOLOG GENIII试剂条测定菌株ZF390的唯一碳源利用
Figure BDA0002918569530000072
Figure BDA0002918569530000081
Figure BDA0002918569530000091
注：+，阳性；-，阴性；W，弱阳性。
4、分子鉴定
用普通细菌基因组提取试剂盒提取菌株ZF390的基因组DNA后，分别利用细菌16SrDNA的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′对菌株ZF390的16S rDNA进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物送博迈德生物公司进行序列测定。用MEGA7.0采用最大似然法构建系统发育树，分析其亲缘关系。
16S rDNA测序结果如序列1所示。16S rDNA测序结果经BLAST比对发现，菌株ZF390与皮尔瑞俄类芽孢杆菌一致性较高。构建16S rDNA系统发育树，结果见图4，菌株ZF390与皮尔瑞俄类芽孢杆菌标准菌株聚在一簇上。
结合形态鉴定、生理生化鉴定、BIOLOG测定和分子鉴定结果，菌株ZF390属于皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)。
四、菌株ZF390的保藏
皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)ZF390，已于2020年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.20322。皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)ZF390简称为皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390。
实施例2、皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390抑菌谱测定
一、真菌抑菌谱测定
采用平板对峙法检测皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390对多种致病真菌的抑制率。
致病真菌分别为：多主棒孢、尖孢镰孢、辣椒炭疽、辣椒疫霉、茄匍柄霉、西瓜壳二孢、灰葡萄孢或立枯丝核。
具体方法如下：挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，即为ZF390菌悬液；在PDA培养基平板中央接种直径5mm的致病真菌菌饼，同时在距平板中央3.5cm处接种5μL ZF390菌悬液(用LB液体培养基作为ZF390菌悬液的对照，用CK表示)，28℃培养5d，然后测量致病菌菌落直径。抑菌率(％)＝100×(对照处理的致病菌菌落直径－ZF390菌悬液处理的致病菌菌落直径)/对照处理的致病菌菌落直径。
每种致病真菌设置3个重复处理。
结果见图5和表4。
表4菌株ZF390的真菌抑菌谱试验
致病菌 抑菌率(％)
多主棒孢Corynespora cassiicola 50.71±1.05
尖孢镰孢Fusarium oxysporum 43.14±0.96
辣椒炭疽Colletotrichum capsici 63.65±1.21
辣椒疫霉Phytophthora capsici 44.82±0.97
茄匍柄霉Stemphylium solani 52.82±2.18
西瓜壳二孢Ascochyta citrullina 53.06±0.26
灰葡萄孢Botrytis cinerea 54.07±1.54
立枯丝核Rhizoctonia solani 66.71±4.59
多主棒孢(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报，2011，38(3)：465-470.”中公开，采用文献中的“菌株编号：LN9”的菌株，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)已在文献“石延霞、张晓慧、徐玉芳、谢学文、柴阿丽、李宝聚.吡唑并嘧啶衍生物BDO-1诱导黄瓜对枯萎病的抗性.园艺学报，2019，46(05)：877-890.”中公开，采用文献中的“菌株编号：4706”的菌株，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
辣椒炭疽(Colletotrichum capsici)已在文献“杜公福、戚志强、李宝聚、郭英兰、杨衍.海南冬季蔬菜无性型真菌多样性研究.菌物研究，2016，14(03)：142-148.”中公开，采用文献中的“菌株编号：LJ100113102”的菌株，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
辣椒疫霉(Phytophthora capsici)已在文献“程颖超、康华军、石延霞、柴阿丽、张红杰、谢学文、李宝聚.辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用.园艺学报，2018，45(05)：997-1006.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
茄匍柄霉(Stemphylium solani)已在文献“李新宇、李磊、陈利达、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定.园艺学报，2020，47(04)：741-748.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)已在文献“赵彦杰、李宝聚、石延霞、贲海燕.瓜类蔓枯病的发生与防治.中国蔬菜，2008，(02)：56-57+70.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)已在文献“唐明、晋知文、谢学文、柴阿丽、石延霞、李宝聚.啶酰菌胺对黄瓜灰霉病防治效果的综合评价.中国蔬菜，2016，(02)：51-55.”中公开，采用文献中的“菌株编号：HG09021201”的菌株，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜，2008，(6)：9-12.”中公开，，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
二、细菌抑菌谱测定
致病细菌分别为：丁香假单胞菌番茄致病变种(用Pst表示)、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(用Xcc表示)、密执安棒杆菌马铃薯环腐亚种(用Cms表示)、丁香假单胞菌流泪致病变种(用Psl表示)、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(用Pcb表示)、密执安棒杆菌密执安亚种(用Cmm表示)、葡萄土壤杆菌(用Av表示)或燕麦嗜酸菌西瓜亚种(用Aac表示)。
采用双层培养法检测皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390对致病细菌的拮抗活性。
具体方法如下：①挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基，28℃、180r/min振荡培养至菌浓度为1×108cfu/mL，即为ZF390菌悬液；②在PDA培养基平板中心接种5μL ZF390菌悬液(用LB液体培养基代替ZF390菌悬液作为对照，用CK表示)，28℃培养24h后将培养皿倒置，在通风橱中向每个培养皿里加入3mL氯仿，静置12h以灭活菌；③将致病细菌接种于NB液体培养基，28℃、180r/min振荡培养至菌浓度为1×108cfu/mL，即为致病菌菌悬液；④向4mL WA培养基中加入100μL致病菌菌悬液，混匀后倒入完成步骤②的PDA培养基平板上，作为上层，然后28℃培养24h，然后观察并测量抑菌圈大小。
抑菌率(％)＝100×ZF390菌悬液处理的抑菌圈直径/整个平板的直径。
结果见表5和图6。
表5菌株ZF390的细菌抑菌谱试验
致病菌 抑菌率(％)
丁香假单胞杆菌番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.tomato 24.44±0.00
野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种Xanthomonas campestris pv.campestris 26.30±1.28
密执安棒杆菌马铃薯环腐亚种Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicum 18.52±0.64
丁香假单胞杆菌流泪致病变种Pseudomonas syringae pv.lachrymans 26.30±0.64
胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense 24.07±1.60
密执安棒杆菌密执安亚种Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis 24.26±0.64
葡萄土壤杆菌Agrobacterium vitis 15.00±0.96
燕麦嗜酸菌西瓜亚种Acidororax avenae subsp.citrulli 22.41±0.32
丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“柴阿丽、帕提古丽、郭威涛、石延霞、谢学文、席先梅、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报，2019，46(01)：182-192.”中公开，采用文献中“菌株编号：FQ13080217”的菌株，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜，2011，17：23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
密执安棒杆菌马铃薯环腐亚种(Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus)已在文献“李磊、赵昱榕、郑斐、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.马铃薯黑痣病生防菌的筛选及防治效果.植物病理学报，2020，https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000357.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
丁香假单胞菌流泪致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachryrnans)已在文献“李焕玲、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(五十三)黄瓜细菌性角斑病的症状多样性与综合防治.中国蔬菜，2012，(21)：23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李磊、赵昱榕、郑斐、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.芹菜软腐病拮抗芽孢杆菌筛选及防治效果.中国生物防治学报，2020，36(03)：388-395.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)已在文献“赵昱榕、李磊、谢学文、石延霞、柴阿丽、孙广玉、李宝聚.贝莱斯芽孢杆菌ZF2对多主棒孢病菌防治效果.中国生物防治学报，2019，35(02)：217-225.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidororax avenae subsp.citrulli)“范晓溪、金伟、周慧敏、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(四十一)瓜类细菌性果斑病的发生规律及防治.中国蔬菜，2011，(21)：26-29.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
实施例2的结果显示，皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390可显著抑制8种致病细菌和8种致病真菌的生长，具有广谱拮抗活性。
实施例3、皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的酶活测定
1、挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至菌浓度为1×108cfu/mL，即为ZF390菌悬液。
2、取5μL ZF390菌悬液接种于CMC培养基平板中央，28℃培养24h。
CMC培养基：硫酸镁0.1g，硫酸铵1g，10×磷酸缓冲液(磷酸氢二钾70g，磷酸二氢钾20g，蒸馏水1000mL)100mL，酵母提取物5g，甘油2mL，羧甲基纤维素钠1g，琼脂(bacto agar)8g，蒸馏水900mL。
3、取5μL ZF390菌悬液接种于蛋白酶培养基平板中央，28℃培养24h，然后测量透明圈直径。
蛋白酶培养基：NA培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水980mL，pH7.0)，20mL脱脂牛奶高温加热煮沸后加入融化后的NA培养基中。
4、完成步骤2的CMC培养基平板用0.2g/100ml刚果红溶液染色30min后，用1M NaCl水溶液脱色15min，然后测量透明圈直径。
结果见图7。皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390在CMC平板和蛋白酶平板上产生明显透明圈，表明皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390有较强的产纤维素酶和蛋白酶能力，可有效溶解病原菌细胞壁，达到防病作用。
实施例4、皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390拮抗物质合成基因测定
用普通细菌基因组提取试剂盒提取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390的基因组DNA后，分别利用表6中的各个引物对对基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后，根据条带判定皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390有无拮抗物质合成基因。
表6拮抗物质合成基因引物信息
Figure BDA0002918569530000141
结果见图8。皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390基因组中含有丰原素、杆菌素等多种拮抗物质合成基因，使皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390表现广谱抑菌作用。
实施例5、皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390发酵工艺的优化
本实施例的目的为测定皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390在发酵工艺优化前后的发酵液浓度以及防效的提升。
1、挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养18h，然后用LB液体培养基调整菌浓度，得到OD600为0.6的菌悬液。
2、取步骤1得到的菌悬液，以2％接种量接种于初始发酵培养基中，28℃、180r/min振荡培养24h。
初始发酵培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，NaCl 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。装液量：100/250mL。
3、取步骤1得到的菌悬液，以3％接种量接种于优化后发酵培养基中，28℃、240r/min振荡培养24h。
优化后发酵培养基：乳糖15g，酵母粉15g，MgSO4·7H2O 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。装液量：50/250mL。
4、完成步骤2或步骤3后，吸取1mL发酵液，用所对应的空白培养基稀释到适当浓度，然后吸取100μL菌悬液涂板，28℃培养48h，然后计算菌落数。
5、检测防效
致病菌：胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种。
①挑取致病菌单菌落接种于NB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，即为致病菌菌液；②取步骤2或步骤3得到的发酵液，用蒸馏水稀释至100倍体积，即为供试菌菌液；③将致病菌菌液喷雾接种于一叶一心时期的新泰密刺黄瓜幼苗上(每15株幼苗喷施200mL)，培养24小时，然后喷雾接种供试菌菌液(每15株幼苗喷施300mL)，正常培养，待空白对照处理组植株完全发病后调查其他处理组的病情指数和防效。以山东省乳山韩威生物科技有限公司的4％春雷霉素可湿性粉剂(登记证号：PD20100329)的1000倍液作为供试菌菌液的阳性对照，以蒸馏水作为供试菌菌液的空白对照(CK)。设置3次重复试验，每次重复试验中每种处理15株幼苗。
病级分类标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；5级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×最高级数的代表值)。防效(％)＝100×(空白对照处理组病情指数-其他处理组病情指数)/空白对照处理组病情指数。
结果见图9。步骤2得到的发酵液的菌浓度为1.45×109cfu/mL，防效为60.51％。步骤3得到的发酵液的菌浓度为2.12×1011cfu/mL，防效为86.15％。
实施例6、皮尔瑞俄类芽胞杆菌ZF390发酵液防效与其它药剂防效对比平行试验
采用喷雾法比较皮尔瑞俄类芽胞杆菌ZF390和其它药剂对黄瓜细菌性软腐病的活体防效。
致病菌：胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种。
1、挑取致病菌单菌落接种于NB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养至浓度为1×108cfu/mL，即为致病菌菌液。
2、挑取皮尔瑞俄类芽孢杆菌ZF390单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养18h，然后用LB液体培养基调整菌浓度，得到OD600为0.6的菌悬液。
3、取步骤2得到的菌悬液，以3％接种量接种于发酵培养基中，28℃、240r/min振荡培养24h。
发酵培养基：乳糖15g，酵母粉15g，MgSO4·7H2O 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。装液量：50/250mL。
4、将致病菌菌液喷雾接种于一叶一心时期的新泰密刺黄瓜幼苗上(每15株幼苗喷施200mL)，培养24小时，然后喷雾接种供试品(每15株幼苗喷施300mL)，正常培养，待空白对照处理组植株完全发病后调查其他处理组的病情指数和防效。以蒸馏水作为供试品的空白对照(CK)。设置3次重复试验，每次重复试验中每种处理15株幼苗。
供试品为：步骤3得到的发酵液的100倍稀释液(稀释溶剂为蒸馏水)或者10亿CFU/克多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂(广东顾地丰生物科技有限公司，登记证号：PD20181264)350倍液或者1000亿芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(武汉科诺生物科技股份有限公司，登记证号：PD20140209)1400倍液或者8亿个/克蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂(山东泰诺药业有限公司，登记证号：PD20094534)100倍液或者100亿芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂(江西顺泉生物科技有限公司，登记证号：PD20184023)100倍液或者80亿个活芽孢/毫升地衣芽孢杆菌水剂(广西金燕子农药有限公司，登记证号：PD20140122)90倍液或者5亿芽孢/克荧光假单胞杆菌可湿性粉剂(山东泰诺药业有限公司，登记证号：PD20140874)50倍液或者3％中生菌素可湿性粉剂(福建凯立生物制品有限公司，登记证号：PD20110113)650倍液或者4％春雷霉素可湿性粉剂(山东省乳山韩威生物科技有限公司，登记证号：PD20100329)1000倍液或者80％乙蒜素乳油(开封大地农化生物科技有限公司，登记证号：PD20101285)2200倍液或者0.3％四霉素水剂(辽宁微科生物工程股份有限公司，登记证号：PD20160345)1100倍液或者10％多抗霉素可湿性粉剂(山东省德州祥龙生化有限公司，登记证号：PD20100857)1000倍液或者30％琥胶肥酸铜可湿性粉剂(黑龙江齐齐哈尔四友化工有限公司，登记证号：PD20097367)275倍液或者46％氢氧化铜水分散粒剂(美国杜邦公司，登记证号：PD20110053)1800倍液或者33.5％喹啉铜悬浮剂(山东奥胜生物科技有限公司，登记证号：PD20200743)1500倍液或者1.6％噻霉酮涂抹剂(陕西西大华特科技实业有限公司，登记证号：PD20120375)700倍液或者20％噻唑锌悬浮剂(浙江新农化工股份有限公司，登记证号：PD20096932)1000倍液。
病级分类标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；5级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×最高级数的代表值)。防效(％)＝100×(空白对照处理组病情指数-其他处理组病情指数)/空白对照处理组病情指数。
试验结果见表7和图10。图10中：A:ZF390；B:多粘类芽孢杆菌；C:枯草芽孢杆菌；D:蜡质芽孢杆菌；E:坚强芽孢杆菌；F:地衣芽孢杆菌；G:荧光假单胞杆菌；H:中生菌素；I:春雷霉素；J:乙蒜素；K:四霉素；L:多抗霉素；M:琥胶肥酸铜；N:氢氧化铜；O:喹啉铜；P:噻霉酮；Q:噻唑锌；R:CK。菌株ZF390发酵液对黄瓜细菌性软腐病的防效为92.52％，显著高于其它药剂。
表7菌株ZF390与其它药剂对黄瓜细菌性软腐病盆栽防效
处理 使用浓度 病情指数 防治效果/％
ZF390 100倍液 6.67±5.05i 92.52±5.67a
多粘类芽孢杆菌 350倍液 21.67±5.20h 75.70±5.84b
枯草芽孢杆菌 1400倍液 15.42±2.60h 82.71±2.92b
蜡质芽孢杆菌 100倍液 33.75±4.51g 62.15±5.05c
坚强芽孢杆菌 100倍液 45.83±6.17def 48.60±6.91def
地衣芽孢杆菌 90倍液 44.61±3.10def 49.97±3.48def
荧光假单胞杆菌 50倍液 51.67±4.02cd 42.06±4.51fg
中生菌素 650倍液 38.75±2.50fg 56.54±2.80cd
春雷霉素 900倍液 38.33±0.72fg 57.01±0.81cd
乙蒜素 2200倍液 71.25±6.61b 20.10±7.42h
四霉素 1100倍液 69.17±5.05b 22.43±5.67h
多抗霉素 1000倍液 58.75±1.25c 34.11±1.40g
琥胶肥酸铜 275倍液 45.42±5.64def 49.07±6.32def
氢氧化铜 1800倍液 34.58±1.44g 61.22±1.62c
喹啉铜 1500倍液 72.50±6.96b 18.69±7.80h
噻霉酮 700倍液 49.06±6.97de 44.99±7.82ef
噻唑锌 1000倍液 41.25±3.75efg 53.74±4.21cde
CK - 89.17±1.91a -
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用
<130> GNCYX210466
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1565
<212> DNA
<213> Paenibacillus peoriae
<400> 1
ttaatggaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60
gtcgagcggg gttgtgtaga agcttgcttc taaacaacct agcggcggac gggtgagtaa 120
cacgtaggca acctgcccac aagacaggga taactaccgg aaacggtagc taatacccga 180
tacatccttt tcctgcatgg gagaaggagg aaagacggag caatctgtca cttgtggatg 240
ggcctgcggc gcattagcta gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac gatgcgtagc 300
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactgcg actgagacac ggcccagact cctacgggag 360
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 420
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gccagggaag aacgtcttgt agagtaactg 480
ctacaagagt gacggtacct gagaagaaag ccccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 540
taatacgtag ggggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggct 600
cttttagtct ggtgtttaat cccgaggctc aacttcgggt cgcactggaa actggggagc 660
ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg 720
aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg ggctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg 780
tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg aatgctaggt 840
gttaggggtt tcgataccct tggtgccgaa gttaacacat taagcattcc gcctggggag 900
tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc agtggagtat 960
gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc tctgagcggt 1020
ctagagatag gcctttcctt cgggacagag gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatgc ttagttgcca 1140
gcaggtcaag ctgggcactc taagcagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1200
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtactacaa tggccggtac 1260
aacgggaagc gaaatcgcga ggtggagcca atcctagaaa agccggtctc agttcggatt 1320
gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg aattgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1380
cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttacaaca 1440
cccgaagtcg gtggggtaac ccgcaaggga gccagccgcc gaaggtgggg tagatgattg 1500
gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg gaaggtgcgg ctggatcacc tcctttctat 1560
ggaga 1565

Claims (10)

1.皮尔瑞俄类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）ZF390，其保藏编号为CGMCCNo.20322。
2.权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌的发酵产物。
3.含有权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌的菌剂。
4.权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂在抑制致病菌中的应用；所述致病菌为植物致病真菌或植物致病细菌。
5.权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂在制备致病菌抑制剂中的应用；所述致病菌为植物致病真菌或植物致病细菌。
6.一种致病菌抑制剂，其活性成分为权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂；所述致病菌为植物致病真菌或植物致病细菌。
7.权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用。
8.权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂在防治致病菌引起的植物病害中的应用；所述致病菌为植物致病真菌或植物致病细菌。
9.权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂在制备产品中的应用；所述产品的功能为防治致病菌引起的植物病害；所述致病菌为植物致病真菌或植物致病细菌。
10.一种产品，其活性成分为权利要求1所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌或权利要求2所述发酵产物或权利要求3所述菌剂；所述产品的功能为防治致病菌引起的植物病害；所述致病菌为植物致病真菌或植物致病细菌。
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