CN112625961B

CN112625961B - 一株短小芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112625961B
Application number: CN202011585926.3A
Authority: CN
Inventors: 邹丽芳; 黄梦桑; 李逸朗; 杨瑞环; 闫依超; 方园; 陈功友
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112625961A

Abstract

本发明涉及一株短小芽孢杆菌及其应用。所述短小芽孢杆菌株已于2020年8月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏名称为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)154‑2，保藏编号为CCTCC M 2020446。本发明的短小芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌具有显著的抑制效果，同时对水稻细菌性条斑病菌、香蕉细菌性枯萎病菌、豇豆枯萎病菌、辣椒斑点病菌、核桃细菌性黑斑病菌和小麦赤霉病菌等也表现广谱的抑菌活性，具有重要的生防应用前景。

Description

一株短小芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术应用领域，尤其是涉及一株短小芽孢杆菌及其应用。

背景技术

水稻是我国主要粮食作物之一，种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量约占全国粮食总产量的1/2(Abdullah AB.,Ito S.,Adhana K.Estimate of rice consumptionin Asian countries and the world towards 2050.Proceedings for Workshop andConference on Rice in the World at Stake[R].2006.)，水稻也是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。稻黄单胞菌的两个致病变种X.oryaze pv.oryaze(Xoo)和X.oryaze pv.oryzicola(Xoc)能够侵染水稻，并引起水稻白叶枯病(bacterial leafblight,BLB)和水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。这两种病害的存在和发展严重影响着水稻的高产稳产。

水稻白叶枯病是影响水稻安全、高效、绿色生产最为严重的细菌性病害之一，在水稻生产中发病广泛，经常在我国华南、华中、华东及其它东南亚地区爆发，水稻感染病害后会减产20％-50％，严重时可达90％(Ou,S,H.,Rice diseases.CommonwealthAgricultural Bureau,Kew Surrey[J].1985)。水稻条斑病多发生在亚洲和非洲等水稻种植区，在我国，该病害主要在华南两季稻区和华中单双混栽稻区中广泛流行，现已成为我国水稻上的主要病害(张荣胜,陈志谊,刘永锋.水稻细菌性条斑病研究进展[J].江苏农业学报,2014,30(04):901-908.)。水稻感病后的产量损失与天气相关，天气适宜时发病减产20％左右，而在暴风雨条件下病害发生比较严重，减产可达到30％以上(Zou,L,F.,Wang,X,P.,Xiang,Y.,etc.,Elucidation of the hrp clusters of Xanthomonas oryzaepv.oryzicola that control the hypersensitive response in nonhost tobacco andpathogenicity in susceptible hose rice[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(9),pp 6212-24.)。

水稻白叶枯病和条斑病不仅突发性强，流行速度快，而且防治较为困难，目前主要的防治方法是化学与生物防治相结合，选育抗病品种和改善栽培技术相结合。药剂防治依然是当前防治该病的不可缺少的重要手段，但药剂对两种病害的防治效果一直都不理想，主要表现在可用的药剂品种资源匾乏，药剂活性低，尤其对水稻条斑病的防治药剂更少，多使用铜制剂和锌制剂，但长此以往对生态环境的破坏较大(刘姮,李雪琴.水稻细菌性条斑病的研究概述[J].湖北植保,2011(05):51-54.)。迄今为止共发现和鉴定了42个水稻抗白叶枯病基因(Liang L.Q.,Wang C.Y.,Zeng L.X.,et al.The rice cultivarBaixiangzhan harbours a recessive gene xa42(t)determining resistance againstXanthomonas oryzae pv.oryzae[J].Plant Breeding,2017,136(5):603-609.)，其中报道较多的有Xa13(Suh J P,Jeung J U,Noh T H,et al.Development of breeding lineswith three pyramided resistance genes that confer broad-spectrum bacterialblight resistance and their molecular analysis in rice[J].Rice,2013,6(1):5.)、Xa21(徐福荣,汤翠风,余腾琼,叶昌荣,戴陆园.云南高原粳稻抗白叶枯病新品系云资抗21号的选育[J].分子植物育种,2005,3(3):307–313.)和Xa23(Chunlian Wang,Yinglun Fan,Chongke Zheng,Tengfei Qin,Xiaoping Zhang,Kaijun Zhao.High-resolution geneticmapping of rice bacterial blight resistance gene Xa23[J].Molecular Geneticsand Genomics,2014,289(5).)，研究者们进行大量的实验研究来选育水稻白叶枯病抗性品种，取得显著成果。但对于水稻条斑病抗性相关基因则知之甚少，且随着水稻连作和病原物的不断进化，含有抗病基因的水稻品种也正面临着抗性丧失的问题。因此在这两种病害的防治上还具有一定的局限性。

近年来，生物防治逐渐成为植物病理学研究领域的热点之一，一方面其对于环境的影响比较温和，另一方面其对病原菌有一定的特异性，也不易使病原菌产生抗性。何晨阳等(何晨阳,饶军华,王金生.水稻白叶枯病菌毒性基因缺失菌株的构建及其在植物病害生物防治中的作用[J].南京农业大学学报,1994.)通过对水稻白叶枯病菌的基因进行缺失，构建成遗传工程细菌，将其应用到病害的生物防治中，能够表现出一定的防病增产效果。田波等(田波,李卫,周世力.关于噬菌体在防治水稻白叶枯病上的研究[J].福建稻麦科技,2004.)利用噬菌体来防治白叶枯病,发现特殊的病原噬菌体能够显著地降低水稻白叶枯病的发病率。

因此，对于研究者来说，大力响应国家“预防为主、综合防治”的植物保护方针，从自然环境中筛选出对病害具有拮抗作用的生物资源，是一种值得探索的防治方法，也是一项具有重大意义的工作。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一株短小芽孢杆菌及其应用。本发明的短小芽孢杆菌对水稻黄单胞菌、水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌具有显著的拮抗作用。本发明的短小芽孢杆菌可以为以后的水稻病害防治提供参考。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一方面是：提供一株短小芽孢杆菌，分离自宁夏固原市原州区王涝坝村东小麦地土壤，命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)154-2，所述短小芽孢杆菌已于2020年8月24日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 2020446；保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

通过固体培养基平板培养，观察所述短小芽孢杆菌的菌落颜色为乳黄色，边缘光滑，不规则，表面干燥粗糙，不透明；通过显微镜观察，该菌株的菌体为短杆状，可产生芽孢。

通过生理生化测试，明确所述短小芽孢杆菌是一株革兰氏阳性细菌，短杆状，能产生芽孢，需氧或兼性厌氧细菌。所述短小芽孢杆菌能够分泌β-半乳糖苷酶、3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇和明胶酶；不能水解精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、柠檬酸钠和硫代硫酸钠等；不能够氧化葡萄糖、甘露醇、鼠李糖和蔗等；能够利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、果糖和甘露糖等20种碳源产酸。

所述短小芽孢杆菌对水稻黄单胞菌具有拮抗作用。

所述水稻黄单胞菌包括水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)两个致病变种。

所述短小芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌具有拮抗作用。

通过平板对峙培养方法，检测短小芽孢杆菌154-2对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的拮抗作用，证明其对2类病原菌均表现广谱的拮抗活性。

进一步，检测了该短小芽孢杆菌对另外8种病原黄单胞菌的拮抗作用，证明其对香蕉细菌性枯萎病菌、豇豆枯萎病菌、辣椒斑点病菌等8株植物病原菌也具有拮抗活性；对重要的植物病原细菌丁香假单胞菌DC3000、水稻穗枯病菌和西瓜果斑病菌ZZ-1具有拮抗活性；对植物病原真菌小麦赤霉病菌具有拮抗活性。

本发明的第二方面是：提供所述短小芽孢杆菌的分离方法：采用梯度稀释涂板法，将土样加无菌水溶解震荡20min，依次稀释成不同梯度的土壤菌悬液，分别涂布于已接种水稻条斑病菌的NA平板上，观察是否有抑菌圈产生，将能产生明显抑菌圈的菌落在NA平板上划线得到单菌落，利用细菌16S rRNA基因进行PCR扩增，并构建系统进化树，明确该菌株的分类地位。

菌株154-2的16SrRNA基因如SEQ ID NO.1所示。

本发明使用16S rRNA基因构建系统进化树，进行亲缘关系的比较分析，并结合菌株的生理生化特征，证明该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

本发明的第三方面是：提供所述短小芽孢杆菌的应用，包括以下应用：

在本发明的一个具体实施方式中，所述短小芽孢杆菌154-2对水稻白叶枯病菌Xoo和水稻条斑病菌Xoc均具有广谱的拮抗作用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述短小芽孢杆菌154-2对水稻白叶枯病菌具有显著的拮抗作用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述水稻白叶枯病菌包括XZ35、YC11、XC18、JC1、PXO99^A、AH1、JL3、7919、LYG46。

在本发明的一个具体实施方式中，所述短小芽孢杆菌154-2对水稻条斑病菌具有拮抗作用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述水稻条斑病菌包括HANB12-26、HNB07-3、JSB1-39、YNB21、RS105、GDB3-087、ZJB01-25、RS85、YNB01-3。

在本发明的一个具体实施方式中，所述短小芽孢杆菌154-2对多种黄单胞属的其他植物病原细菌具有拮抗作用，具体包括香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestrispv.musacearum)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、核桃细菌性黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)、大豆疮痂病菌(X.axonopodis pv.glycines)、棉花细菌性角斑病(X.campestrispv.malvacearum)、菜豆枯萎病菌(X.campestris pv.phaseoli)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述短小芽孢杆菌154-2对重要的植物病原细菌具有拮抗作用，植物病原细菌包括丁香假单胞菌DC3000、水稻穗枯病菌和西瓜果斑病菌ZZ-1。

在本发明的一个具体实施方式中，所述短小芽孢杆菌154-2对植物病原真菌包括小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀病菌(Fusarium oxysporium)具有拮抗作用。

与现有技术相比，本发明提供的短小芽孢杆菌154-2，对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌均具有显著的拮抗作用，对目前常见的多种黄单胞菌属的病原细菌具有拮抗效果，而且对重要的植物病原细菌和真菌也具有拮抗活性，为现今农业生产上的多种植物细菌病害的生物防治提供了新资源。

附图说明

图1.短小芽孢杆菌154-2的显微镜(1000X)观察照片及菌落形态。

图2.短小芽孢杆菌154-2 16S rRNA基因序列比对结果以Micrococcus luteusDSM 20030T(AJ536198.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。

图3.16S rRNA基因的凝胶电泳结果。其中1代表Marker；2代表16S rRNA基因的产物。

图4.短小芽孢杆菌154-2对9株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)的拮抗效果图，A-I依次为XZ35、YC11、XC18、JC1、PXO99^A、AH1、JL3、7919、LYG46。

图5.短小芽孢杆菌154-2对9株水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)的拮抗效果图，A-I依次为HANB12-26、HNB07-3、JSB1-39、YNB21、RS105、GDB3-087、ZJB01-25、RS85、YNB01-3。

图6.短小芽孢杆菌154-2对其它8种植物病原黄单胞菌的拮抗效果图，A-H依次为香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestris pv.musacearum)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodispv.vignicola)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、核桃细菌性黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)、大豆疮痂病菌(X.axonopodis pv.glycines)、棉花细菌性角斑病(X.campestris pv.malvacearum)、菜豆枯萎病菌(X.campestris pv.phaseoli)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)。

图7.短小芽孢杆菌154-2对其它3种重要植物病原细菌的拮抗效果图，A：丁香假单胞菌DC3000(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst DC3000)；B：水稻穗枯病菌(Burkholderia glumae)；C：西瓜果斑病菌ZZ-1(Acidovorax avenaesubsp.citrulli.Aac)

图8.短小芽孢杆菌154-2对3种病原真菌的拮抗效果图；A为无菌水，B为发酵液；1：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，2：灰霉病菌(Botrytis cinerea)，3：尖孢镰刀病菌(Fusarium oxysporium)。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。

以下实施例中所用的菌种培养基如下：

牛肉膏蛋白胨培养基NA(g/L)：牛肉浸膏3g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母粉1g，琼脂粉15g，加水溶解并定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，高压灭菌(121℃、20min)。

PDA固体培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加入水溶解，最后定容至1000mL，pH 7.0-7.2，高压灭菌(121℃、20min)。

实施例1、短小芽孢杆菌154-2的获得

1、土壤来源

宁夏固原市原州区王涝坝村东小麦地土壤

2、菌株的筛选

(1)土样采集

Z字形5点采样法进行土样采集：每点采集200g土样，将土样混合均匀，以四分法取200g装入灭菌袋中，作为一个土样。每块地采集3个土样作为重复。记录好采样的时间、地点和种类。采集完成的土样置于4℃冰箱中保存，以备细菌分离所用。

(2)细菌的分离

平板稀释法：称取10g土样于锥形瓶中，加入90mL无菌水，然后在200rpm，28℃摇床中振荡，20min后取出静置在室温中10min，制成土壤菌悬液原液。将土壤菌悬液原液进行梯度稀释，分别得到10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，共6个梯度的菌悬液稀释液。各取200μL菌悬液稀释液，均匀涂布于含有水稻条斑病菌RS105的NA平板上，每个梯度做2～3个重复。放入28℃生化培养箱中，倒放培养24h，观察。

(3)细菌纯化

观察挑选出具有抑菌圈的单菌落，在NA平板上进行划线纯化，在28℃生化培养箱倒置培养，12h后挑取单菌落，依次编号。

(4)细菌的保存

将菌株接种在液体NA培养基中，在28℃、180rpm摇床中培养12h后，吸取1mL菌液与1mL 50％的无菌甘油，轻轻振荡混匀，置于-80℃长期保存。

(5)拮抗菌的筛选

采用牛津杯法：将病原菌接种在NA液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h，吸取200μL菌悬液与NA固体培养基充分混匀后，倒板，然后在NA平板中心放上直径为6mm的牛津杯，每个牛津杯内接50μL的供试芽孢杆菌液(OD600约2.0)，每株病原菌做2～3个重复，置于28℃的生化培养箱中培养24h，观察抑菌圈的有无，记录菌株编号并测量抑菌圈大小，整理拍照。

最终筛选出短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)154-2，所述短小芽孢杆菌已于2020年8月24日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M2020446。

短小芽孢杆菌154-2的显微镜(1000X)观察照片及菌落形态如图1所示。

实施例2短小芽孢杆菌154-2的16S rRNA基因鉴定

提取菌株154-2的基因组DNA，

利用引物：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，以获得目的片段。PCR反应体系为：

表1 Taq聚合酶链式反应体系

PCR反应基本条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s(1kb/min)，72℃预延伸8min，4℃保存，共30个循环。反应结束后，PCR产物均通过1％琼脂糖凝胶电泳检验，利用凝胶成像仪检测并记录结果，16S rRNA基因的凝胶电泳结果如图3所示，图3中1代表Marker；2代表16S rRNA基因的产物。将PCR原液送铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。测序结果运用DNA Star进行分析，并在NCBI网站上进行BLAST比对，确定近缘株细菌的种属。

菌株154-2的16SrRNA基因如SEQ ID NO.1所示。

短小芽孢杆菌154-2 16S rRNA基因序列比对结果以Micrococcus luteusDSM20030T(AJ536198.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树如图2所示，结果显示：菌株154-2的16SrRNA基因与Bacillus pumilus具有99.31％的相似度。

实施例3短小芽孢杆菌154-2的生理生化鉴定

本发明的短小芽孢杆菌154-2的生理生化特征为：能够分泌β-半乳糖苷酶、3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇和明胶酶；不能水解精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、柠檬酸钠和硫代硫酸钠等；不能够氧化葡萄糖、甘露醇、鼠李糖和蔗等；能够利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、果糖和甘露糖等20种碳源产酸，见表2和表3。

表2菌株154-2生理生化特性–酶活、碳源氧化

+：阳性反应；-：阴性反应；

表3菌株154-2生理生化特性–利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；W:弱阳性反应

实施例4、短小芽孢杆菌154-2的拮抗谱测定

1)短小芽孢杆菌154-2对9种水稻白叶枯病菌的拮抗活性测定

将9种不同的水稻水稻白叶枯病菌和供试短小芽孢杆菌154-2分别接种于NA液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h后，统一OD₆₀₀均为2.0；分别吸取200μL对应的病原菌液与NA固体培养基充分混匀后，倒板，然后在NA平板中心放上直径为6mm的牛津杯，每个牛津杯内接50μL的供试菌，每个病原菌做2～3个重复，置于28℃的生化培养箱中，培养24h后观察抑菌圈的有无，并记录抑菌圈大小，整理拍照。

短小芽孢杆菌154-2对9株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的拮抗效果图如图4所示，图4中，A-I依次为XZ35、YC11、XC18、JC1、PXO99^A、AH1、JL3、7919、LYG46。

短小芽孢杆菌154-2对不同水稻白叶枯病菌的抑菌效果如表4所示。

表4短小芽孢杆菌154-2对不同水稻白叶枯病菌的抑菌效果

2)短小芽孢杆菌154-2对9种水稻条斑病菌的拮抗活性测定

将9种不同的水稻条斑病菌和供试短小芽孢杆菌154-2分别接种于NA液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h后，统一OD₆₀₀均为2.0；分别吸取200μL对应的病原菌液与NA固体培养基充分混匀后，倒板，然后在NA平板中心放上直径为6mm的牛津杯，每个牛津杯内接50μL的供试菌，每个病原菌做2～3个重复，置于28℃的生化培养箱中，培养24h后观察抑菌圈的有无，并记录抑菌圈大小，整理拍照。

短小芽孢杆菌154-2对9株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的拮抗效果如图4所示，图4中，A-I依次为XZ35、YC11、XC18、JC1、PXO99^A、AH1、JL3、7919、LYG46。

短小芽孢杆菌154-2对9株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的拮抗效果数据见表5。

表5短小芽孢杆菌154-2对不同水稻条斑病菌的抑菌效果

3)短小芽孢杆菌154-2对8种植物病原黄单胞菌的拮抗活性测定

将香蕉细菌性枯萎病菌、豇豆枯萎病菌、辣椒斑点病菌等8种植物病原黄单胞菌和供试短小芽孢杆菌154-2分别接种于NA液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h后，统一OD₆₀₀均为2.0；分别吸取200μL对应的病原菌液与NA固体培养基充分混匀后，倒板，然后在NA平板中心放上直径为6mm的牛津杯，每个牛津杯内接50μL的供试菌，每个病原菌做2～3个重复，置于28℃的生化培养箱中，培养24h后观察抑菌圈的有无，并记录抑菌圈大小，整理拍照。

短小芽孢杆菌154-2对其它8种植物病原黄单胞菌的拮抗效果如图6所示，图6中A-H依次为香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestris pv.musacearum)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、核桃细菌性黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)、大豆疮痂病菌(X.axonopodispv.glycines)、棉花细菌性角斑病(X.campestris pv.malvacearum)、菜豆枯萎病菌(X.campestris pv.phaseoli)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)。

短小芽孢杆菌154-2对其它8种植物病原黄单胞菌的拮抗效果数据见表6所示。

表6短小芽孢杆菌154-2对8种植物病原黄单胞菌的抑菌效果

4)短小芽孢杆菌1542对3种重要的植物病原细菌的拮抗活性测定

将丁香假单胞菌DC3000、水稻穗枯病菌和西瓜果斑病菌ZZ-1和供试短小芽孢杆菌154-2分别接种于NA液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h后，统一OD₆₀₀均为2.0；分别吸取200μL对应的病原菌液与NA固体培养基充分混匀后，倒板，然后在NA平板中心放上直径为6mm的牛津杯，每个牛津杯内接50μL的供试菌，每个病原菌做2～3个重复，置于28℃的生化培养箱中，培养24h后观察抑菌圈的有无，并记录抑菌圈大小，整理拍照。

短小芽孢杆菌154-2对其它3种重要植物病原细菌的拮抗效果参考图7所示，图7中，A：丁香假单胞菌DC3000(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst DC3000)；B：水稻穗枯病菌(Burkholderia glumae)；C：西瓜果斑病菌ZZ-1(Acidovorax avenaesubsp.citrulli.Aac)。

结果显示，短小芽孢杆菌154-2对丁香假单胞菌DC3000的抑菌率为68.83％，对水稻穗枯病菌的抑菌率为61.29％，对西瓜果斑病菌ZZ-1的抑菌率为44.19％。

5)短小芽孢杆菌154-2对3种植物病原真菌的拮抗活性测定

采用平板划线对峙培养法，将小麦赤霉病菌、灰霉病菌、禾谷镰刀菌分别在PDA培养基上培养，待病原菌长满平板后，用打孔器在平板边缘打取菌块备用，取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA平板中央，在菌饼左右等距离(20mm)使用供试短小芽孢杆菌154-2划线，每条划线长度为30mm，每个处理3个重复，同时，以不接短小芽孢杆菌154-2，只接无菌水的平板为对照。在25℃培养箱中进行培养，5天后观察并记录抑菌现象。

短小芽孢杆菌154-2对3种病原真菌的拮抗效果如图8所示，图8中，A为无菌水，B为发酵液；1：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，2：灰霉病菌(Botrytis cinerea)，3：尖孢镰刀病菌(Fusarium oxysporium)。

结果显示，短小芽孢杆菌154-2对小麦赤霉病菌具有显著的抑制效果，抑菌率为45.74％；而其对灰霉病菌和禾谷镰刀病菌的效果则不明显，与对照组无显著差异。

由此，利用本发明提供的一株短小芽孢杆菌154-2，对水稻白叶枯病菌Xoo具有显著的拮抗作用，对水稻条斑病菌Xoc具有广谱的抑菌效果，而且对多种黄单胞菌属的病原细菌、重要的植物病原细菌和也具有拮抗作用，为水稻细菌病害的生物防治提供了新资源。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一株短小芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> 短小芽孢杆菌( Bacillus pumilus)

<400> 1

ccggcgcgtg ctatacatgc aagtcgagcg gacagaaggg agcttgctcc cggatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggagcta ataccggata gttccttgaa ccgcatggtt caaggatgaa agacggtttc 180

ggctgtcact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtggggta atggctcacc 240

aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

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caagtgcgag agtaactgct cgcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540

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gcagagt 1447

Claims

1.一株短小芽孢杆菌，其特征在于，命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）154-2，所述短小芽孢杆菌已于2020年8月24日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020446。

2.如权利要求1所述的一株短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌作为水稻白叶枯病菌拮抗菌和和水稻条斑病菌拮抗菌的应用。

3.如权利要求1所述的一株短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌作为植物病原黄单胞菌拮抗菌的应用；所述植物病原黄单胞菌选择香蕉细菌性枯萎病菌、豇豆枯萎病菌、辣椒斑点病菌、核桃细菌性黑斑病菌、大豆疮痂病菌、棉花细菌性角斑病、菜豆枯萎病菌或甘蔗流胶病菌。

4.如权利要求1所述的一株短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌作为植物病原细菌拮抗菌的应用，所述植物病原细菌选自丁香假单胞菌DC3000或水稻穗枯病菌。

5.如权利要求1所述的一株短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌作为小麦赤霉病菌拮抗菌的应用。