CN112608868B

CN112608868B - 一株高地芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112608868B
Application number: CN202011532143.9A
Authority: CN
Inventors: 邹丽芳; 黄梦桑; 李逸朗; 杨瑞环; 闫依超; 方园; 周琦; 陈功友
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112608868A

Abstract

本发明涉及一株高地芽孢杆菌及其应用。该高地芽孢杆菌已于2020年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，样品名称为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)181‑7，保藏编号为CGMCC No.20132，该菌株分离于中国海南省海口市海甸港湾花园辣椒地土样中。本发明的高地芽孢杆菌181‑7对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病表现出抑菌作用，同时对香蕉细菌性枯萎病菌、菜豆枯萎病菌、大豆疮痂病菌等以及一些病原真菌如灰霉病菌、疫霉病菌和禾谷镰刀病菌等也具有抑菌效果。本发明结果表明该菌株具有广谱的抑菌能力，为防治水稻白叶枯病和细菌性条斑病提供了良好的生防资源，为挖掘新型的微生物菌剂打下了基础。

Description

一株高地芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一株高地芽孢杆菌及其应用。

背景技术

世界上约有一万多个水稻品种(Yu Y,Streubel J,Balzeruge S,etal.Colonization of rice leaf blades by an African strain of Xanthomonasoryzae pv.oryzae depends on a new tal effector that induces the rice nodulin-3Os11N3 gene.Molecular Plant Microbe Interaction[J].2011)，现今全球越有近一半人口以水稻作为主食，并且也是我国主要的粮食作物，在我国的种植面积约占粮食作物种植总面积的30％。由稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下两个致病变种所引起的病害：水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)和水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)是目前水稻上两种最严重的细菌病害，广泛发生于我国广东、福建、湖南、江西等南方稻区，严重制约我国水稻粮食的生产安全。

水稻白叶枯病是我国水稻三大病害之一，由水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)通过水稻的水孔以及伤口进入水稻叶片维管束组织中，并成功定殖和繁殖，之后沿维管束扩展，造成水稻叶片褪绿，变成枯白色，严重影响光合作用，使得水稻减产20％-60％。(Nino-Liu D.O.,Ronald P.C.,BogdanoveA.J.Xanthomonas oryzae pathovars:model pathogens of a model crop.MolecularPlant Pathology[J].2006)。而水稻细菌性条斑病是水稻生产中一种重要的检疫性病害，由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，简称Xoc)引起。病菌通过孔和伤口侵入，侵入后在气孔下繁衍扩展到薄壁组织细胞间隙，并纵向扩展，形成条斑。流行性、爆发性和毁灭性是其发生的主要特点。当遇到适宜的气候条件时，能在感病品种上能引起15％-25％的产量损失，严重时可达到40％-60％，严重威胁着水稻的高产稳产。(MakinoS,Sugio A,White F,et al.Ihhibition of resistance gene-mediated defensein rice by Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Mol Plant Microbe In[J].2004)。

目前在农业生产上，防治水稻白叶枯病主要有以下几种方式：一是抗生素类药物，比如噻菌铜、链霉素等。二是培育抗病品种；三是生物防治。前两种方式都有自己的局限性，抗生素药物的使用容易造成环境的污染；培育抗病品种作为目前最主要的防治白叶枯病的手段，但培育新品种往往需要较长的时间，而且长期单一抗病基因品种的使用会导致病菌产生新的变异；生物防治作为一种可持续的，无害的，耗资少的防治手段受到人们的广泛关注，目前已经被报道的生防菌株Bacillus spp.(El-Shakh A.S.A.,Kakar K.U.,Xiao W.,et al.Controlling bacterial leaf blight of rice and enhancing the plantgrowth with endophytic and rhizobacterial Bacillus strains.Toxicological&Environmental Chemistry Reviews[J].2015)；Pseudomonas spp.(Velusamy P.,Immanuel JEGnanamanickam S.S.,Thomashow L.Biological control of ricebacterial blight by plant-associated bacteria producing 2,4-diacetylphloroglucinol.Canadian Journal of Microbiology[J].2006)；Lysobacterantibioticus sp.(Ji G.-H.,Wei L.-F.,He Y.-Q.,et al.Biological control of ricebacterial blight by Lysobacter antibioticus strain 13-1.Biological Control[J].2008)可以用来防治水稻白叶枯病。这些菌株大都分离自水稻的根际土壤中或者水稻植株内部。对于控制水稻细条病危害所采取的防治措施与白叶枯病大体上相同，主要依赖噻唑类杀菌剂，如20％的叶枯唑10％的叶枯净等。国内对细条病的化学防治有较为广泛的研究，尤其在农药混配、复配方面报道甚多。孙春明(孙春明,郑结彬,徐进才.20％噻唑锌SC防治水稻细菌性条斑病药效研究.安徽农学通报[J].2009)和吴怀刚等(吴怀刚,沈言根,唐国安等.5％辛菌胺乳油防治水稻细菌性条斑病药效试验.现代农业科技[J].2010.)分别用20％噻唑锌SC、20％叶枯灵、50％灭菌成和5％的辛菌胺乳油75.0～97.5g/hm2进行试验，都取得了较为理想的防治效果。目前种植抗病品种是控制细条病最经济有效的措施。病害发生区应因地制宜选育和换栽抗(耐)病品种培育含有主效抗病基因的水稻品种控制条斑病最有效的手段，但随着水稻连作和病原物的不断进化，含有抗病基因的水稻品种也正面临着抗性丧失的问题。在农业生产过程中，这两种病害的防治依旧存在很大的局限性，除了缺乏优良稳定的抗病品种之外，长期使用化学试剂对生态环境造成了一定的破坏，因此，能够从生态环境当中筛选出能够与水稻白叶枯病菌和条斑病相拮抗的微生物，并将其研制成微生物菌剂，找到能够平衡生态环境和病害防治的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高地芽孢杆菌及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一株高地芽孢杆菌，命名为高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)181-7，已于2020年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.20132。

所述高地芽孢杆菌分离于中国海南省海口市海甸港湾花园辣椒地土样中。

对所述高地芽孢杆菌进行生理生化测定：固体平板上培养，该菌株的菌落为乳白色，边缘不光滑，不规则，表面干燥粗糙，不透明。光学显微镜下观察，该菌株的细胞呈杆状，革兰氏染色为阳性。

生理生化测试结果显示，该高地芽孢杆菌对D-果糖-6-磷酸、D-纤维二糖、D-半乳糖醛酸、葡糖醛酰胺、β-甲基-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、a-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-蜜二糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、肌苷、D-甘露醇、甘油、龙胆二糖、蔗糖、D-天冬氨酸、D-海藻糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶、水苏糖、D-葡糖酸、D-棉子糖、奎宁酸、L-乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、D-苹果酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、γ-氨基丁酸具有酶活性。

但该高地芽孢杆菌不能够氧化D-葡糖-6-磷酸、β-羟基-D,L-丁酸、L-半乳糖酸内脂、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸-L-脯氨酸、3-甲基-D-葡萄糖、p-羟基苯乙酸、N-乙酰-D—半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、L-鼠李糖、D-山梨醇、肌醇、D-丝氨酸、明胶、L-组氨酸、松二糖、α-D-乳糖、粘酸、糖质酸、D-麦芽糖、丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、吐温40、α-羟丁酸、糊精、α-丁酮酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸和甲酸。

将该高地芽孢杆菌在NA平板上进行划线纯化；利用细菌通用引物进行16S rRNA基因的扩增，PCR产物送测后获得的基因序列在NCBI中进行比对分析，并使用MEGA(6.0)软件该菌株的系统发育树，明确该菌株的分类地位。

本发明所述高地芽孢杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，本发明所述高地芽孢杆菌的gyrB基因序列如SEQ ID NO.2所示。同时在NCBI网站上进行BLAST比对，确定近缘细菌菌株的分类地位。比对结果显示：菌株181-7与高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)具有97％的亲缘关系。

本发明第二方面，提供所述高地芽孢杆菌的分离方法，从中国海南省海口市海甸港湾花园辣椒地土样中筛选到一株能够抑制水稻白叶枯病菌生长的菌株，将该菌株在NA平板上进行划线纯化，筛选获得样品名称为Bacillus altitudinis 181-7的高地芽孢杆菌。

本发明第三方面，提供所述高地芽孢杆菌的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述高地芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo)具有较好的拮抗作用。因此，提供所述高地芽孢杆菌作为水稻白叶枯病菌拮抗菌的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述水稻白叶枯病菌包括：YN04-1、AH1、PXO99^A、XZ35、XC18、LYG46、JL3、YC11、JC1。所述高地芽孢杆菌对多株水稻白叶枯病菌具有拮抗活性。

在本发明的一个实施方式中，所述高地芽孢杆菌对水稻条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola，Xoc)均具有较好的拮抗作用。因此，提供所述高地芽孢杆菌作为水稻条斑病菌拮抗菌的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述水稻条斑病菌包括：RS105、HNB07-3、JSB1-39、AHB3-7、RS85、HANB12-26、HNB3-17、ZJB01-25、YNB01-3。所述高地芽孢杆菌对多株水稻条斑病菌具有拮抗活性。

在本发明的一个实施方式中，所述高地芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo)和条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)均具有较好的拮抗作用。因此，提供所述高地芽孢杆菌作为水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌拮抗菌的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述高地芽孢杆菌对植物病原黄单胞菌具有较好的拮抗活性。因此，提供所述高地芽孢杆菌作为植物病原黄单胞菌拮抗菌的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述植物病原黄单胞菌包括香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestris pv.musacearum)、菜豆枯萎病菌(X.campestris pv.phaseoli)、大豆疮痂病菌(X.axonopodis pv.glycines)、核桃细菌性黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)、棉花细菌性角斑病(X.campestris pv.malvacearum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodispv.allii)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodispv.vignicola)、丁香假单胞菌DC3000(Pseudomonas syringae pathovar tomato,PstDC3000)。

在本发明的一个实施方式中，所述高地芽孢杆菌对植物病原真菌具有较好的拮抗活性。因此，提供所述高地芽孢杆菌作为植物病原真菌拮抗菌的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述植物病原真菌包括灰霉病菌(Botrytiscinerea)、疫霉病菌(Phytophthora capsici)和禾谷镰刀病菌(Fusarium graminearum)。

整体而言，所述高地芽孢杆菌作为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)、条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)、植物病原黄单胞菌以及一些病原真菌拮抗菌的应用。可以作为对水稻白叶枯病菌和条斑病菌等具有防治效果的生防菌株。

本发明所采取的技术方案包括：

(1)菌株的分离与鉴定：从中国海南省海口市海甸港湾花园辣椒地土样中筛选到一株能够抑制水稻白叶枯病菌生长的菌株，将该菌株在NA平板上进行划线纯化；利用细菌通用引物进行16S rRNA基因的扩增，PCR产物送测后获得的基因序列在NCBI中进行比对分析，并使用MEGA(6.0)软件该菌株的系统发育树，明确该菌株的分类地位。

(2)生理生化测定：固体平板上培养，该菌株的菌落为乳白色，边缘不光滑，不规则，表面干燥粗糙，不透明。光学显微镜下观察，该菌株的细胞呈杆状，革兰氏染色为阳性。生理生化测试结果显示，该高地芽孢杆菌对D-果糖-6-磷酸、D-纤维二糖、D-半乳糖醛酸、葡糖醛酰胺、β-甲基-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、a-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-蜜二糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、肌苷、D-甘露醇、甘油、龙胆二糖、蔗糖、D-天冬氨酸、D-海藻糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶、水苏糖、D-葡糖酸、D-棉子糖、奎宁酸、L-乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、D-苹果酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、γ-氨基丁酸具有酶活性；但其不能够氧化D-葡糖-6-磷酸、β-羟基-D,L-丁酸、L-半乳糖酸内脂、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸-L-脯氨酸、3-甲基-D-葡萄糖、p-羟基苯乙酸、N-乙酰-D—半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、L-鼠李糖、D-山梨醇、肌醇、D-丝氨酸、明胶、L-组氨酸、松二糖、α-D-乳糖、粘酸、糖质酸、D-麦芽糖、丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、吐温40、α-羟丁酸、糊精、α-丁酮酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸和甲酸。

(3)通过牛津杯法进行检测，发现该高地芽孢杆菌181-7对9株水稻白叶枯病病菌包括：YN04-1、AH1、PXO99^A、XZ35、XC18、LYG46、JL3、YC11、JC1具有拮抗作用。

(4)通过牛津杯法检测，发现该高地芽孢杆菌181-7对9株水稻条斑病菌和9株其他病原黄单胞菌具有拮抗活性；水稻条斑病菌包括：RS105、HNB07-3、JSB1-39、AHB3-7、RS85、HANB12-26、HNB3-17、ZJB01-25、YNB01-3；9种不同植物病原黄单胞菌包括：香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestris pv.musacearum)、菜豆枯萎病菌(X.campestris pv.phaseoli)、大豆疮痂病菌(X.axonopodis pv.glycines)、核桃细菌性黑斑病菌(X.campestrispv.juglandis)、棉花细菌性角斑病(X.campestris pv.malvacearum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodis pv.allii)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、丁香假单胞菌DC3000(Pseudomonas syringaepathovar tomato,Pst DC3000)。表明菌株181-7具有广谱的抑菌活性。

(5)通过平板对歭培养方法，检测了高地芽孢杆菌181-7对3种病原真菌(灰霉病菌，疫霉病菌和禾谷镰刀病菌)的拮抗作用，发现其对灰霉病菌具有明显的拮抗活性。

(6)本发明所述的高地芽孢杆菌181-7已于2020年6月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis181-7，保藏号为CGMCC No：20132。

与现有技术相比，本发明的高地芽孢杆菌181-7对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌表现出抑菌作用，同时高地芽孢杆菌对香蕉细菌性枯萎病菌、菜豆枯萎病菌、大豆疮痂病菌、以及灰霉病菌、疫霉病菌也具有抑菌效果。本发明结果表明该菌株具有广谱的抑菌能力，为防治水稻白叶枯病和条斑病提供了良好的生防资源，该菌在防治水稻病害上具有重要的意义，其生防潜力有待于进一步开发，为挖掘新型的微生物菌剂打下了基础。

附图说明

图1.菌株181-7基于16S rRNA基因序列比对结果构建的Neighbor-Joining系统发育树。

图2.高地芽孢杆菌181-7对9株不同的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)(A-I依次为YN04-1、AH1、PXO99^A、XZ35、XC18、LYG46、JL3、YC11、JC1)的拮抗效果图。

图3.高地芽孢杆菌181-7对9株水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)拮抗效果图；A-I依次为RS105、HNB07-3、JSB1-39、AHB3-7、RS85、HANB12-26、HNB3-17、ZJB01-25、YNB01-3。

图4.高地芽孢杆菌181-7对8株其他植物病原黄单胞菌的拮抗效果图；A-I依次为：香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestris pv.musacearum)、菜豆枯萎病菌(X.campestrispv.phaseoli)、大豆疮痂病菌(X.axonopodis pv.glycines)、核桃细菌性黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)、棉花细菌性角斑病(X.campestris pv.malvacearum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodis pv.allii)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodispv.vasculorum)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)。

图5.高地芽孢杆菌181-7对丁香假单胞菌DC3000(Pseudomonas syringaepathovar tomato,Pst DC3000)的拮抗效果图。

图6.高地芽孢杆菌181-7对灰霉病菌(Botrytis cinerea)的拮抗效果图，其中，A：灰霉病菌病菌；B：高地芽孢杆菌181-7与灰霉病菌的对歭培养效果图。

图7.高地芽孢杆菌181-7对疫霉病菌(Phytophthora capsici)的拮抗效果图，其中，A：疫霉病菌；B：高地芽孢杆菌181-7与疫霉病菌的对歭培养效果图。

图8.高地芽孢杆菌181-7对禾谷镰刀病菌(Fusarium graminearum)的拮抗效果图，其中，A：禾谷镰刀病菌；B：高地芽孢杆菌181-7与禾谷镰刀病菌的对歭培养效果图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。

以下实施例中所用的菌种培养基如下：

牛肉膏蛋白胨培养基NA(g/L)：牛肉浸膏3g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母粉1g，琼脂粉15g，加入水溶解，最后定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌(121℃、20min)。

PDA固体培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加入水溶解，最后定容至1000mL，pH 7.0-7.2，高压灭菌(121℃、20min)。

实施例1、高地芽孢杆菌181-7的分离、筛选与纯化

1、菌株来源

所使用的病原菌株均是由本实验室保存的菌株，且均是已经公开的菌株。

2、拮抗菌株的获得

(1)拮抗菌株的发现

在实验室中，从中国海南省海口市海甸港湾花园辣椒地土样中筛选到一株能够抑制水稻白叶枯病菌生长的菌株。

(2)菌株的纯化与保存

采用平板划线法：将能够抑制白叶枯病菌生长的菌落挑出，在新的NA平板上进行划线，置于28℃生化培养箱中，倒置培养12h以上，挑取单菌落，并编号为181-7。将菌株181-7接种在NA液体培养基中，在28℃、180rpm摇床中培养12h后，吸取1mL菌株的发酵液与1mL50％的无菌甘油，轻轻振荡混匀，置于-80℃长期保存。

(3)拮抗实验

采用牛津检测法：以水稻白叶枯病菌PXO99^A为指示病原菌，接种在NA液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h，将OD₆₀₀统一调整为2.0，然后吸取200μL菌悬液与NA固体培养基充分混匀后，倒板，然后在NA平板中央放置牛津杯(6*8*10)，并接入50μL的供试菌181-7(OD₆₀₀为2.0)，每个处理三个重复；以接灭菌水为对照。置于28℃的生化培养箱中正置培养24h，观察抑菌圈直径大小，记录菌株181-7对PXO99^A的拮抗活性，用于后续研究。

实施例2、菌株181-7的16S rRNA基因鉴定

使用细菌的通用引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，并以菌株181-7的基因组DNA为模板；按照表1中比例配制30μL PCR反应体系，进行PCR反应：

表1 Taq聚合酶链式反应体系

PCR反应基本条件设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃预延伸10min。PCR反应结束后，将菌株181-7扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检验，并利用凝胶成像仪检测图像，之后将PCR产物原液送铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。

所述高地芽孢杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述高地芽孢杆菌的gyrB基因序列如SEQ ID NO.2所示。

对获得的测序结果运用DNA Star软件进行分析，根据获得16S rRNA序列(如SEQID NO.1所述)，同时在NCBI网站上进行BLAST比对，确定近缘细菌菌株的分类地位。比对结果显示：菌株181-7与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)具有97％的亲缘关系。使用MEGA6.0构建菌株181-7的系统发育树，结果见附图1。

实施例3、菌株181-7的形态及生理生化鉴定

本发明的菌株181-7形态观察，发现菌株181-7的菌落为乳白色，边缘不光滑，不规则，表面干燥粗糙，不透明；革兰氏染色结果呈现的结果为阳性。本发明的菌株181-7的生理生化测试结果显示，该高地芽孢杆菌对D-果糖-6-磷酸、D-纤维二糖、D-半乳糖醛酸、葡糖醛酰胺、β-甲基-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、a-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-蜜二糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、肌苷、D-甘露醇、甘油、龙胆二糖、蔗糖、D-天冬氨酸、D-海藻糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶、水苏糖、D-葡糖酸、D-棉子糖、奎宁酸、L-乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、D-苹果酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、γ-氨基丁酸具有酶活性；但其不能够氧化D-葡糖-6-磷酸、β-羟基-D,L-丁酸、L-半乳糖酸内脂、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸-L-脯氨酸、3-甲基-D-葡萄糖、p-羟基苯乙酸、N-乙酰-D—半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、L-鼠李糖、D-山梨醇、肌醇、D-丝氨酸、明胶、L-组氨酸、松二糖、α-D-乳糖、粘酸、糖质酸、D-麦芽糖、丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、吐温40、α-羟丁酸、糊精、α-丁酮酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸和甲酸。(见表2和表3)。

表2菌株181-7Biolog GENⅢ(生长实验)

+：阳性反应；-：阴性反应；

表3菌株181-7Biolog GENⅢ(化学敏感实验)

阴性对照

+

1％乳酸钠

+

林可霉素

-

萘啶酸

-

十四烷硫酸钠

-

1％NaCl

+

盐酸胍

+

氯化锂

+

万古霉素

-

4％NaCl

+

夫西地酸

-

亚碲酸钾

+

醋竹桃霉素

-

8％NaCl

+

D-丝氨酸

+

氨曲南

+

利福霉素SV

-

pH 6.0

+

四唑紫

+

丁酸钠

+

二甲胺四环素

-

pH 5.0

+

四唑蓝

-

溴酸钠

+

+：不敏感；-：敏感

结合实施例2的系统发育树和实施例3的形态特征、生理生化的结果，最终将菌株181-7鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，并命名为高地芽孢杆菌181-7。所述高地芽孢杆菌181-7已于2020年6月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 181-7，保藏号为CGMCC No：20132。

实施例4、高地芽孢杆菌181-7的拮抗谱测定

1)高地芽孢杆菌181-7对9株水稻白叶枯病菌的拮抗活性测定

将9株水稻白叶枯病菌和供试高地芽孢杆菌181-7分别接种于NA液体培养基中，28℃、200rpm/min摇床中培养12h后，调整发酵菌液的OD₆₀₀值均为2.0左右；各吸取200μL的病原发酵菌液与NA固体培养基充分混匀后，制成带病菌的平板(含病菌的NA平板)，然后在含病菌的NA平板上中央放置一个灭菌的牛津杯，向其点接50μL的供试高地芽孢杆菌181-7，每个处理三个重复，以接灭菌水(ddH₂O)的为对照。待平板晾干后，置于28℃的培养箱中培养24-48h，观察是否有抑菌圈出现，并记录抑菌圈大小(表4)，效果图见附图2。

表4高地芽孢杆菌对白叶枯病菌的抑菌直径(mm)

2)高地芽孢杆菌181-7对9株水稻条斑病菌的拮抗活性测定

在NA液体培养基中分别接种9株水稻条斑病菌和供试高地芽孢杆菌181-7，28℃、200rpm/min的摇床中培养12h后，调整各发酵菌液的OD₆₀₀值均为2.0左右；各吸取200μL的病原发酵菌液与NA固体培养基充分混匀后，制成带病菌的平板(含病菌的NA平板)，然后在含菌的NA平板上中央放置一个灭菌的牛津杯，向其点接50μL的供试高地芽孢杆菌181-7，每个处理三个重复，以接灭菌水(ddH₂O)的为对照。待平板晾干后，置于28℃的培养箱中培养24-48h，观察是否有抑菌圈出现，并记录抑菌圈直径大小(表5)，抑菌效果见附图3。

表5高地芽孢杆菌181-7对条斑病菌的抑菌直径(mm)

3)高地芽孢杆菌181-7对其它不同植物病原细菌的拮抗活性测定

将9种不同的植物病原细菌和高地芽孢杆菌181-7分别接种于NA液体培养基中，28℃、200rpm/min摇床中培养12h后，调整发酵菌液的OD₆₀₀值均为2.0左右；各吸取200μL的病原发酵菌液与NA固体培养基充分混匀后，倒平板，然后在NA平板上中央放置一个灭菌的牛津杯，向其点接50μL的高地芽孢杆菌181-7，每个处理三个重复，以接灭菌水(ddH₂O)的为对照。待平板晾干后，置于28℃的培养箱中培养24-48h，观察是否有抑菌的作用，并记录有抑菌作用的抑菌效果。结果显示菌株181-7香蕉细菌性枯萎病菌、菜豆枯萎病菌、大豆疮痂病菌、核桃细菌性黑斑病菌、棉花细菌性角斑病、洋葱细菌性叶枯病菌、甘蔗流胶病菌、豇豆枯萎病菌和丁香假单胞菌DC3000具有拮抗效果，拮抗效果图如附图4、附图5。

表6高地芽孢杆菌181-7对11种植物病原细菌的抑菌直径(mm)

4)高地芽孢杆菌181-7对真菌性病害的拮抗活性测定

采用平板划线对峙培养法，将灰霉瘟病菌、疫霉病菌、禾谷镰刀菌分别在PDA培养基上培养，待病原菌长满平板后，用打孔器在平板边缘打取菌块备用，取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA平板中央，在菌饼左右等距离(20mm)使用供试高地芽孢杆菌181-7划线，每条划线长度为30mm，每个处理3个重复，同时，以不接高地芽孢杆菌181-7只接病原真菌的平板为对照。在25℃培养箱中进行培养，5天后观察并记录抑菌现象，抑菌情况如附图6、附图7和附图8。结果显示，高地芽孢杆菌181-7对灰霉病菌具有显著的抑制效果，抑菌率为64.53％；其对疫霉病菌、禾谷镰刀病菌的抑菌率分别为63.37％和48.84％。

由此，利用本发明提供的一株高地芽孢杆菌181-7，对稻黄单胞菌的两个致病变种：水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌均具有的拮抗作用，同时对香蕉细菌性枯萎病菌、菜豆枯萎病菌、大豆疮痂病菌等以及一些病原真菌如灰霉病菌、疫霉病菌等也表现较好的抑制效果，进而说明该菌株具有广谱的抑菌能力。为细菌性病害和真菌性病害的生物防治提供了新资源。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一株高地芽孢杆菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1339

<212> DNA

<213> 高地芽孢杆菌( Bacillus altitudinis )

<400> 1

ttcgggtgtt gcaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat 60

tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca 120

gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt gggattggct aaaccttgcg gtctcgcagc 180

cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg 240

acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa 300

tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac 360

acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgtcc ccgaagggaa agccctatct 420

ctagggttgt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac 480

cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc 540

gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct 600

aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc 660

ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt 720

cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact 780

caagtttccc agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt 840

aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt 900

attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg 960

caagcagtta ctcttgcact tgttcttccc taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct 1020

tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg 1080

ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag 1140

gtcggctacg catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg 1200

ggtccatctg taagtgacag ccgaaaccgt ctttcatcct tgaaccatgc ggttcaagga 1260

actatccggt attagctccg gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc aggttaccca 1320

cgtgttactc acccgtccg 1339

<210> 2

<211> 1121

<212> DNA

<213> 高地芽孢杆菌( Bacillus altitudinis )

<400> 2

gtgctttctc taaagtgaag tcttctccga ttccagtccc tagcgctgta atcattgaac 60

gaacctcgtt gttagataaa attttatcta gtcgggcttt ttcaacgttt aggatcttcc 120

ctcttaacgg taagatcgct tggaaatgtc gatcacgacc ttgcttagca gatccgcccg 180

cagaatctcc ctctacgata taaagctcag agatggaaag gatctttaga agaacagtct 240

gccagtttcc caggcaagct agagacttcc agtgcacttt tacgtcttgt cagctcacgt 300

gcctttttgg gcagccattc ttgcacgagc tgccatcaca cctttctcca caattttctt 360

tcagcatcag ggttctctaa gaggaatttc tcaagtgctt cggagaagag ggagtcggta 420

atggttcttg cttctgagtt accgagcttt gtcttcgttt gtccttcgaa ttgagggtct 480

ggatgtttga tagagataat ggctgttaag ccttctcgta catcttcacc gctcaaattc 540

gagtctccat ctttgaatac gccattttta cgagcataat cattgatgac acgcgtcaga 600

ccggttttaa agccagcttc gtgtgatccg ccttcatatg tgttgatgtt attggcgaaa 660

gaataaatat tgcttgtata ggaatcgttg tattgcagtg caacttcaac ggtgattccg 720

tctttttcac cctcgatgta aactggttct tcatgaacga cttccttcga gcgattcaaa 780

tgttctacat agctcttaat accgccttca tagcagtatt cgtttcttcg ctctttgcct 840

tcacgtaagt cttcaatgat gatgttgacg ccttttgtta agaaagctaa ctcacgtaca 900

cggttagcaa gtgtgtcgta atcaaattca atggtttcag tgaaaatttc tggatctggc 960

acaaaatgag tgttgtccct gttacatctg tttcaccaat gatctctaaa tctccaactg 1020

gaacaccgcg tttgaattgt tgataatgaa tttttccatc acggtataca gtcacgtcta 1080

aggtcgtaga taacgcatta acaacagatg cccctacacc a 1121

Claims

1.一株高地芽孢杆菌，其特征在于，命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）181-7，已于2020年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 20132。

2.权利要求1所述高地芽孢杆菌在拮抗植物病原黄单胞菌中的应用，其特征在于，所述植物病原黄单胞菌选自香蕉细菌性枯萎病菌Xanthomonas campestris pv. musacearum、菜豆枯萎病菌Xanthomonas campestris pv. phaseoli、大豆疮痂病菌Xanthomonas axonopodis pv. glycines、核桃细菌性黑斑病菌Xanthomonas campestris pv.juglandis、棉花细菌性角斑病菌Xanthomonas campestris pv. malvacearum、洋葱细菌性叶枯病菌Xanthomonas axonopodis pv. allii、甘蔗流胶病菌Xanthomonas axonopodispv. Vasculorum和豇豆枯萎病菌Xanthomonas axonopodis pv. vignicola。

3.权利要求1所述高地芽孢杆菌在拮抗植物病原真菌中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌选自灰霉病菌Botrytis cinerea、疫霉病菌Phytophthora capsici和禾谷镰刀病菌Fusarium graminearum。