CN113430137B - 一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用。通过在一定培养阶段的芽孢杆菌菌悬液中添加金属铁离子提高芽孢杆菌生物膜的形成及抑制果实腐败菌的能力。在体外，含有金属化合物的菌悬液对水果腐败菌(扩展青霉、灰葡萄孢霉)的抑制效果显著增强；在体内，对樱桃番茄、枇杷、梨贮藏中腐败菌(扩展青霉、灰葡萄孢霉)的抑制能力明显提升。本发明建立生防菌株解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)生物被膜形成与其在生防作用中的联系，外源添加金属化合物显著提高解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成能力和对青霉、灰霉的体内及体外抑制作用；操作简单，易于实用，有助于解淀粉芽孢杆菌产品化。
Description
技术领域
本发明涉及生防细菌在果实采后病害的生物防治技术领域，具体是一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用。
背景技术
生物被膜是附着于惰性或活体表面的结构性细菌群落，其中的细菌被包裹在水合胞外聚合物基质网中。胞外聚合物主要是由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成，它们为生物被膜提供了机械稳定性，使细菌细胞互相连接并暂时固定不动。而胞外聚合物中营养物质的交换使得细菌形成相当厚度生物被膜的同时，仍保持单个细胞在最佳营养状态。
枯草芽孢杆菌作为一种非致病性革兰氏阳性菌，已成为研究生物被膜形成的模式生物。枯草芽孢杆菌具有复杂的调控网络，可以响应不断变化的环境条件来协调生物被膜基质相关基因的表达。研究显示枯草芽孢杆菌生物膜形成能力越强，防治植物病害效果越显著。因此，研究生物膜的形成能力及形成条件将有助于今后生防细菌的遗传改良研究及合理使用。
解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，与枯草芽孢杆菌亲缘性高，广泛分布于自然环境中。由于具有广谱的抑制真菌和细菌的活性，稳定性高，抗逆性强，且生长速度快，解淀粉芽孢杆菌被认为是一种非常理想的生防菌资源。解淀粉芽孢杆菌B4在静置条件下可以形成极为明显的生物被膜，且在分子功能一级类别中，有308个基因被注释到metal ionbinding，因此，在现有的生防能力的基础上，通过外源添加无害金属子提高其生物被膜的形成，从而实现抑制腐败病原菌能力的提升，为采后果实病害生物防治提供一种新的思路。
1.Costerton J W,Stewart P S,Greenberg E P.Bacterial biofilms:a commoncause of persistent infections[J].Science,1999,284(5418):1318-1322.
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发明内容
本发明的目的在于提供一种通过外源添加金属离子提高生防细菌抑制腐败菌的能力及在果实贮藏中的应用方法。该方法在外源无害的前提下，通过向菌悬液中加入金属铁离子，增强了芽孢杆菌生物被膜的形成，提高了芽孢杆菌在培养平板及果实中抑制病原菌的能力，降低了采后果实发病率，为增强菌株生防效用新方法奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，37℃，180-220rpm培养12-16h，得到解淀粉芽孢杆菌种子培养液；
所述解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:13466，保藏日期为2016年12月19日，该菌株记载在申请人早先申请的中国专利申请CN201710100745.9中；
(2)按照体积比1.0％-2.0％的比例接种种子培养液到LB液体培养基中，于37℃下培养4-6h后发酵结束，将发酵液于20-30℃，5000-10000g离心2-6min，得到菌体。
(3)将步骤(2)得到的菌体用含铁离子的LB液体培养基重悬，得含铁离子菌悬液。
优选的，所述步骤(3)中，用含有铁离子的LB液体培养基重悬至B4菌悬液浓度为1×104-1×107CFU/mL。
优选的，所述的铁离子在菌悬液中的浓度为0.3-1.0mM。
本发明提供了上述制备方法制备得到的用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液。
本发明进一步提供了上述含铁离子菌悬液用于抑制采后果实腐败病原菌的用途，其特征在于所述的铁离子存在形式为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁。
优选的，所述的果实为梨、枇杷、樱桃番茄。
优选的，所述的采后果实腐败病原菌包括：扩展青霉、灰葡萄孢霉。
本发明以下列任一方式应用于采后果实腐败病原菌的生物防治中：
方式A：将浓度为1×104-1×107CFU/mL的含铁离子菌悬液在喷洒在采后果实表面，使果实表面润湿；处理后，在室温，相对湿度40％-90％的条件下，静置晾干；
方式B：将采摘后的果实浸泡在浓度为1×104-1×107CFU/mL的含铁离子菌悬液中，浸泡时间为0.5-2.5分钟；处理后，在室温，相对湿度40％-90％的条件下，静置晾干。
此外，作为微生物发酵物，与生防领域内常见的化学品类和植物提取物类物质相比，其具有活性成分简单易得、价格低廉等优势。
本发明施用的外源铁离子有效增强了解淀粉芽孢杆菌生物膜的形成，提高了对不同水果(如枇杷、水晶梨、樱桃番茄)的采后病害的抑制能力。本发明具有安全高效的特点，对环境友好，生防作用效果突出，与常见外源添加物质相比，具有简单易得、价格低廉等优势，有利于促进生物防治剂的推广使用。
附图说明
图1本发明菌株B4的平板培养性状；
图2不同浓度的氯化铁对B4菌株生物被膜影响：(A)生物被膜形成过程，(B)生物被膜生物量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。
实例1：氯化铁对解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成的促进效应：
将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，在37℃、转速为180rpm的摇床中振荡培养12h，转接1mL菌液至50mL的LB液体培养基中，继续培养至OD600为0.5。图1为本发明中菌株B4的平板培养性状。
本实施例的平板培养基为LB固体培养基，其组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，用0.1mol/L的NaOH调节pH 7.4，在121℃下灭菌20min。
本实施例中的LB液体培养基，其组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、用0.1mol/L的NaOH调节pH 7.4，在121℃下灭菌20min。
将上述发酵液于6000g，27℃离心5min，在装有菌体沉淀的离心管中加入等体积的无菌LB液体培养基，振荡均匀，再次离心洗脱得到菌体。
再次用无菌LB液体培养基重悬菌体至解淀粉芽孢杆菌B4菌悬液浓度为1×107CFU/mL，备用。
在96孔U形微孔板中每孔加入150μL含有0.2mM、0.5mM、1.0mM三氯化铁的LB液体培养基，阴性对照组为等量的无菌LB液体培养基。按1:15的比例将上述处理过的菌悬液接种于96孔板中，即每孔加入10μL B4菌悬液，控制悬液浓度为1×106CFU/mL，每个处理3个重复，培养板置于37℃恒温培养箱中，定期观察生物被膜表型并拍照。
静置培养24h后，将生物被膜下的培养液吸出，用160μL蒸馏水冲洗微孔板2-3次后加入160μL 0.1％(w/v)结晶紫溶液染色，20min后除去结晶紫染色液。用蒸馏水洗涤微孔板至清水中不再呈现紫色后加入160μL 30％乙酸溶液将生物被膜完全溶解，稀释20倍并转移至酶标板中，在560nm下测定其吸光值，生物被膜生物量利用吸光值乘以稀释倍数来反映。
根据图2所示，随着添加氯化铁浓度的升高，解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成能力增强，生物被膜的生物量有所增加。
实例2：氯化铁提高解淀粉芽孢杆菌B4在梨、樱桃番茄、枇杷果实中抑制扩展青霉的效应：
扩展青霉(Penicillium expansum)孢子悬液的制备：用接种环挑一环致病霉菌，接入PDA试管斜面的培养基中传代至生长状态良好，置于25℃培养箱中培养7d后刮下部分孢子，悬浮于无菌生理盐水中，采用血球计数板计数确定孢子浓度，再用无菌生理盐水稀释至1×105conidia/mL，备用。
PDA培养基的制备：200g去皮马铃薯加适量蒸馏水煮沸20min，室温冷却后8层纱布过滤，于滤液中加入20g葡萄糖，再加入1.5％(w/v)琼脂，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌30min。
PDA培养基灭菌后冷却至50-60℃，加入相应浓度的氯化铁(终浓度0、0.2mM、0.5mM、1.0mM)，每个平板中倒入15mL培养基，待凝固后在平板中央加入5μL上述扩展青霉孢子悬液，置于25℃培养箱中培养并定期测定生长直径，每个处理三个重复。实验结果如表1所示，由表1可见，添加1mM以内浓度的氯化铁，扩展青霉的生长直径相差不大。方差分析显示添加1mM氯化铁与对照组有一定差异，但这是由于在平板中央滴加孢子悬液时，液滴因氯化铁浓度较高产生表面张力导致基础直径较小，所以生长直径表现出了差异。不同浓度氯化铁中，扩展青霉生长速率基本一致，测试浓度内氯化铁本身并不会抑制扩展青霉的生长。
B4菌悬液制备方式同实例1。
Fe-B4菌悬液的制备：用含有0.5mM三氯化铁的LB液体培养基将B4菌悬液稀释10倍，浓度1×106CFU/mL。
选取无机械损伤、未感染、大小和成熟度基本一致的同一批次的水晶梨27个，樱桃番茄171个，枇杷81个。用0.2％次氯酸钠浸泡消毒2min后冲洗干净。用灭菌后的打孔器在每个梨果实表面相同部位打孔，孔径为5mm，深度为3mm，每个梨果实打3个孔。用灭菌后的打孔器在每个枇杷、樱桃番茄果实表面相同部位打孔，孔径为3mm，深度为1.5mm，每个果实打1个孔。水晶梨9个为一组，每个处理三组平行。枇杷9个为一筐，樱桃番茄19个为一筐，一组处理三筐，每个处理三组平行。
水晶梨第一组在孔内加入20μL LB液体培养基，第二组在孔内加入20μL B4菌悬液，第三组在孔内加入20μL Fe-B4菌悬液。枇杷、樱桃番茄第一组在孔内加入10μL LB液体培养基，第二组在孔内加入10μL B4菌悬液，第三组在孔内加入10μL Fe-B4菌悬液。在室温下放置至孔内无明显液体(约2h)。
晾干后在每个水晶梨的伤口中接种20μL扩展青霉孢子悬液，在每个枇杷、樱桃番茄的伤口中接种10μL扩展青霉孢子悬液，待完全风干后用PE塑料保鲜膜密封，将果实贮藏于常温(25℃)下。从第3天开始每天定时观察果实发病情况，统计果实伤口发病率，结果以平均发病率(％)表示。
实验结果如表2、表3、表4所示。由表3、表3、表4可见，接种扩展青霉后在25℃储存3天时，水晶梨、枇杷、樱桃番茄未加解淀粉芽孢杆菌B4菌液的LB培养基空白组发病率已经高达96.30％、55.56％、88.23％，并且在第4天全部发病。加入B4菌液的对照组和在此基础上添加一定浓度的氯化铁处理组中，枇杷、樱桃番茄在第4天开始发病，梨果实直至第5天才开始发病，说明解淀粉芽孢杆菌B4对梨果实扩展青霉的发病抑制明显。与B4组相比，添加0.5mM氯化铁处理的水晶梨扩展青霉发病率在第5天下降18.52％，枇杷的发病率在第4天下降33.34％，樱桃番茄的发病率在第5天下降20.00％，以上结果表明氯化铁能在较大程度上提升B4对扩展青霉的发病抑制作用。
表1不同浓度氯化铁处理下扩展青霉生长直径
表2不同处理对梨果实中扩展青霉的发病影响
表3不同处理对枇杷果实中扩展青霉的发病影响
表4不同处理对樱桃番茄果实中扩展青霉的发病影响
实例3：氯化铁提高解淀粉芽孢杆菌B4在樱桃番茄、枇杷果实中抑制灰葡萄孢的效应：
灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子悬液的制备：用接种环于灰霉平板上挑取一环菌丝，接入PDA试管斜面的培养基中传代至生长状态良好，置于25℃培养箱中培养7d后刮下部分孢子，悬浮于无菌生理盐水中，采用血球计数板计数确定孢子浓度，再用无菌生理盐水稀释至1×105conidia/mL，备用。
Fe-B4菌悬液的制备同实例2。
枇杷、樱桃番茄的清洁处理同实例2。
枇杷、樱桃番茄的外源病害在实例3中采用的是灰葡萄孢菌孢子悬液。
实验结果如表4、表5所示，接种灰葡萄孢霉后在25℃储存3天时，枇杷、樱桃番茄未加解淀粉芽孢杆菌B4菌液的LB培养基空白组发病率已经高达88.89％、87.50％，并且在第4天全部发病。加入Fe-B4菌液的樱桃番茄在第5天开始发病，且与B4处理组相比，添加0.5mM氯化铁处理的枇杷灰葡萄孢的发病率在第3天、第4天、第5天分别下降55.56％、44.44％、33.33％。添加0.5mM氯化铁处理的樱桃番茄灰葡萄孢的发病率在第3天、第4天、第5天分别下降7.14％、8.57％、23.33％。以上结果表明氯化铁能明显提升B4对灰葡萄孢霉的发病抑制作用。
表4不同处理对枇杷果实中灰葡萄孢的发病影响
表5不同处理对樱桃番茄果实中灰葡萄孢的发病影响
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将解淀粉芽孢杆菌B4（Bacillus amyloliquefaciens B4）菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，37℃，180-220 rpm培养12-16 h，得到解淀粉芽孢杆菌种子培养液；
所述解淀粉芽孢杆菌B4（Bacillus amyloliquefaciens B4）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No: 13466，保藏日期为2016年12月19日；
（2）按照体积比1.0%-2.0%的比例接种种子培养液到LB液体培养基中，于37℃下培养4-6 h后发酵结束，将发酵液于20-30℃，5000-10000 g离心2-6 min，得到菌体；
（3）将步骤（2）得到的菌体用含铁离子的LB液体培养基重悬至B4菌悬液浓度为1×104-1×107 CFU/mL，得到含铁离子菌悬液；铁离子在菌悬液中的浓度为0.5-1.0 mM。
2.一种权利要求1所述制备方法制备得到的含铁离子菌悬液在抑制采后果实腐败病原菌的用途。
3.权利要求2所述的用途，其特征在于所述的铁离子存在形式为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁。
4.权利要求2所述的用途，其特征在于所述的果实为梨、枇杷、樱桃番茄。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的采后果实腐败病原菌包括：扩展青霉、灰葡萄孢霉。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：以下列任一方式应用于采后果实腐败病原菌的生物防治中：
方式A：将浓度为1×104-1×107 CFU/mL的含铁离子菌悬液在喷洒在采后果实表面，使果实表面润湿；处理后，在室温，相对湿度40%-90％的条件下，静置晾干；
方式B：将采摘后的果实浸泡在浓度为1×104-1×107 CFU/mL的含铁离子菌悬液中，浸泡时间为0.5-2.5分钟；处理后，在室温，相对湿度40%-90％的条件下，静置晾干。
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