CN113430137B - 一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113430137B CN113430137B CN202110783915.4A CN202110783915A CN113430137B CN 113430137 B CN113430137 B CN 113430137B CN 202110783915 A CN202110783915 A CN 202110783915A CN 113430137 B CN113430137 B CN 113430137B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fruit
- bacillus amyloliquefaciens
- bacterial suspension
- suspension
- biofilm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 45
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 23
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims abstract description 25
- -1 iron ion Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 241001123663 Penicillium expansum Species 0.000 claims abstract description 21
- 235000003953 Solanum lycopersicum var cerasiforme Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 240000003040 Solanum lycopersicum var. cerasiforme Species 0.000 claims abstract description 21
- 235000009008 Eriobotrya japonica Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 6
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 22
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 241001092070 Eriobotrya Species 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 13
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate Chemical compound [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 2
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 claims 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims 1
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 abstract description 14
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 abstract description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 abstract description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 abstract description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 2
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 abstract 2
- 244000061508 Eriobotrya japonica Species 0.000 abstract 1
- 240000001080 Grifola frondosa Species 0.000 abstract 1
- 235000007710 Grifola frondosa Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- PKFDLKSEZWEFGL-MHARETSRSA-N c-di-GMP Chemical group C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](N4C5=C(C(NC(N)=N5)=O)N=C4)O[C@@H]3COP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 PKFDLKSEZWEFGL-MHARETSRSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
- A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
- A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
- A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B7/155—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
- A23B7/16—Coating with a protective layer; Compositions or apparatus therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用。通过在一定培养阶段的芽孢杆菌菌悬液中添加金属铁离子提高芽孢杆菌生物膜的形成及抑制果实腐败菌的能力。在体外，含有金属化合物的菌悬液对水果腐败菌(扩展青霉、灰葡萄孢霉)的抑制效果显著增强；在体内，对樱桃番茄、枇杷、梨贮藏中腐败菌(扩展青霉、灰葡萄孢霉)的抑制能力明显提升。本发明建立生防菌株解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)生物被膜形成与其在生防作用中的联系，外源添加金属化合物显著提高解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成能力和对青霉、灰霉的体内及体外抑制作用；操作简单，易于实用，有助于解淀粉芽孢杆菌产品化。
Description
技术领域
本发明涉及生防细菌在果实采后病害的生物防治技术领域，具体是一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用。
背景技术
生物被膜是附着于惰性或活体表面的结构性细菌群落，其中的细菌被包裹在水合胞外聚合物基质网中。胞外聚合物主要是由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成，它们为生物被膜提供了机械稳定性，使细菌细胞互相连接并暂时固定不动。而胞外聚合物中营养物质的交换使得细菌形成相当厚度生物被膜的同时，仍保持单个细胞在最佳营养状态。
枯草芽孢杆菌作为一种非致病性革兰氏阳性菌，已成为研究生物被膜形成的模式生物。枯草芽孢杆菌具有复杂的调控网络，可以响应不断变化的环境条件来协调生物被膜基质相关基因的表达。研究显示枯草芽孢杆菌生物膜形成能力越强，防治植物病害效果越显著。因此，研究生物膜的形成能力及形成条件将有助于今后生防细菌的遗传改良研究及合理使用。
解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，与枯草芽孢杆菌亲缘性高，广泛分布于自然环境中。由于具有广谱的抑制真菌和细菌的活性，稳定性高，抗逆性强，且生长速度快，解淀粉芽孢杆菌被认为是一种非常理想的生防菌资源。解淀粉芽孢杆菌B4在静置条件下可以形成极为明显的生物被膜，且在分子功能一级类别中，有308个基因被注释到metal ionbinding，因此，在现有的生防能力的基础上，通过外源添加无害金属子提高其生物被膜的形成，从而实现抑制腐败病原菌能力的提升，为采后果实病害生物防治提供一种新的思路。
1.Costerton J W,Stewart P S,Greenberg E P.Bacterial biofilms:a commoncause of persistent infections[J].Science,1999,284(5418):1318-1322.
2.陈云.枯草芽孢杆菌生物膜在青枯病生防中的功能研究及Cyclic-di-GMP信号通路初探[D].南京农业大学,2012.
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过外源添加金属离子提高生防细菌抑制腐败菌的能力及在果实贮藏中的应用方法。该方法在外源无害的前提下，通过向菌悬液中加入金属铁离子，增强了芽孢杆菌生物被膜的形成，提高了芽孢杆菌在培养平板及果实中抑制病原菌的能力，降低了采后果实发病率，为增强菌株生防效用新方法奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，37℃，180-220rpm培养12-16h，得到解淀粉芽孢杆菌种子培养液；
所述解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:13466，保藏日期为2016年12月19日，该菌株记载在申请人早先申请的中国专利申请CN201710100745.9中；
(2)按照体积比1.0％-2.0％的比例接种种子培养液到LB液体培养基中，于37℃下培养4-6h后发酵结束，将发酵液于20-30℃，5000-10000g离心2-6min，得到菌体。
(3)将步骤(2)得到的菌体用含铁离子的LB液体培养基重悬，得含铁离子菌悬液。
优选的，所述步骤(3)中，用含有铁离子的LB液体培养基重悬至B4菌悬液浓度为1×104-1×107CFU/mL。
优选的，所述的铁离子在菌悬液中的浓度为0.3-1.0mM。
本发明提供了上述制备方法制备得到的用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液。
本发明进一步提供了上述含铁离子菌悬液用于抑制采后果实腐败病原菌的用途，其特征在于所述的铁离子存在形式为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁。
优选的，所述的果实为梨、枇杷、樱桃番茄。
优选的，所述的采后果实腐败病原菌包括：扩展青霉、灰葡萄孢霉。
本发明以下列任一方式应用于采后果实腐败病原菌的生物防治中：
方式A：将浓度为1×104-1×107CFU/mL的含铁离子菌悬液在喷洒在采后果实表面，使果实表面润湿；处理后，在室温，相对湿度40％-90％的条件下，静置晾干；
方式B：将采摘后的果实浸泡在浓度为1×104-1×107CFU/mL的含铁离子菌悬液中，浸泡时间为0.5-2.5分钟；处理后，在室温，相对湿度40％-90％的条件下，静置晾干。
此外，作为微生物发酵物，与生防领域内常见的化学品类和植物提取物类物质相比，其具有活性成分简单易得、价格低廉等优势。
本发明施用的外源铁离子有效增强了解淀粉芽孢杆菌生物膜的形成，提高了对不同水果(如枇杷、水晶梨、樱桃番茄)的采后病害的抑制能力。本发明具有安全高效的特点，对环境友好，生防作用效果突出，与常见外源添加物质相比，具有简单易得、价格低廉等优势，有利于促进生物防治剂的推广使用。
附图说明
图1本发明菌株B4的平板培养性状；
图2不同浓度的氯化铁对B4菌株生物被膜影响：(A)生物被膜形成过程，(B)生物被膜生物量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。
实例1：氯化铁对解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成的促进效应：
将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，在37℃、转速为180rpm的摇床中振荡培养12h，转接1mL菌液至50mL的LB液体培养基中，继续培养至OD600为0.5。图1为本发明中菌株B4的平板培养性状。
本实施例的平板培养基为LB固体培养基，其组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，用0.1mol/L的NaOH调节pH 7.4，在121℃下灭菌20min。
本实施例中的LB液体培养基，其组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、用0.1mol/L的NaOH调节pH 7.4，在121℃下灭菌20min。
将上述发酵液于6000g，27℃离心5min，在装有菌体沉淀的离心管中加入等体积的无菌LB液体培养基，振荡均匀，再次离心洗脱得到菌体。
再次用无菌LB液体培养基重悬菌体至解淀粉芽孢杆菌B4菌悬液浓度为1×107CFU/mL，备用。
在96孔U形微孔板中每孔加入150μL含有0.2mM、0.5mM、1.0mM三氯化铁的LB液体培养基，阴性对照组为等量的无菌LB液体培养基。按1:15的比例将上述处理过的菌悬液接种于96孔板中，即每孔加入10μL B4菌悬液，控制悬液浓度为1×106CFU/mL，每个处理3个重复，培养板置于37℃恒温培养箱中，定期观察生物被膜表型并拍照。
静置培养24h后，将生物被膜下的培养液吸出，用160μL蒸馏水冲洗微孔板2-3次后加入160μL 0.1％(w/v)结晶紫溶液染色，20min后除去结晶紫染色液。用蒸馏水洗涤微孔板至清水中不再呈现紫色后加入160μL 30％乙酸溶液将生物被膜完全溶解，稀释20倍并转移至酶标板中，在560nm下测定其吸光值，生物被膜生物量利用吸光值乘以稀释倍数来反映。
根据图2所示，随着添加氯化铁浓度的升高，解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成能力增强，生物被膜的生物量有所增加。
实例2：氯化铁提高解淀粉芽孢杆菌B4在梨、樱桃番茄、枇杷果实中抑制扩展青霉的效应：
扩展青霉(Penicillium expansum)孢子悬液的制备：用接种环挑一环致病霉菌，接入PDA试管斜面的培养基中传代至生长状态良好，置于25℃培养箱中培养7d后刮下部分孢子，悬浮于无菌生理盐水中，采用血球计数板计数确定孢子浓度，再用无菌生理盐水稀释至1×105conidia/mL，备用。
PDA培养基的制备：200g去皮马铃薯加适量蒸馏水煮沸20min，室温冷却后8层纱布过滤，于滤液中加入20g葡萄糖，再加入1.5％(w/v)琼脂，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌30min。
PDA培养基灭菌后冷却至50-60℃，加入相应浓度的氯化铁(终浓度0、0.2mM、0.5mM、1.0mM)，每个平板中倒入15mL培养基，待凝固后在平板中央加入5μL上述扩展青霉孢子悬液，置于25℃培养箱中培养并定期测定生长直径，每个处理三个重复。实验结果如表1所示，由表1可见，添加1mM以内浓度的氯化铁，扩展青霉的生长直径相差不大。方差分析显示添加1mM氯化铁与对照组有一定差异，但这是由于在平板中央滴加孢子悬液时，液滴因氯化铁浓度较高产生表面张力导致基础直径较小，所以生长直径表现出了差异。不同浓度氯化铁中，扩展青霉生长速率基本一致，测试浓度内氯化铁本身并不会抑制扩展青霉的生长。
B4菌悬液制备方式同实例1。
Fe-B4菌悬液的制备：用含有0.5mM三氯化铁的LB液体培养基将B4菌悬液稀释10倍，浓度1×106CFU/mL。
选取无机械损伤、未感染、大小和成熟度基本一致的同一批次的水晶梨27个，樱桃番茄171个，枇杷81个。用0.2％次氯酸钠浸泡消毒2min后冲洗干净。用灭菌后的打孔器在每个梨果实表面相同部位打孔，孔径为5mm，深度为3mm，每个梨果实打3个孔。用灭菌后的打孔器在每个枇杷、樱桃番茄果实表面相同部位打孔，孔径为3mm，深度为1.5mm，每个果实打1个孔。水晶梨9个为一组，每个处理三组平行。枇杷9个为一筐，樱桃番茄19个为一筐，一组处理三筐，每个处理三组平行。
水晶梨第一组在孔内加入20μL LB液体培养基，第二组在孔内加入20μL B4菌悬液，第三组在孔内加入20μL Fe-B4菌悬液。枇杷、樱桃番茄第一组在孔内加入10μL LB液体培养基，第二组在孔内加入10μL B4菌悬液，第三组在孔内加入10μL Fe-B4菌悬液。在室温下放置至孔内无明显液体(约2h)。
晾干后在每个水晶梨的伤口中接种20μL扩展青霉孢子悬液，在每个枇杷、樱桃番茄的伤口中接种10μL扩展青霉孢子悬液，待完全风干后用PE塑料保鲜膜密封，将果实贮藏于常温(25℃)下。从第3天开始每天定时观察果实发病情况，统计果实伤口发病率，结果以平均发病率(％)表示。
实验结果如表2、表3、表4所示。由表3、表3、表4可见，接种扩展青霉后在25℃储存3天时，水晶梨、枇杷、樱桃番茄未加解淀粉芽孢杆菌B4菌液的LB培养基空白组发病率已经高达96.30％、55.56％、88.23％，并且在第4天全部发病。加入B4菌液的对照组和在此基础上添加一定浓度的氯化铁处理组中，枇杷、樱桃番茄在第4天开始发病，梨果实直至第5天才开始发病，说明解淀粉芽孢杆菌B4对梨果实扩展青霉的发病抑制明显。与B4组相比，添加0.5mM氯化铁处理的水晶梨扩展青霉发病率在第5天下降18.52％，枇杷的发病率在第4天下降33.34％，樱桃番茄的发病率在第5天下降20.00％，以上结果表明氯化铁能在较大程度上提升B4对扩展青霉的发病抑制作用。
表1不同浓度氯化铁处理下扩展青霉生长直径
表2不同处理对梨果实中扩展青霉的发病影响
表3不同处理对枇杷果实中扩展青霉的发病影响
表4不同处理对樱桃番茄果实中扩展青霉的发病影响
实例3：氯化铁提高解淀粉芽孢杆菌B4在樱桃番茄、枇杷果实中抑制灰葡萄孢的效应：
灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子悬液的制备：用接种环于灰霉平板上挑取一环菌丝，接入PDA试管斜面的培养基中传代至生长状态良好，置于25℃培养箱中培养7d后刮下部分孢子，悬浮于无菌生理盐水中，采用血球计数板计数确定孢子浓度，再用无菌生理盐水稀释至1×105conidia/mL，备用。
Fe-B4菌悬液的制备同实例2。
枇杷、樱桃番茄的清洁处理同实例2。
枇杷、樱桃番茄的外源病害在实例3中采用的是灰葡萄孢菌孢子悬液。
实验结果如表4、表5所示，接种灰葡萄孢霉后在25℃储存3天时，枇杷、樱桃番茄未加解淀粉芽孢杆菌B4菌液的LB培养基空白组发病率已经高达88.89％、87.50％，并且在第4天全部发病。加入Fe-B4菌液的樱桃番茄在第5天开始发病，且与B4处理组相比，添加0.5mM氯化铁处理的枇杷灰葡萄孢的发病率在第3天、第4天、第5天分别下降55.56％、44.44％、33.33％。添加0.5mM氯化铁处理的樱桃番茄灰葡萄孢的发病率在第3天、第4天、第5天分别下降7.14％、8.57％、23.33％。以上结果表明氯化铁能明显提升B4对灰葡萄孢霉的发病抑制作用。
表4不同处理对枇杷果实中灰葡萄孢的发病影响
表5不同处理对樱桃番茄果实中灰葡萄孢的发病影响
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将解淀粉芽孢杆菌B4（Bacillus amyloliquefaciens B4）菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，37℃，180-220 rpm培养12-16 h，得到解淀粉芽孢杆菌种子培养液；
所述解淀粉芽孢杆菌B4（Bacillus amyloliquefaciens B4）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No: 13466，保藏日期为2016年12月19日；
（2）按照体积比1.0%-2.0%的比例接种种子培养液到LB液体培养基中，于37℃下培养4-6 h后发酵结束，将发酵液于20-30℃，5000-10000 g离心2-6 min，得到菌体；
（3）将步骤（2）得到的菌体用含铁离子的LB液体培养基重悬至B4菌悬液浓度为1×104-1×107 CFU/mL，得到含铁离子菌悬液；铁离子在菌悬液中的浓度为0.5-1.0 mM。
2.一种权利要求1所述制备方法制备得到的含铁离子菌悬液在抑制采后果实腐败病原菌的用途。
3.权利要求2所述的用途，其特征在于所述的铁离子存在形式为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁。
4.权利要求2所述的用途，其特征在于所述的果实为梨、枇杷、樱桃番茄。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的采后果实腐败病原菌包括：扩展青霉、灰葡萄孢霉。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：以下列任一方式应用于采后果实腐败病原菌的生物防治中：
方式A：将浓度为1×104-1×107 CFU/mL的含铁离子菌悬液在喷洒在采后果实表面，使果实表面润湿；处理后，在室温，相对湿度40%-90％的条件下，静置晾干；
方式B：将采摘后的果实浸泡在浓度为1×104-1×107 CFU/mL的含铁离子菌悬液中，浸泡时间为0.5-2.5分钟；处理后，在室温，相对湿度40%-90％的条件下，静置晾干。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110783915.4A CN113430137B (zh) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | 一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110783915.4A CN113430137B (zh) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | 一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113430137A CN113430137A (zh) | 2021-09-24 |
| CN113430137B true CN113430137B (zh) | 2022-10-18 |
Family
ID=77760067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110783915.4A Active CN113430137B (zh) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | 一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113430137B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113846033B (zh) * | 2021-10-26 | 2023-02-28 | 福州大学 | 一株抑制枇杷采后病害的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11163A (ja) * | 1997-06-13 | 1999-01-06 | Asada Shoji Kk | 熱安定性抗生物質を産生する耐熱性バチルス、その産生物質を有効成分とする芝草病害発生抑制剤および植物活性剤 |
| CN106939289A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-07-11 | 浙江大学 | 一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途 |
| CN107955829A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-04-24 | 中南民族大学 | 一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法 |
| CN109136152A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-01-04 | 四川大学 | 一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
-
2021
- 2021-07-12 CN CN202110783915.4A patent/CN113430137B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11163A (ja) * | 1997-06-13 | 1999-01-06 | Asada Shoji Kk | 熱安定性抗生物質を産生する耐熱性バチルス、その産生物質を有効成分とする芝草病害発生抑制剤および植物活性剤 |
| CN106939289A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-07-11 | 浙江大学 | 一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途 |
| CN107955829A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-04-24 | 中南民族大学 | 一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法 |
| CN109136152A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-01-04 | 四川大学 | 一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Effects of iron on DNA release and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa;Liang Yang等;《Microbiology》;20070501;第153卷;第1318-1328页 * |
| J. W. Costerton等.Bacterial BioÞlms: A Common Cause of Persistent Infections.《Science》.1999,第284卷第1318-1322页. * |
| Juntao Jin等.The mutual co-regulation of extracellular polymeric substances and iron pipes.《Bioresource Technology》.2014,第169卷第387-394页. * |
| Liang Yang等.Effects of iron on DNA release and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.《Microbiology》.2007,第153卷第1318-1328页. * |
| S. Grumbein等.Selected metal ions protect Bacillus subtilis biofilms from erosion.《Metallomics》.2014,第6卷(第8期),第1441-1450页. * |
| Selected metal ions protect Bacillus subtilis biofilms from erosion;S. Grumbein等;《Metallomics》;20140416;第6卷(第8期);第1441-1450页 * |
| The mutual co-regulation of extracellular polymeric substances and iron pipes;Juntao Jin等;《Bioresource Technology》;20140626;第169卷;第378-394页 * |
| 徐志辉.解淀粉芽孢杆菌SQR9生物膜形成和根际定殖分子机理研究.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士）农业科技辑》.2016,全文. * |
| 解淀粉芽孢杆菌SQR9生物膜形成和根际定殖分子机理研究;徐志辉;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士）农业科技辑》;20160515;第73页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113430137A (zh) | 2021-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102433282B (zh) | 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用 | |
| CN105557756A (zh) | 利用甲基营养型芽孢杆菌nkg-1实施的植物抑菌方法 | |
| CN107828695B (zh) | 一株高效抑制黄曲霉合成黄曲霉毒素的阴沟肠杆菌生防菌株及其应用 | |
| CN111647522B (zh) | 抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株及应用 | |
| CN105018385A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108148794A (zh) | 一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用 | |
| CN113699065B (zh) | 一种死谷芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112608868B (zh) | 一株高地芽孢杆菌及其应用 | |
| CN109486707A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN113481105A (zh) | 一种拟茎点霉属真菌新菌株、制备方法及用途 | |
| CN113430137B (zh) | 一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用 | |
| CN112011478A (zh) | 一种石斛内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌BL-HTie-5及其应用 | |
| CN108570432A (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN109182217B (zh) | 一种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株及其用途 | |
| CN112940991B (zh) | 一株暹罗芽孢杆菌的抗菌活性及应用 | |
| CN107828697A (zh) | 一种多粘类芽孢杆菌af01及其应用 | |
| CN110819550B (zh) | 一种可拮抗两种海水养殖病原性弧菌的海洋细菌及其应用 | |
| CN105543116B (zh) | 一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用 | |
| CN107058183B (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用 | |
| CN113278541B (zh) | 一株水稻内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN111471627B (zh) | 一株粘质沙雷氏菌bsz及应用 | |
| CN105907663B (zh) | 短小芽胞杆菌及其应用 | |
| CN100560716C (zh) | 草绿色链霉菌 | |
| CN115851479A (zh) | 一种对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的细菌及其应用 | |
| CN105296396B (zh) | 棉花内生细菌hb3s-13及其在棉花黄萎病防治中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |