CN109136152A

CN109136152A - 一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN109136152A
Application number: CN201811141415.5A
Authority: CN
Inventors: 孙群; 刘健; 熊仁科; 左建英; 鲁道夫·阿泽贝卡亚; 娜塔利亚·库泽那塔索娃
Original assignee: Sichuan Lomon Bio Technology Co ltd; Sichuan University
Current assignee: Sichuan Lomon Bio Technology Co ltd; Sichuan University
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明涉及微生物学和生物技术，具体公开了一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其在防治灰霉病中应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1841，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.15465，保藏日期：2018年3月20日。该菌株引进自俄罗斯，有广泛的抑菌谱和高抑制率。其发酵液、抑菌物质及采用其发酵液制备制剂用于防治灰霉菌引起的灰霉病，及其它真菌病害，具有效果好、可产业化生产，制备工艺简单，使用方法简单、无毒、无污染，绿色环保等优点。

Description

一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学和生物技术，特别是一株用于抑制植物病原真菌生长的解淀粉芽孢杆菌1841及其应用。

背景技术

农作物包括蔬菜、水果以及谷类的保存是农业上的一个重要问题。植物病原真菌对植物的侵染会造成严重的经济和社会问题。病原真菌可在植物营养生长的不同阶段影响植物，并且也会在蔬菜贮藏的阶段造成巨大的损失。世界各国每年农作物仓储中会有25-50%受到真菌侵染，可造成高达30%的仓储损失。植物病原真菌导致的病害还会降低食品和种子原料的质量。染病的植物在生长季节还会成为了各种病菌的传播源。化学杀菌剂常被用于保护植物抵抗植物病原体的侵染，在农作物进仓仓储前采用化学杀菌剂消毒可以显著性的减少真菌病害。块茎和块根蔬菜的生产中会使用大量化学药品作为杀菌剂。然而，化学杀菌剂也有许多缺点。最主要的负面作用是不具有特异性，污染环境，环境中的化学农药的积累，会使病原菌产生抗性。化学杀菌剂用于农产品也非常危险，因为化学农药对于人类和动物有害。化学农药会在植物的营养生长中积累，最终在农产品中产生化学农药残留，这可能会导致致癌、致畸以及致死的后果。

目前，已经开发出多种物理、化学和生物的方法用于抑制植物病原真菌生长。而产芽孢的芽孢杆菌属细菌可能是最有效的用于植物保护的生物杀菌剂之一。基于细菌和其具有杀菌特性的代谢产物，我们可以应用生物学方法替代其它手段来抑制植物病原真菌。当前，一些可以抑制植物病原真菌生长的细菌菌株已经被发现。而且，一些产芽孢细菌可以合成许多生物活性物质，这些物质可以抑制植物病原真菌的生长。生物杀菌剂的优点包括：可以高效的使用，具有多种多样的抗菌机制，可以诱导植物的系统抗性，具有形成生物被膜的能力，从而阻止植物病原真菌进入食物和传播。产芽孢的细菌，与其它的生物活性产品相比具有许多生物技术上的优势。如专利文献CN 105349459A公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。所获得的解淀粉芽孢杆菌GB1，分离自黄瓜老茎，该菌株具有的广谱抑菌作用，其能够抑制病原真菌分生孢子萌发、菌丝生长，并定植于伤口形成生物膜，有效阻止病原菌的侵染，抑制植物病原菌以及其他有害微生物的侵染繁殖，并具有促进植物生长的机制，产生植物激素促进植物生长发育，进而增加产量，但其抑菌能力有限。目前能够高效拮抗植物病原真菌的生防制剂还很少，因此筛选、分离出一种能够高效拮抗植物病原菌的微生物菌株，并形成微生物菌剂，通过生物防治的方式降低植物病害给农业生产带来的危害，非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效拮抗植物病原真菌的解淀粉芽孢杆菌菌株及微生物制剂和应用，该制剂可以有效防治植物真菌病害，从而减少化学农药的使用，保护环境，降低生产成本，提高产品品质。

本发明通过下述技术方案实现：

用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌1841，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号为CGMCC No.15465。

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1841，是从俄罗斯引进。

通过对峙实验证明：所述解淀粉芽孢杆菌1841对细链格孢菌（Alternaria tenuis），灰霉菌（Botrytis cinerea），玉米灰斑病菌（Cercospora zeae-maydis），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）具有拮抗作用，并具有以下形态特征、培养特征及生理生化特征：

1、在NBY培养基中形成灰色的、光滑边缘，直径4-5mm的粗糙扁平菌落。

2、营养细胞是特别长直的杆状细胞，经常3-4个细胞形成链；游离的芽孢呈椭圆形，不超过细胞的数量，单细胞，周生鞭毛，形成芽孢，革兰氏阳性，有广泛的抑菌谱和高抑制率。

3、具有广谱的抑真菌活性，可以抑制以下植物病原真菌的生长：细链格孢菌（Alternaria tenuis），灰霉菌（Botrytis cinerea），玉米灰斑病菌（Cercospora zeae- maydis），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。

4、需氧生长所需的碳源可以是：葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、麦芽糖和乳糖。当使用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖醇作为碳源时，它产生酸和乙偶姻，不产生气体，并且形成水解酶，水解淀粉和酪蛋白。

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1841的分子鉴定结果如下：以菌株1841基因组总DNA为模板，采用通用16S rDNA引物进行PCR扩增，得到约1.3 kb的特异性扩增产物，经测序，其16SrDNA系列如SEQUENCE LISTING所示，该片段长度为1385 bp，具有典型16SrDNA特征。通过NCBI上BLAST比对表面该菌株与解淀粉芽孢杆菌同源性最高，又以菌株1841基因组总DNA为模板，扩增gyrB基因，进行比对，进一步验证为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本发明还提供了的一种含有解淀粉芽孢杆菌1841的微生物菌剂。

所述微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌1841的总活菌数不低于8×10⁹个/g。

本发明进一步提供了所述微生物菌剂在防治灰霉病及其它真菌病害中的应用。

所述微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一：将培养好的种子液按体积比2-5%的比例接种到发酵培养基中，28-37℃，补料培养48-72小时，得到发酵液；

步骤二：将步骤一的发酵液与基质等体积混合均匀，然后于65-90℃干燥至以重量百分比计的含水率低于5%，得到微生物菌剂。

步骤一中，所述种子液通过下述方法获得：先将解淀粉芽孢杆菌菌株1841划线转接到PDA平板中，置于培养箱28-37℃恒温培养24-48小时；再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株1841 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，28-37℃摇床振荡培养24-48小时得到种子液。

步骤一中，所述发酵培养基包含以下按体积百分比计的酵母浸粉1-3%、糖蜜1-4%、玉米蛋白粉1-3%、磷酸二氢钾0.01-0.06%、硫酸镁0.01-0.05%、碳酸钙0.1-0.5%、氯化钠0.05-0.1%，连续补加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水调pH值6.5-7.5。

步骤二中，所述的基质选自微粉高岭土或微粉硅藻土。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供的用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1841，引进自俄罗斯，在NBY培养基中形成灰色的、光滑边缘，直径4-5mm的粗糙扁平菌落，营养细胞是特别长直的杆状细胞，经常3-4个细胞形成链；游离的芽孢呈椭圆形，不超过细胞的数量，单细胞，周生鞭毛，形成芽孢，革兰氏阳性，有广泛的抑菌谱和高抑制率。

2、本发明提供的含有解淀粉芽孢杆菌1841的微生物菌剂具有以下积极作用：

1）具有较好的防病作用：该菌剂中含有能够高效拮抗灰霉菌及其它真菌生长的解淀粉芽孢杆菌1841，且菌剂中该菌株的总活菌数达到8×10⁹个/g以上，将其喷洒于作物叶片上能够有效抑制灰霉病的发生，抑菌率达85%。

2）具有良好的促生作用：该菌剂施用后能够有效抑制灰霉病的发生，增加农作物的光合面积，并且产生对作物有益的植物生长调节剂，从而促进作物营养生产和生殖生长，提高产量。

3）无毒无污染无残留：该微生物菌剂是由解淀粉芽孢杆菌1841、培养基和基质组成，不含任何有毒有害成份，在农业生产中使用具有无毒、无污染、无残留的优点，符合我国生产绿色食品的要求。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌1841的抑菌物质对灰霉菌的抑制效果图。

图2为本发明解淀粉芽孢杆菌1841对灰霉菌的抑制效果图。

图3为本发明解淀粉芽孢杆菌1841对链格孢菌的抑制效果图。

图4为本发明解淀粉芽孢杆菌1841对多种病原真菌的抑制效果图，其中，A为赤霉菌、B为西瓜疫病菌、C为马铃薯早疫病菌、D为核盘菌。

图5为本发明解淀粉芽孢杆菌1841对番茄灰霉菌的防治效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌1841，以下结合实例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

一、以下为本发明实施例中所采用的培养基及其相应配方：

1、PDB液体培养基的配方为：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH。马铃薯煮沸半小时后，过滤，补足1000 mL水，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

2、马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA配方为：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，自然pH。马铃薯加适量自来水煮沸半小时后，八层纱布过滤，补足1000 ml水，121℃高压蒸汽灭菌20min。

3、液体landy培养基配方为：L-谷氨酸钠5g，MgSO₄.7H₂O 0.5 g，葡萄糖 20 g，FeSO₄ 0.15 mg，氯化钾 0.5 g，K₂HPO₄ 1.0 g，MnSO₄·H₂O 5.0 mg，CuSO₄·5H₂0 0.16 mg，蒸馏水1000 ml，pH 7.2，105℃下高压灭菌15 min。

4、液体NBY培养基的组分：（质量比%）：营养肉汤 0.8；酵母提取物：0.3；水。制备固体培养基，加入2.0%琼脂于NBY液体培养基中。

5、液体YM培养基的组分：（质量比%）：酵母浸粉：0.45；水。制备固体培养基，加入2.0%琼脂于YM液体培养基中。

6、CM-1培养基的组分：（质量比%）：酵母饲料 0.30；玉米粉 0.15；NaCl 0.1；MgSO₄•7H₂O 0.03；CaCO₃ 0.3；水。

二、测定本发明菌株“解淀粉芽孢杆菌1841”抑制真菌活性的方法

1、打孔法，具体步骤如下：

实验真菌在固体培养基上培养1-7天（培养时间依据不同的菌株而定）后，在培养皿上用直径10mm的打孔器切下真菌菌块，并且放置在另一加入25ml PSA培养基的培养皿中央，在真菌菌块两边对称位置，用8mm打孔器各打一个孔，在实验组的孔中加入150（μL）不同稀释倍数（1:10；1:100；1:500）的被研究细菌的液体培养液，对照组的孔中加入150（μL）的无菌蒸馏水或营养培养基。培养皿放置在24℃培养。三天后观察实验结果。抑制真菌的效果通过孔周围抑制真菌生长而形成的抑菌圈的大小决定（mm）。

2、真菌生长速率法，具体步骤如下：

在培养皿（直径8.7cm）中倒入混有“解淀粉芽孢杆菌1841”培养菌液（终浓度0.01%-0.05%）的察氏固体培养基20 ml。在培养皿的中央放置7 mm直径的生长期真菌菌盘，然后置于24℃培养。真菌生长的评价通过平板中央真菌菌盘的真菌生长进行评价，数量由其生长边界到培养皿中央的距离决定。生长速率实验中对照组的实验真菌被认为是100%（培养基中未加入细菌）。实验组培养的真菌与细菌共培养5天或者15天后，根据与对照组真菌生长的比值%确定细菌的抑菌活性。

实施例1 解淀粉芽孢杆菌1841生产潜力评价

将50 ml NBY培养基（pH 7.0）在120℃、0.8个大气压下灭菌30 min后，置于750 ml无菌细口瓶，冷却至20℃。接种解淀粉芽孢杆菌1841于培养基后30℃、250 rpm/min培养16 h，获培养物5-10 ml。镜检确保无污染，培养产物浓度通过显微镜检查，细胞数目应达到10⁹cfu/ml。

将经上述培养后的解淀粉芽孢杆菌1841与已报道抑菌效果最好的对照菌株解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.4777在YM培养基上培养72小时后，观察两种菌株的生产率（效价），结果如表1所示。

表1 本发明菌株与对照菌株生产率（效价）比较

从表1可见，相比于最相近的类似菌解淀粉芽孢杆菌 CGMCC No.4777，本发明解淀粉芽孢杆菌 1841具有更好的生产率。

实施例2 解淀粉芽孢杆菌1841抑真菌活性评价

采用打孔法，检测解淀粉芽孢杆菌1841与对照菌株解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.4777，对核盘菌、细链格孢菌、尖孢镰刀菌、稻瘟菌、玉米灰斑菌、灰霉菌的抑菌活性，抑菌范围（mm）如表2 所示。

表2 本发明菌株与对照菌株抑菌活性比较

说明：1、核盘菌、细链格孢菌、尖孢镰刀菌、稻瘟菌、玉米灰斑菌为使用1:500的稀释细菌培养液时的抑制真菌生长范围。

2、灰霉菌为使用未稀释细菌培养液时的抑菌生长范围。

从表2可以看出，本发明解淀粉芽孢杆菌1841抑制核盘菌、细链格孢菌、尖孢镰刀菌、稻瘟菌生长的能力优于对照菌解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.4777，抑制玉米灰斑菌和灰霉菌生长的能力与对照菌相当。说明本发明解淀粉芽孢杆菌1841对真菌生长具有较好的抑制能力。

实施例3 不同稀释浓度的解淀粉芽孢杆菌1841培养液抑真菌活性评价

采用打孔法，检测不同稀释浓度的解淀粉芽孢杆菌1841与对照菌株解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.4777培养液，共接种下对核盘菌、细链格孢菌、尖孢镰刀菌、玉米灰斑菌的抑真菌活性，真菌的生长量（mm）如表3 所示。

表3 本发明菌株与对照菌株不同稀释浓度的培养液共接种下的抑真菌活性比较

从表3可见，本发明解淀粉芽孢杆菌1841在共接种时抑制核盘菌、细链格孢菌、尖孢镰刀菌、稻瘟菌生长的能力优于对照菌CGMCC No.4777，而抑制玉米灰斑菌生长的能力与对照菌几乎一致。进一步说明，本发明解淀粉芽孢杆菌1841具有较强的抑制真菌生长能力，抑真菌活性高。

实施例4 解淀粉芽孢杆菌1841抑制尖孢镰刀菌生长活性评价

将尖孢镰刀菌与解淀粉芽孢杆菌1841共培养15天后，通过生长速率法评价解淀粉芽孢杆菌 1841对尖孢镰刀菌生长活性的抑制作用，尖孢镰刀菌的生长速率如表4所示。

表4 本发明菌株与对照菌株抑制尖孢镰刀菌活性比较

从表4可见，本发明解淀粉芽孢杆菌1841在0.01%和0.05%的浓度下与尖孢镰刀菌共培养72小时后具有更强抑制尖孢镰刀菌生长的能力，优于对照菌CGMCC No.4777。

实施例5 解淀粉芽孢杆菌1841抑制玉米灰斑菌生长活性评价

将玉米灰斑菌与解淀粉芽孢杆菌1841共培养15天后，通过生长速率法评价解淀粉芽孢杆菌 1841对玉米灰斑菌生长活性的抑制作用，玉米灰斑菌的生长速率如表5所示。

表5 本发明菌株与对照菌株抑制玉米灰斑菌活性比较

从表5可见，相比于对照菌CGMCC No.4777，本发明解淀粉芽孢杆菌 1841在0.01%和0.05%的浓度下与玉米灰斑菌菌共培养72小时后具有更强的抑制玉米灰斑菌生长的能力。

实施例6 解淀粉芽孢杆菌1841抑制细链格孢菌生长活性评价

将细链格孢菌与解淀粉芽孢杆菌1841共培养15天后，通过生长速率法评价解淀粉芽孢杆菌 1841对细链格孢菌生长活性的抑制作用，细链格孢菌的生长速率如表6所示。

表6 本发明菌株与对照菌株抑制细链格孢菌生长活性比较

从表6可见，本发明解淀粉芽孢杆菌1841在0.01%和0.05%的浓度下与细链格孢菌共培养72小时后具有更强抑制细链格孢菌生长的能力，优于对照菌CGMCC No.4777。

实施例7 解淀粉芽孢杆菌1841抑制细链格孢菌生长活性评价

将核盘菌与解淀粉芽孢杆菌1841共培养15天后，通过生长速率法评价解淀粉芽孢杆菌1841对核盘菌生长活性的抑制作用，核盘菌的生长速率如表7所示。

表7 本发明菌株与对照菌株抑制核盘菌生长活性比较

从表7可见，本发明解淀粉芽孢杆菌1841在0.01%和0.05%的浓度下与核盘菌共培养72小时后具有更强抑制核盘菌生长的能力，优于对照菌CGMCC No.4777。

综合上述实施例1-7的实验结果可知，产芽孢细菌解淀粉芽孢杆菌1841具有广谱抑菌活性，能够抑制下列植物病源真菌生长：细链格孢菌（Alternaria tenuis）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、玉米灰斑病菌（Cercospora zeae-maydis）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、稻瘟菌（Magnaporthe grisea）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。该菌株抑菌效果好于对照类似菌株解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.4777。

实施例8 解淀粉芽孢杆菌1841对灰霉菌、链格孢菌、赤霉菌、西瓜疫病菌、马铃薯早疫病菌、核盘菌的抑制作用

将解淀粉芽孢杆菌1841及各病原真菌分别接种到PDA培养基上进行对峙培养，一周后统计抑菌情况。

结果如图2，3，4所示，解淀粉芽孢杆菌1841能明显抑制各种病原真菌生长，抑菌圈约11-18mm，抑制率45%-68%。

实施例9 解淀粉芽孢杆菌1841抑菌物质对灰霉菌的抑制作用

将解淀粉芽孢杆菌1841接种到100ml Landy液体培养基，进行3个平行实验，接种量3%，发酵条件：30℃，200 rpm。发酵30-69小时后，每隔3小时取80ml菌液8000rpm离心5min，取70ml上清液加入盐酸调pH值为2，30min后待有效物质完全析出后，10000g离心5min，收集沉淀，用DMSO（二甲基亚砜）溶解为有效物质溶液，采用滤纸片法进行抑菌实验。

结果如图1所示，芽孢杆菌有效物质浓度为10mg/ml时，对灰霉菌的抑菌圈直径为25mm，具有很强的抑菌作用。

实施例10 解淀粉芽孢杆菌1841对番茄灰霉病的防治作用

将新鲜初步成熟的番茄果实，用70%乙醇进行表面杀菌30秒，然后用无菌水洗干净，在番茄上用无菌解剖刀切一小缝，对照组喷50μL无菌水后接种少量灰霉菌丝，实验组喷50 μL本发明芽孢杆菌培养液后接种等量菌丝，处理好的番茄置于灭菌的容器中，放在22℃培养箱，一周后观察统计结果。

结果如图5所示，对照组番茄全部发病霉变，而采用解淀粉芽孢杆菌1841保护的番茄依然保存完好。

上述实施例的实验结果表明：产芽孢细菌解淀粉芽孢杆菌1841具有广谱抑菌活性，能够抑制下列植物病源真菌生长：细链格孢菌（Alternaria tenuis）、链格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌（Botrytis cinerea）、玉米灰斑病菌（Cercospora zeae- maydis）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、稻瘟菌（Magnaporthe grisea）、赤霉菌（Fusarium graminearum）、西瓜疫病菌（Phytophthora drechsleri Tucker）、马铃薯早疫病菌（Alternaria solani.Sorauer）核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。该菌株抑菌效果好于对照类似菌株解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.4777。并且解淀粉芽孢杆菌1841的有效物质也有很强的抑菌作用。将解淀粉芽孢杆菌1841用于番茄的灰霉病防治取得了明显的效果。

实施例11

本实施例提供了一种含有解淀粉芽孢杆菌1841的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将解淀粉芽孢杆菌菌株1841划线转接到PDA平板中，置于培养箱28℃恒温培养48h，再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株1841 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，28℃摇床振荡培养48h得到种子液；将培养好的种子液按体积比2%的比例接种到发酵培养基中，28℃，补料培养72h，得到发酵液；

上述发酵培养基包含以下按体积百分比计的酵母浸粉1%、糖蜜1%、玉米蛋白粉1%、磷酸二氢钾0.01%、硫酸镁0.01%、碳酸钙0.1%、氯化钠0.05%，连续补加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水调pH值6.5；

步骤二：将发酵液与微粉高岭土等体积混合均匀，然后于65℃干燥至含水率低于5wt%，得到微生物菌剂，该微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌1841的总活菌数为9.3×10⁹个/g。

实施例12

步骤一：将解淀粉芽孢杆菌菌株1841划线转接到PDA平板中，置于培养箱37℃恒温培养24h，再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株1841 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，37℃摇床振荡培养24h得到种子液；将培养好的种子液按体积比5%的比例接种到发酵培养基中37℃，补料培养48h，得到发酵液；

上述发酵培养基包含以下按体积百分比计的酵母浸粉3%、糖蜜4%、玉米蛋白粉3%、磷酸二氢钾0.06%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、氯化钠0.1%，连续补加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水调pH值7.5。

步骤二：将发酵液与微粉高岭土等体积混合均匀，然后于75℃干燥至含水率低于5wt%，得到微生物菌剂，该微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌1841的总活菌数为9.5×10⁹个/g。

实施例13

步骤一：将解淀粉芽孢杆菌菌株1841划线转接到PDA平板中，置于培养箱30℃恒温培养40h，再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株1841 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，30℃摇床振荡培养35h得到种子液；将培养好的种子液按体积比3%的比例接种到发酵培养基中30℃，补料培养62h，得到发酵液；

上述发酵培养基包含以下按体积百分比计的酵母浸粉2%、糖蜜3%、玉米蛋白粉2%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、碳酸钙0.2%、氯化钠0.06%，连续补加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水调pH值7.0。

步骤二：将发酵液与微粉高岭土等体积混合均匀，然后于80℃干燥至含水率低于5wt%，得到微生物菌剂，该微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌1841的总活菌数为8.2×10⁹个/g。

实施例14

步骤一：将解淀粉芽孢杆菌菌株1841划线转接到PDA平板中，置于培养箱35℃恒温培养30h，再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株1841 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，35℃摇床振荡培养30h得到种子液；将培养好的种子液按体积比4%的比例接种到发酵培养基中35℃，补料培养55h，得到发酵液；

上述发酵培养基包含以下按体积百分比计的酵母浸粉1%、糖蜜2%、玉米蛋白粉3%、磷酸二氢钾0.03%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.3%、氯化钠0.08%，连续补加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水调pH值7.2。

步骤二：将发酵液与微粉高岭土等体积混合均匀，然后于90℃干燥至含水率低于5wt%，得到微生物菌剂，该微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌1841的总活菌数为8.8×10⁹个/g。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 解淀粉芽孢杆菌1841

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 935

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg aagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacggat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga ccatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccatac tcctacggga 300

ggcagcatta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420

gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc caccagggcc 480

gggtctctta taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg 540

gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg 600

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gcatgtggtt taatttcgaa gcaacgcgaa gaacc 935

Claims

1.一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌1841，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15465。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌1841在拮抗灰霉病病原菌中的应用。

3.一种微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌1841。

4.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌1841的总活菌数不低于8×10⁹个/g。

5.如权利要求3或4所述的微生物菌剂在防治番茄灰霉病中的应用。

6.如权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述种子液通过下述方法获得：先将解淀粉芽孢杆菌菌株1841划线转接到PDA平板中，置于培养箱28-37℃恒温培养24-48小时；再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株1841 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，28-37℃摇床振荡培养24-48小时得到种子液。

8.如权利要求6所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述发酵培养基包含以下按体积百分比计的酵母浸粉1-3%、糖蜜1-4%、玉米蛋白粉1-3%、磷酸二氢钾0.01-0.06%、硫酸镁0.01-0.05%、碳酸钙0.1-0.5%、氯化钠0.05-0.1%，连续补加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水调pH值6.5-7.5。

9.如权利要求6所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述的基质选自微粉高岭土或微粉硅藻土。