CN110819566B

CN110819566B - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110819566B
Application number: CN201911144426.3A
Authority: CN
Inventors: 李永刚; 姜佰文; 姜婉怡; 王彦峰; 姜举娟
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: CN110819566A

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18713。该菌对灰葡萄孢Botrytis cinerea具有显著的抑制作用，制成生防制剂后对菜豆灰霉病防治效果达到90％以上，且对采后菜豆具有良好的保鲜作用。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及蔬菜病害防治技术领域，更具体的说是涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在防治采后菜豆灰霉病中的应用。

背景技术

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是菜豆运输和贮藏过程中造成损失最严重的病害之一。该菌繁殖迅速，有较强的适应性，易发生变异，且已对多种化学农药产生了抗药性，可引发菜豆采后腐烂，降低菜豆的质量和口感，造成严重的经济损失。

目前，化学药剂仍是控制菜豆采后灰霉病的主要措施，但其使用效果随着灰葡萄孢抗药性的增强逐渐减弱，因此，如何获得一种有效防治采后菜豆灰霉病的生防制剂成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种能够用于防治采后菜豆灰霉病的解淀粉芽孢杆菌。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2019年10月21日，保藏编号为CGMCC No.18713。

上述解淀粉芽孢杆菌在防治采后菜豆灰霉病中的应用。

上述解淀粉芽孢杆菌在抑制灰葡萄孢Botrytis cinerea中的应用。

一种生防制剂，包括上述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BA17或解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BA17的发酵产物。

由上述技术方案可知，本发明公开的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens BA17对菜豆灰霉病病原菌灰葡萄孢(B.cinerea)具有较强的抑制作用，将其制成生防制剂对菜豆灰霉病防治效果达到90％以上，且对采后菜豆具有良好的保鲜作用。

附图说明

图1所示为BA17对15种病原菌的抑菌谱测定结果；

其中，1：水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、2：菜豆白娟病齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、3：大豆疫霉(Phytophthora sojae kaufmann)、4：玉米鞘腐病菌轮枝镰孢(Fusarium verticillioide)、5：水稻纹枯病菌瓜亡革(Thanatephoruscucumeris)、6：小麦雪腐病菌(Typhula incarnata)、7：玉米茎基腐病菌禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、8：大豆根腐病菌尖镰孢(Fusarium oxysporum)、9：西瓜果腐病菌木贼镰孢(Fusarium equiseti)、10：玉米茎基腐病菌半裸镰孢(Fusarium semitectum)、11：玉米大斑病菌凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、12：玉米茎基腐病菌禾生腐霉(Pythium graminicola)、13：玉米茎基腐病菌层出镰孢(Fusarium proliferatum)、14：玉米茎基腐病菌胶孢镰孢(Fusarium subglutinans)、15：马铃薯早疫病菌链格孢(Alternaria alternate)。

图2所示为BA17菌落特征及革兰氏染色。

图3所示为BA17生理生化特征；

其中，A.革兰氏染色、B.酪蛋白、C.M.R.试验、D.V-P试验、E.淀粉水解、F.接触酶反应、G.柠檬酸盐、H.硝酸盐、I.需氧性测定。

图4所示为BA17的系统发育树。

图5所示为碳源、氮源和无机离子对BA17生长的影响。

图6所示为时间、接种量、温度与pH值对BA17生长的影响。

图7所示为BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢分生孢子萌发、产生及菌丝生长的影响。

图8所示为BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢菌丝形态的影响(×40)；

其中，1、5、9、13为1％处理组；2、6、10、14为5％处理组；3、7、11、15为10％处理组；4、8、12、16为对照组。

图9所示为BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢菌丝超微结构的影响(×30000)；

其中，1为对照组；2为1％处理组；3为5％处理组；4为10％处理组；CW：细胞壁；CM：细胞质膜；M：线粒体；N：细胞核；P：核糖核蛋白颗粒。

图10所示为BA17抑菌活性物质对温度的稳定性。

图11所示为BA17抑菌活性物质对pH值的稳定性。

图12所示为BA17抑菌活性物质对紫外线的稳定性。

图13所示为BA17水剂的货价期。

图14所示为BA17水剂对菜豆灰霉病的防治效果；

其中，1为不接菌对照；2为接菌对照；3为1％处理组；4为5％处理组；5为10％处理组；6为农药处理组。

图15所示为BA17水剂对菜豆感官品质的影响；

其中，1为1％处理组；2为5％处理组；3为10％处理组；4为对照组。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1生防菌BA17的筛选

以引起菜豆灰霉病的病原菌灰葡萄孢(B.cinerea)为防治对象，利用对峙法对由实验室分离并保存的生防菌进行筛选。具体操作为：用NA平板于28℃条件下扩繁不同生防菌48h后，在PDA平板中心接种经扩繁的灰葡萄孢菌蝶(d＝0.7cm)，然后在距离PDA平板中心3cm处划线接种已扩繁的不同生防菌，每个处理重复3次，放入26℃恒温培养箱中培养6d后，用游标卡尺测量灰葡萄孢菌落的最长半径与最短半径，并求其比值，部分结果如表1所示。

表1

从表1可以看出，有12株生防菌对灰葡萄孢的菌丝生长有较好的抑制效果(比值>2)，其中17号生防菌的抑制效果最好，3次重复的最长半径与最短半径的平均比值为2.58。

进一步地，对12株抑菌效果较好的菌株通过病原菌接种进行室内果实防效的初步测定，17号生防菌的室内果实防效也最佳，将其命名为BA17，并作为目标生防菌株，对15株不同的植物病原菌进行抑菌谱测定。

抑菌谱测定采用对峙法测定，具体操作同上，6d后测量植物病原菌菌落的最长半径和最短半径，求其比值，分析BA17对不同病原菌的抑菌效果。

其中8株病原菌采用解淀粉芽孢杆菌BA3进行抑菌实验，结果如表2和图1所示。

表2

从表2和图1可以看出，5株病原菌最长半径与最短半径的比值超过2.0，表现较好的抑菌效果。其中，对玉米茎基腐病菌禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌瓜亡革(Thanatephorus cucumeris)、小麦雪腐病菌(Typhula incarnata)的抑菌效果最好，3次重复的平均值分别为3.0、2.8、2.6，由此说明，BA17具有良好的广谱性。

实施例2生防菌BA17的鉴定

按照《伯杰细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》的方法对菌株进行形态学、革兰氏染色、接触酶、硝酸盐还原、需氧性测定、柠檬酸盐利用、乙酰甲基甲醇(V-P)、明胶液化、酪蛋白、甲基红(M.R.)、淀粉水解等测定；硫化氢及糖醇类发酵试验采用普通细菌单盒生化鉴定管(广东环凯生科有限责任公司，广州，中国)，具体操作参照说明书进行。

如图2所示，BA17为短杆状细菌，四周遍布卵圆形芽孢，LB平板生长呈近圆形，乳白色，后期菌落边缘变不规则褶皱，中部凹陷，革兰氏阳性菌。

由图3及表3可知，BA17为需氧菌；可利用蔗糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇，不可以利用木糖、肌醇、鼠李糖、纤维二糖、5％乳糖；可以水解明胶、淀粉，分解过氧化氢，还原硝酸盐；V-P试验、M.R.试验、柠檬酸盐实验均为阳性；硫化氢试验为阴性。

表3

进一步地，对BA17进行分子鉴定。

用移菌环将BA17均匀涂于LB固体培养基上，30℃培养5-6d后，用移菌钩挑取100mg左右菌苔置于EP管中，按照植物基因组DNA提取试剂盒操作说明(康维生物科技，北京，中国)进行DNA提取，取5μl DNA溶液用1％琼脂糖凝胶电泳检测符合要求后，采用16Sr DNA扩增方法进行分子鉴定。

PCR引物为：1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；27F：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'。

扩增体系(50μl)如表4，PCR反应程序见表5。

表4

表5

反应后，取5μl反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳检测条带符合要求、结果清晰的扩增产物进行双向测序(生物工程(上海)股份有限公司)，获得的基因序列拼接后于NCBI数据库在线blast比对，然后根据比对结果利用MEGA 6.06软件进行系统发育树分析。拼接测序结果，获得长度为1445bp的16S rDNA；构建系统发育树结果如图4所示，BA17与Bacillus amyloliquefaciens亲缘关系最为较近，属于同一进化枝，同为芽孢杆菌属细菌。

综上所述，结合BA17的形态学及生理生化特性的结果，最终确定菌株BA17为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

实施例3生防菌发酵液培养条件和培养基成分优化

1.不同碳源、氮源、无机离子对生防菌生长的影响

初始培养基：蛋白胨10g、可溶性淀粉10g、蒸馏水1000ml、pH 7.0-7.2。

分别使用等量麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇替代可溶性淀粉加入初始培养基中作为碳源，接入BA17，于摇床28℃，150rpm震荡培养48h，利用分光光度计分别测定各处理培养液OD₆₀₀值(0.1ofOD₆₀₀＝10⁸cfu/ml)，以未接菌培养基作为对照，用SPSS(17.0)分析不同碳源之间差异显著性。

分别使用等量酵母膏、硝酸钠、牛肉膏、硝酸铵、硫酸铵替代蛋白胨加入初始培养基中作为氮源，接入BA17，于摇床28℃，150rpm震荡培养48h，利用分光光度计分别测定各处理培养液600nm处的吸光值，以未接菌培养基作为对照，用SPSS(17.0)分析不同氮源之间差异显著性。

分别向初始培养基中添加0.05％的硫酸镁、碳酸钙、硫酸锌、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾，接入BA17，于摇床28℃，150rpm震荡培养48h，利用分光光度计分别测定各处理培养液600nm处的吸光值，以未接菌培养基作为对照，用SPSS(17.0)分析不同无机离子之间差异显著性。

如图5所示，不同碳源、氮源和无机离子对BA17生长的影响差异较大。可溶性淀粉作为初始培养基中的碳源，对BA17生长的促进作用与其他碳源有明显的差异显著性；对BA17生长的促进作用最明显的氮源为牛肉膏和蛋白胨，其中牛肉膏对其生长的促进作用在数值上高于蛋白胨，硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵对BA17的生长无明显影响，同时可以得出结论有机氮源比无机氮源更有利于BA17的生长；对BA17生长影响最大的无机离子为碳酸钙，其次为硫酸镁、氯化钠和氯化钾，三者不具有差异显著性，硫酸锌对生防菌的生长基本无影响。

通过对BA17培养液组成的单因素试验分析，确定最优碳源为可溶性淀粉，牛肉膏为最优氮源，最优的无机离子为碳酸钙。

进一步地，在培养基成分单因素试验结果的基础上，使用SPSS 17.0软件对上述因子进行3因素3水平的正交实验L9(3⁴)，以获得最佳的培养基组成，试验设计及结果见表6，其中A为可溶性淀粉，B为牛肉膏，C为碳酸钙。

表6

可溶性淀粉对BA17生长的影响最大，碳酸钙BA17生长的影响最小。碳源、氮源不充足会抑制菌株的生长，而浓度过高则会加速菌株的过度繁殖。作为无机离子的碳酸钙对BA17生长的影响最小。培养基中碳源、氮源和无机离子的最优组分确定为可溶性淀粉10g/L、牛肉膏10g/L、碳酸钙1g/L，此时的OD600值可达到2.824。

2.时间、温度、接菌量、pH对生防菌生长的影响

取0.5ml(10⁸cfu/ml)活化BA17菌悬液接种于定量的50ml LB液体培养基中(250ml三角瓶)，3次重复，于150r/min，28℃的摇床震荡培养12h、24h、36h、48h和72h，利用分光光度计分别测定各处理培养液600nm处的吸光值，用SPSS(17.0)分析不同时间之间差异显著性。

取0.5ml(10⁸cfu/ml)活化BA17菌悬液接种于定量的50ml LB液体培养基中(250ml三角瓶)，每个处理3次重复，分别于18℃、24℃、30℃、36℃和42℃温度条件下摇床震荡150r/min培养48h，利用分光光度计分别测定各处理培养液600nm处的吸光值，用SPSS(17.0)分析不同温度之间差异显著性。

活化后BA17菌悬液(10⁸cfu/ml)分别按装液量的0.5％、1％、2％、5％、10％加入定量的LB液体培养基中(250ml三角瓶)，每个处理3次重复，于28℃，150r/min的摇床震荡培养48h，利用分光光度计分别测定各处理培养液600nm处的吸光值，用SPSS(17.0)分析不同接菌量之间差异显著性。

取0.5ml(10⁸cfu/ml)活化BA17菌悬液接种于定量的50ml LB液体培养基中(250ml三角瓶)，配置培养液pH值分别为4.0、6.0、8.0、10.0、12.0。每个处理3次重复，于28℃，150r/min的摇床震荡培养48h，利用分光光度计分别测定各处理培养液600nm处的吸光值，用SPSS(17.0)分析不同pH的差异显著性。

从表7和图6可以看出，OD600值与时间、接种量、温度和pH相关。BA17生长的最适接菌量为1％，时间为24h，温度为30℃，pH为6，且具有显著差异。

表7

实施例4抑菌活性物质检测

1.抑菌活性物质产生部位的检测

取0.5ml(10⁸cfu/ml)已活化的BA17菌悬液接种于LB液体培养基中，于28℃，170r/min，震荡培养48h。用血球计数法观测菌液浓度，并用0.1M的PBS磷酸缓冲液(pH＝7.4)清洗菌液，配置成浓度为1×10⁹cfu/ml的菌悬液。将上述菌悬液分成两部分，一部分菌悬液用细胞破碎仪破碎后，经细菌滤器过滤，得到孢内孢外混合液抑菌活性物质；另一部分直接通过细菌滤器过滤，得到孢外混合液抑菌活性物质，备用。

利用菌丝生长速度法测定孢外与孢内孢外混合液抑菌活性物质的抑菌效果，测量抑菌直径，用SPSS 17.0软件对两种活性物质的差异进行分析，确定抑菌活性物质产生部位，结果如表8所示。

表8

由表8可知，抑菌活性物质的浓度与抑菌率呈正比，浓度越高对灰葡萄孢菌丝生长的抑制效果越好，三种浓度的抑菌率均高于50％，其中10％使用剂量的效果最好，并且孢外与孢内孢外混合液的抑菌效果无显著差异。可得出结论，抑菌活性物质的主要产生于孢外。

2.BA17抑菌活性物质抑菌机制的测定

取0.5ml(10⁸cfu/ml)已活化的BA17菌悬液接种于定量的200ml LB液体培养基中(500ml三角瓶)28℃、150r/min震荡培养7d后经细菌滤器过滤获得无菌发酵滤液(即抑菌活性物质)，备用。

(1)BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢分生孢子萌发、孢子产生、菌丝生长的影响

将灰葡萄孢在PDA培养基上培养5d后，向培养皿中加入15ml无菌水，用移菌钩将菌丝刮起，无菌双层纱布过滤后，用血球计数板稀释至10⁸个孢子/ml，备用。利用24孔细胞培养板将BA17抑菌活性物质按1％、5％和10％用量分别加入孢子悬浮液中，每个孔的最终体积为2ml，以未加入抑菌活性物质的孢子悬浮液作为对照，每个处理3次重复，每隔24h调查1次对照孢子萌发率，待对照孢子萌发率超过60％，开始调查各处理孢子萌发数，计算孢子萌发抑制率。

将培养5d的灰葡萄孢菌碟(d＝0.7cm)转移至PDA培养基上培养至直径4cm，切掉没有长菌的培养基，将抑菌活性物质用无菌水稀释至浓度为1％、5％、10％，每培养皿分别加入不同浓度的15ml抑菌活性物质稀释液刮掉菌丝，放置20min，倒掉稀释液，28℃恒温培养3d，对照加无菌水，每处理3皿，调查孢子产生数，计算孢子产生抑制率。

将抑菌活性物质加入100ml PDA培养基中混匀倒板，使培养基中次生代谢产物的浓度为1％、5％和10％，将培养5d的灰葡萄孢菌碟(d＝0.7cm)接种在PDA平板的中心，每种浓度重复3次，对照加无菌液体培养基，放于恒温培养箱中26℃培养96h后测定灰葡萄孢菌落直径，并计算抑菌率。

实验结果如表9及图7所示，BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢的菌丝生长、孢子产生和萌发均有一定的抑制作用，且抑菌活性物质浓度与孢子萌发、产生和菌丝生长的抑制率呈正比，当抑菌活性物质的浓度为10％时，其对灰葡萄孢孢子产生、萌发和菌丝生长的抑制效果最明显，抑制率分别为72.5％、78.4％和61.7％。

表9

(2)BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢菌丝形态和超微结构的影响

将培养5d的灰葡萄孢菌碟(d＝0.7cm)接种在PDA平板的中心，24h后刮取新鲜菌丝，将其浸泡在浓度1％、5％和10％抑菌活性物质中24h后，通过光学显微镜观察抑菌活性物质对菌丝形态的影响。

如图8所示，通过光学显微镜观察，未经BA17抑菌活性物质处理的对照组(图8中4、8、12、16)菌丝表面平滑，隔膜间隔较大，原生质疏散，菌丝生长点大小均匀；抑菌活性物质处理后，菌丝膨胀部位失水畸形(图8中1、2、3)，原生质聚集(图8中5、6、7)，菌丝间隔膜变短(图8中9、10、11)，菌丝生长点膨大(图8中13、14、15)，抑菌活性物质体积分数与菌丝变化程度成正比。

进一步地，将在抑菌活性物质中浸泡24h后的灰葡萄孢菌丝置于2.5％的戊二醛(磷酸缓冲液pH 7.2)中固定2.5h，用0.1M磷酸缓冲液漂洗三次，每次15min，然后用1％锇酸固定液固定2.5h后，再次漂洗。样品经系列乙醇液逐级脱水后用树脂包埋。用钻石刀切成超薄切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双染色后，于透射电镜下进行灰葡萄孢超微结构的观察，测定抑菌活性物质对灰葡萄孢菌丝超微结构的影响。

如图9所示，透射电镜观察发现，对照组菌丝内部有各种细胞器，这些细胞器结构完整，均匀分布在细胞质中，其细胞壁厚度均匀一致且无破损；经1％体积分数的抑菌活性物质处理后，线粒体体积变大，数目增多(图9中2)；经5％体积分数的抑菌活性物质处理后，细胞壁有缺损，胞质不均匀(图9中3)；10％体积分数的抑菌活性物质处理后，细胞质坏死，细胞器崩解(图9中4)。

3.抑菌活性物质稳定性的检测

(1)BA17抑菌活性物质热稳定性的测定

将抑菌活性物质分别在20、40、60、80和100℃水浴和121℃湿热灭菌处理20min，以未处理样品作对照，将不同温度处理的抑菌活性物质定量加入到PDA培养基中使浓度为10％，将培养5d的灰葡萄孢菌碟(d＝0.7cm)接种在PDA平板的中心，每处理3皿，96h后测定菌落直径，并计算抑菌率。

如图10所示，未经温度处理的BA17抑菌活性物质对灰葡萄孢的抑菌率为63.7％，抑菌活性物质在20℃和40℃水浴处理20min后，与对照相比差异不显著，结果表明，常温对抑菌活性物质影响不大。随着温度进一步升高为60℃、80℃、100℃和121℃，处理20min后的抑菌效果迅速降低，分别是12.2％、8.8％、8.2％、10.9％，各组之间无显著差异，虽然具有部分抑菌作用，但效果不佳。

(2)BA17抑菌活性物质酸碱稳定性的测定

将抑菌活性物质用0.1M的NaOH和HCl调整pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，以未处理样品作对照，将各组抑菌活性物质定量加入到PDA培养基中使浓度为10％，将培养5d的灰葡萄孢菌碟(d＝0.7cm)接种在PDA平板的中心，利用菌丝生长速度法测定不同处理对抑菌活性物质抑菌效果的影响，每处理3皿，96h后测定菌落直径，并计算抑菌率。

如图11所示，pH值由低到高，抑菌活性物质对灰霉病菌菌丝生长抑制率先升高后降低，在pH值等于8时，抑制率为61.9％，此时的酸碱稳定性最优。pH为6、7、9、10、11时，抑菌率分别为28.6％、22.4％、27.9％、25.9％、21.1％，当pH值等于3时，抑菌率降低到10％以下，抑菌作用基本丧失。结果表明，该抑菌活性物质在pH值等于8最为稳定，抑菌效果最好。

(3)BA17抑菌活性物质抗紫外线稳定性的测定

将抑菌活性物质置于接近紫外灯(100μW/cm²)1m的范围内分别照射10min，20min，30min，60min后，将各组抑菌活性物质定量加入到PDA培养基中使浓度为10％，将培养5d的灰葡萄孢菌碟(d＝0.7cm)接种在PDA平板的中心，利用菌丝生长速率法测定不同处理对抑菌活性物质抑菌效果的影响，每处理3皿，96h后测定菌落直径，并计算抑菌率。

如图12所示，未经紫外线照射的对照组灰葡萄孢的菌落直径为1.8cm，经紫外灯照射10min，20min的处理组灰葡萄孢菌落直径与对照组结果无差异显著性，说明抑菌活性物质有一定的抗辐射稳定性。

实施例5生防制剂的研制与应用

供试对照化学药剂：40％嘧霉胺(悬浮剂)，拜耳作物科学(中国)有限公司北京分公司。

产脂肽发酵培养基：蔗糖200g，Na₂HPO₄10g，KH₂PO₄3g，NH₄NO₃2g，MgSO₄·7H₂O0.2g，酵母膏0.2g，CaCl₂0.7μg，MnSO₄·4H₂O 1μg，蒸馏水1000ml。

1.生防制剂的制备

种子液制备：从试管中移取少量BA17接种于LB液体培养基中，于28℃，170r/min，震荡培养24h，备用。

按5％接菌量，将活化24h的BA17种子液转移到产脂肽发酵培养基(装液量为200ml培养基/1L锥形瓶)，28℃，180r/min，震荡培养48h。用0.1M的NaOH调节其pH至8.0，12000r/min离心10min除去菌体。无菌上清液用0.1M的HCL调节pH至1.8-2.2，4℃冰箱过夜使沉淀完全。4000r/min离心40min，收集沉淀并用pH 2.0的盐酸洗涤2次，甲醇提取5次。在35℃的RE52-99旋转蒸发仪中将甲醇溶液减压蒸干，得到脂肽粗提物，用甲醇稀释至完全融解(饱和状态)，备用。

2.生防制剂货价期的测定

脂肽粗提物的甲醇溶液分别在4℃和室温(25℃)储存360d，每60d取200μl脂肽粗提物的甲醇溶液加入2ml无菌蒸馏水中，制成10％浓度的水剂，混入198ml PDA培养基中，制成平板，并以加入等量甲醇的蒸馏水为对照。将培养5d的灰葡萄孢打成d＝0.7cm的菌碟，接到上述平板上，28℃恒温培养3-5d，3次重复，测量菌落直径，并计算抑菌率。

如图13所示，水剂配置完成，即时对灰葡萄孢菌丝生长抑菌率为77.6％，与在4℃低温冷藏120d和室温(25℃)储藏120d无差异显著性，4℃低温冷藏360d后，其抑菌率为50.7％，而在25℃室温条件下保存360d后，抑菌率下降为26.9％。BA17水剂在室温条件下的抑菌率明显低于冷藏条件，说明低温条件更有利于延长其贮藏期。综上，BA17抑菌活性物质在甲醇溶液中保存120d，抑菌效果稳定。

3.生防制剂对菜豆采后灰霉病防效的测定

分别取2，10，20ml的脂肽粗提物的甲醇溶液(10μl/ml)，用蒸馏水稀释配制成浓度为1％，5％，10％的水剂各200ml。挑选大小、成熟度一致、无机械伤的菜豆，75％的酒精浸泡1min，风干。称取100g菜豆分别在3种不同浓度的水剂中浸泡10min，以等量加入甲醇的无菌蒸馏水浸泡10min作为对照，每个处理3次重复，晾干后每个处理喷10ml灰葡萄孢孢子悬浮液(浓度为10⁴个孢子/ml)，将各处理菜豆于常温(25℃)保湿培养8天后，检查其发病情况，并计算病情指数及防效。

灰霉病病情分级标准(DB 11T 285-2005)：0级：无病斑；1级：病斑直径<1cm；3级：病斑直径1-2cm；5级：病斑直径2-3cm；7级：病斑直径3-4cm；9级：病斑直径>5cm。

病情指数公式为：

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×7)×100。

如表10和图14所示，BA17水剂能有效控制灰霉病的发生和发展，10％浓度的水剂防治效果达到90％以上，与其他处理组相比存在显著差异，而1％、5％浓度与化学农药的防治效果差异无显著性。

表10

4.生防制剂对采后菜豆感官品质综合指数的测定

分别取2、10、20ml的脂肽粗提物甲醇溶液(10μl/ml)，用蒸馏水稀释配制成浓度为1％、5％、10％的水剂各200ml。挑选大小、成熟度一致、无机械伤的菜豆，75％的酒精浸泡1min，风干。称取100g菜豆分别在3种不同浓度的水剂中浸泡10min，以等量加入甲醇的无菌蒸馏水浸泡10min作为对照，每个处理3次重复，取出后晾干水分，然后用密封袋包装后放在4℃冰箱中保存，每个处理重复3次。经不同浓度BA17水剂处理后的菜豆于室温贮藏4周后，测定其感官品质，测定标准如表11所示，测定结果见表12和图15。

菜豆品质综合指数＝0.3×腐烂指数+0.3×锈斑指数+0.2×硬度指数+0.2×色泽指数

表11

表12

不同浓度BA17水剂处理后的菜豆在感官上均优于对照组，特别是经10％浓度BA17水剂处理后的菜豆感官品质综合指数最低，失水较少且色泽鲜绿，保鲜效果最好。

实施例6

将解淀粉芽孢杆菌BA3制作成水剂，方法与BA17处理方法相同，并采用一致的接种方法对采后的菜豆进行灰霉病的防治试验，试验进行2次重复，结果见表13。

表13

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens） BA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18713。

2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌在防治采后菜豆灰霉病中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌在抑制灰葡萄孢（ Botrytis cinerea）中的应用。

4.一种生防制剂，其特征在于，包括权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens） BA17或解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens） BA17的发酵产物。