CN112175883A - 一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌 - Google Patents

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CN112175883A CN202011153626.8A CN202011153626A CN112175883A CN 112175883 A CN112175883 A CN 112175883A CN 202011153626 A CN202011153626 A CN 202011153626A CN 112175883 A CN112175883 A CN 112175883A
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Abstract

一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，通过对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM‑2，保藏编号为CGMCC No.19549，进行ARTP诱变，获得诱变株AR7，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏编号为CGMCC No.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该诱变株的遗传稳定性良好，最大活菌数为1.65×109‑2.0×109cfu/mL，对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉等有较好的拮抗作用，抑制率为70％以上，可用于制作生物拮抗剂。

Description

一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌。
背景技术
镰刀菌是一类全球广泛分布的真菌，可导致作物的枯萎病、根腐病等多种病害。致病性的镰刀菌菌株寄主达100多种，许多镰刀菌菌株能在种植或收获后感染多数农作物及观赏植物，如F.oxysporum f.sp.Lycopersici会导致番茄血管枯萎病，F.oxysporumf.sp.Cubense会导致香蕉枯萎病，极大的降低了作物的产量和品质，是生产上较难防治的重要病害之一，目前尚无有效的治疗和控制方法，因此，寻找绿色、健康、高效的生物防治手段成为当务之急。
常压室温等离子体(ARTP)是近年来提出的一种新的大气压辉光放电冷等离子体源，能在大气压下产生温度在25～40℃之间具有高活性粒子浓度的等离子体射流，包括处于激发态的氦、氮原子，以及羟基自由基等，能量以辐射的方式传递到生物体内后，生物体内各分子便产生电离与激发，产生了多种化学性质活泼的自由原子或基团，通过彼此间的相互反应，并与大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构发生改变，影响如DNA合成的中止、酶活性改变等生化过程，使得染色体等各部分结构进一步变化。区别于传统诱变方法，ARTP具有安全稳定、使用方便、突变速度快等多种优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，通过对保藏编号为CGMCC No.19549的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2进行ARTP诱变，获得诱变株AR7，其具有良好的抑菌能力，对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉等有较好的拮抗作用，抑制率为70％以上，经传代培养，该诱变株的遗传稳定性良好，活菌数高。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，其为AR7，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏编号为CGMCC No.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AR7，其对尖孢镰刀菌的抑菌直径为3.0-3.5cm，OD600为5.5-5.8，最大活菌数为1.65×109-2.0×109cfu/mL。
进一步，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AR7的发酵培养基中包括：葡萄糖0.5-1.5％，酵母浸粉2.0-2.5％，NaCl 0.5-1.5％。
本发明所述具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌的选育方法，包括如下步骤：
1)制备菌悬液
将活化后的解淀粉芽胞杆菌TXM-2接种至LB培养基中，于37℃、180r/min摇瓶培养至对数生长期，稀释菌体浓度至107cfu/mL，取稀释后的菌体于4000r/min、4℃条件下离心处理10min，将离心后的沉淀物用无菌生理盐水悬浮，得到菌悬液；
2)ARTP诱变处理
将上述菌悬液与10vol％甘油按体积比1：1的比例混合，混合后均匀涂在ARTP诱变仪的载片上，置于凹槽内，并在凹槽下放入装有无菌生理盐水的离心管，设置诱变时间，再进行ARTP诱变；
ARTP功率120W，通气量10L/min，冷却循环控制温度为20℃，设置不同诱变时间的待处理样品进行诱变，诱变时间依次设为2s、4s、6s、8s、10s、12s、14s、16s、18s和20s，处理结束后，将落有载片的离心管取出，置于震荡机低速洗脱1min；
分别计算不同诱变时间下样品的诱变致死率，以未诱变处理的菌体作为对照，根据致死率(％)确定最终的诱变条件；
Figure BDA0002741940070000031
3)初筛变异菌株
分别将上述不同诱变时间浓度为108cfu/mL的诱变株种子液按1％的接种量转接于装有Landy培养基中，于37℃、180r/min摇瓶培养48h，取发酵液，于4℃、12000r/min离心20min后经0.22μm滤膜过滤，再将无菌发酵上清与冷却至55℃的PDA培养基充分混合，使发酵上清的含量为100.0μL/mL；
然后以同体积无菌水为对照，将平板中央接种培养5～6d的禾谷镰孢菌菌落边缘菌饼(Φ＝7mm)，每处理重复3次，置于30℃恒温培养箱中培养4～5d，观察和测量病原菌的菌落直径，并按照下式分别计算抑菌率；
纯生长量＝菌落的平均直径-菌饼直径
Figure BDA0002741940070000032
筛选出抑菌率70％以上的突变株；
4)传代培养
将初筛后所获得的菌株分别使用平板划线连续培养传至5代，并测量每一代的病原菌直径，选出病原菌直径与出发菌株处理下的病原菌直径基本一致的菌株，获得解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AR7。
本发明筛选获得的解淀粉芽孢杆菌AR7的最佳培养基为：葡萄糖0.5-1.5％，酵母浸粉1.5-2.5％，NaCl 0.5-1.0％。
本发明提供所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AR7在生物防治剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用ARTP技术对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2进行诱变，以禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)为指示菌，筛选出拮抗效果提升的解淀粉芽胞杆菌AR7，与出发菌株解淀粉芽胞杆菌TXM-2相比，解淀粉芽胞杆菌AR7对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉的抑菌率提升30％以上。
本发明的解淀粉芽胞杆菌AR7，经传代培养，该诱变株的遗传稳定性良好，最大活菌数可达到1.65×109-2.0×109cfu/mL，对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉等有较好的拮抗作用，抑制率为70％以上；对尖孢镰刀菌的抑菌直径为3.0-3.5cm，OD600为5.5-5.8，其对禾谷镰孢菌的抑制率达72％以上，较解淀粉芽胞杆菌TXM-2明显增加。
本发明以菌浓和对尖刀镰孢菌的抑菌直径为指标，分别采用单因素试验和正交试验优化培养基配方及其浓度，确定了适于菌株培养基的最佳无机盐、氮源及碳源。
附图说明
图1为本发明实施例1中经ARTP处理后TXM-2的致死率曲线。
图2为本发明实施例1中解淀粉芽胞杆菌对禾谷镰孢菌的拮抗作用。
图3为本发明实施例1中诱变株连续培养5代病原菌的直径。
图4为本发明实施例1中不同培养基对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响。
图5为本发明实施例2中不同无机盐对诱变株AR7在抑菌直径和OD600的影响。
图6为本发明实施例2中不同氮源对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响。
图7为本发明实施例2中不同碳源对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响。
图8为本发明实施例2中诱变株AR7与玉米茎腐病病原菌的对峙平板图。
图9为本发明实施例2中诱变株AR7与尖孢镰刀菌的对峙平板图。
图10为本发明实施例2中诱变株AR7与交链孢霉的对峙平板图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所述解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)均由上海市农业科学研究院生物研究所提供，所述解淀粉芽胞杆菌TXM-2，分类命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏编号为CGMCC No.19549于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明实施例中所涉及的培养基种类及用途如下：
PDA培养基，禾谷镰孢菌及尖孢镰刀菌活化用；
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；
NA培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖2.5g/L，牛肉浸膏3g/L；
NB培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L；
NYBD培养基：牛肉浸膏8g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L；
BPY培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 5g/L；
Landy培养基：葡萄糖20.0g/L，FeSO4 0.15 mg/L，L-谷氨酸钠5.0g/L，MnSO4 5.0mg/L，MgSO40.5 g/L，CuSO4 0.16 mg/L，KCL 0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L；
基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.2；
巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基(g/L)：葡萄糖10，MnSO4 0.01，KH2PO4 0.5，FeSO40.01，K2HPO4 0.5，酵母浸粉1，MgSO4·7H2O 0.2，蛋白胨0.1，NaCl 0.01，CaCO3 5。
实施例1本发明具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌的选育过程，包括如下步骤：
(1)制备菌悬液
将解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2经试管活化后，按1％的接种量转接于装有100mL LB培养基的250mL的锥形瓶中37℃、180r/min摇瓶培养至对数生长期，约4～5h；
经稀释使菌体浓度约为107cfu/mL，取1mL稀释后的菌体于4000r/min、4℃条件下离心处理10min，将离心后的沉淀物用1mL无菌生理盐水悬浮，获得菌悬液；
(2)ARTP诱变处理
将上述菌体悬浮液与10％(V/V)甘油按体积比1：1的比例混合，混合后均匀涂在ARTP诱变仪的无菌不锈钢载片上，将载片置于凹槽内，并在凹槽下放入装有1mL无菌生理盐水的2mL规格离心管，设置诱变时间，再进行ARTP诱变；
ARTP功率120W，通气量10L/min，冷却循环控制温度为20℃，设置不同诱变时间的待处理样品进行诱变，诱变时间依次设为2s、4s、6s、8s、10s、12s、14s、16s、18s和20s，处理结束后，将落有载片的离心管取出，置于震荡机低速洗脱1min；
以未诱变处理的菌体作为对照，按照致死率公式分别计算不同诱变时间下样品的诱变致死率：
Figure BDA0002741940070000061
采用平板计数法绘制解淀粉芽胞杆菌TXM-2的ARTP诱变致死率曲线，建立ARTP诱变时间与致死率的关系曲线，结果见图1。
由图1可知，当处理时间在2～10s之间时，随着处理时间的增加，致死率迅速增加，进一步增加到12s致死率急剧下降，12s之后致死率逐渐回升，当诱变时间增加到18s以上时，致死率接近100％；致死率曲线呈先升高后下降再上升的趋势，这可能与SOS反应(SOSresponse)有关，细胞DNA在受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下为求生存而产生的一种应急措施，综上，选择8s为最佳诱变时间。
(3)初筛变异菌株
分别将浓度约为108cfu/mL的诱变株种子液按1％的接种量转接于装有100mLLandy培养基的250mL锥形瓶中，37℃、180r/min摇瓶培养48h，取发酵液于4℃、12000r/min离心20min后经0.22μm滤膜过滤，再将无菌发酵上清与冷却至55℃左右的PDA培养基充分混合，使发酵上清的含量为100.0μL/mL，然后将平板中央接种培养5～6d的禾谷镰孢菌菌落边缘菌饼(Φ＝7mm)。
以同体积无菌水为对照，每处理重复3次，置于30℃恒温培养箱中培养4～5d，观察和测量病原菌的菌落直径，并计算抑菌率。
纯生长量＝菌落的平均直径-菌饼直径
Figure BDA0002741940070000071
从诱变株中分离到1株禾谷镰孢菌拮抗菌株AR7，拮抗实验：以PDA培养基上正常生长的禾谷镰孢菌为对照，分别将出发菌株TXM-2和诱变株AR7的发酵上清与禾谷镰孢菌进行对峙培养，2-3天后，解淀粉芽胞杆菌诱变株对禾谷镰孢菌的拮抗作用参见图2，其中，A为对照组，B为TXM-2，C为诱变株AR7，其发酵上清对禾谷镰孢菌的抑菌率参见表1。
表1 TXM-2和AR7发酵上清对禾谷镰孢菌的抑菌率
组别 平均直径/cm 抑菌率/％
对照 6.04±0.13 -
TXM-2 3.96±0.07 38.95
AR7 2.19±0.04 72.10
可见，AR7发酵上清对病原菌的抑制率达72.10％，较出发菌株TXM-2提升约33.15％。
(4)遗传稳定性验证：
为了验证诱变株的遗传稳定性，将初筛后所获得的菌株分别使用平板划线连续培养传至5代，并测量每一代的病原菌直径，结果参见图3。
可见，随着传代次数的增加，病原菌直径与一代诱变菌株处理的病原菌直径基本一致，这表明筛选出的诱变株具有良好的遗传稳定性。
实施例2
对筛选获得的诱变菌株所适用的培养基进行筛选，包括以下步骤：
2.1种子培养基的初筛
将浓度约为108cfu/mL的AR7菌株种子液按1％的接种量分别接于上述八种培养基中，分别为LB培养基、NA培养基、NB培养基、NYBD培养基、BPY培养基、Landy培养基、基础发酵培养基和巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基，于37℃、180r/min条件下培养48h，取发酵液于4℃、12 000r/min离心20min后经0.22μm滤膜过滤，采用牛津杯法进行培养基的筛选，测定发酵液的OD600和对尖胞镰刀菌的抑菌直径，每处理3次重复，结果参见图4，其中，1：LB培养基；2：NA培养基；3：NB培养基；4：NYBD培养基；5：BPY培养基；6：基础发酵培养基；7：Landy培养基；8：巴氏梭状芽孢杆菌合成培养基。
由图4可知，突变菌株AR7在LB和Landy培养基的菌浓OD600分别为6.230和4.025(P<0.05)，其次是BPY和巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基(P<0.05)，OD600分别为3.250、3.040。
AR7以BPY培养基培养后发酵液对尖孢镰刀菌的抑制作用最强，且相较于NB、基础发酵和巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基差异显著(P<0.05)，抑菌直径达到2.833cm，因此，选择BPY培养基作为AR7菌株发酵的种子培养基。
2.2培养基的优化
以BPY培养基为种子培养基，分别以重量百分含量0.5％的磷酸氢二钾、0.5％氯化钙、0.012％的硫酸亚铁作为无机盐，分别以重量百分含量均为2％的硝酸钾、硫酸铵、尿素、黄豆饼粉、酵母浸粉、牛肉膏作为氮源，用于替换种子培养基的蛋白胨、牛肉膏及酵母浸粉，分别以重量百分含量0.5％的蔗糖、0.5％甘露醇、0.5％可溶性淀粉作为碳源，采用单因素试验分别对种子培养基的无机盐、氮源和碳源进行优化，测定发酵液的OD600和对尖胞镰刀菌的抑菌直径，每个处理3次重复，以确定培养基的最佳无机盐、氮源及碳源，结果参见图5-7。
由图5可知，以磷酸氢二钾为无机盐成分，AR7的OD600最大可达4.630(P>0.05)，抑菌直径为2.479cm，而相较于磷酸氢二钾和氯化钙，对照组(NaCl)AR7菌株对病原菌的抑菌直径为2.821cm，差异显著(P<0.05)，因此选择NaCl作为AR7菌株抗菌物质产生的无机盐成分。
由图6可知，AR7在以黄豆饼粉为氮源时，细胞OD600值最大为8.190(P>0.05)，在以酵母浸粉为氮源时，细胞OD600为4.553，抑菌直径2.875cm(P>0.05)，而在含硫酸铵和尿素的培养基中，菌株不生长(P<0.05)。因此，选择酵母浸粉作为AR7菌株抗菌物质产生的最佳氮源。
由图7可知，相较于蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇，AR7在以葡萄糖为碳源的培养基中细胞OD600值最大可达4.296(P>0.05)，其抑菌直径最大为2.867cm(P<0.05)；其次是为蔗糖时，OD600值最大可达4.200，其抑菌直径最大为2.717cm；因此，选择葡萄糖作为AR7菌株抗菌物质产生的最佳碳源。
2.3培养基成分的浓度优化
根据最佳无机盐、氮源及碳源的筛选结果，选用3因素3水平L9正交表进行正交试验，以确定最适宜诱变株株生长和产抑菌物质最优的发酵培养基组合，测定方法同本实施例的2.1步骤，实验结果参见表2。
表2菌株AR7对尖胞镰刀菌抑制作用最优培养基正交试验结果
Figure BDA0002741940070000091
注：同列不同小写字母表示不同处理间差异在P<0.05水平具有统计学意义。结果表明，6号培养基处理的生物量和抑菌直径均显著高于其它处理及对照组(CK)(P＜0.05)，其OD600值为5.543，抑菌直径达3.027cm；因此，最适宜AR7生长的碳源、氮源和无机盐浓度配比组合为葡萄糖10g/L，酵母浸粉25g/L，NaCl 5g/L。
实施例3诱变株与病原菌的拮抗试验
分别将活化后玉米茎腐病病原菌、尖孢镰刀菌和交链孢霉菌丝块接种于PDA平板中央，30℃培养1～2d，待菌落长出，均匀在菌落周围点接种本发明的诱变菌株AR7，30℃培养3～5d，观察拮抗效果，结果如图8～10所示，由图8～10可知，诱变株AR7对上述病原菌都有较强的抑制作用。

Claims (5)

1.一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7，保藏编号为CGMCC No.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌或交链孢霉的抑制率为70％以上。
3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其对尖孢镰刀菌的抑菌直径为3.0-3.5cm，对禾谷镰孢菌的抑制率达72％以上，OD600为5.5-5.8，最大活菌数为1.65×109-2.0×109cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其适于生长的发酵培养基中包括：葡萄糖0.5-1.5％，酵母浸粉2.0-2.5％，NaCl 0.5-1.5％，请列出培养基中的其他物质种类及含量。
5.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在生物防治剂中的应用。
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