CN113930347B - 一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物、生物技术领域，涉及一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用。针对目前木霉菌株中还未发现褪黑素合成的问题，本发明构建了一株具有褪黑素合成能力的绿色木霉工程菌，所述的工程菌异源表达了来源于人基因组的芳烷基胺N‑乙酰转移酶(Aralkylamine N‑acetyltransferase，AANAT)编码基因hAANAT和乙酰复合胺‑O‑甲基转移酶(AcetylserotoninO‑methyltransferase，ASMT)编码基因hASMT，出发菌株为绿色木霉(Trichodermaviride)Tv‑1511。本发明构建的基因工程菌，具有合成褪黑素的能力，在其发酵液中能够检测到褪黑素产量达到21.26mg/L。同时，此基因工程菌具有更好的生长和产孢特性，更强的逆境胁迫耐受能力，更高的病原菌拮抗性，以及更有效的植物促生能力。本发明能够促进木霉菌在农业和工业生产中的应用。

Description

一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于农业微生物领域，生物技术领域。涉及一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
褪黑素(Melatonine)，学名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，又称松果体素，是动植物内广泛存在的一种小分子生物胺类物质，具有重要的生理作用。褪黑素在人体和动物体内的含量极少，只有pg/mL水平，但生理作用十分重要，主要作用有调节昼夜节律、缓解睡眠障碍、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等等。褪黑素在植物体中也广泛存在，其含量分布差异巨大，从pg/g到μg/g都有分布，但一般含量高于人体和动物体，其在植物中的主要作用包括促进植物生长、侧根形成以及提高环境耐受性等。
动物中褪黑素的合成主要在松果体细胞中合成。其合成的前体物是色氨酸。松果体细胞从血液中摄取色氨酸，在色氨酸羧化酶(TPH)、5-羟色氨酸脱羧酶(5-HTPDC)、芳烷基胺N-乙酰转移酶(Aralkylamine N-acetyltransferase，AANAT)、乙酰复合胺-O-甲基转移酶(Acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT)等一系列酶的作用下，经过羟化、脱羧、N-乙酰化和氧甲基化，最终形成褪黑素。褪黑素在植物中的合成和在动物中类似。首先通过色氨酸脱羧酶(TDC)和5-羟化酶将色氨酸转化为色胺和5-羟色氨酸。然后分别通过色胺5-羟化酶和氨基酸脱羧酶作用将色胺和5-羟色氨酸转化为5-羟色胺(serotonin),5-羟色胺再通5-羟色胺-N-乙酰转移酶转变为N-乙酰羟色胺，最终通过乙酰复合胺-O-甲基转移酶(Acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT)的甲基化作用将N-乙酰羟色胺合成为褪黑素。
有研究发现，经酿酒酵母发酵后，葡萄酒中褪黑素大量产生，但用于发酵的葡萄浆却并未检出褪黑素的存在，表明了酿酒酵母与褪黑素之间关系密切。在发酵的整个过程中，褪黑素存在先升后降的趋势，这个趋势与酵母的生长曲线有关联，推断褪黑素与酵母的生长代谢关系密切，可能是作为一种信号分子参与酵母的生长代谢。有研究者以酿酒酵母为宿主细胞，通过异源表达哺乳动物体内褪黑素合成相关的酶，重构了褪黑素合成路线。
木霉(Trichoderma spp.)是一类重要的多功能丝状真菌，是农业生产中重要的生防菌株和植物促生菌株，也是工业生产中重要的酶和代谢产物的工程菌。木霉产生的次级代谢产物种类繁多，具有各种各样的生物活性，在农药、医药、食品等领域有广泛的开发应用前景，例如开发为杀菌剂、除草剂、杀虫剂以及抗肿瘤药物等。但是，目前还未见有木霉代谢合成褪黑素的报道，在其菌体和发酵液内也未检测到褪黑素。
木霉具有发酵周期短、培养条件简单、反应条件温和、不涉及有毒有害的化学试剂、发酵产物易于下游分离的特点，同时能够实现高密度发酵，产物合成效率高，是优良的宿主表达系统和良好的异源蛋白生物反应器。利用基因组分析和基因工程技术，调控木霉中重要代谢产物的表达是提高木霉抗逆性、促生能力的有效途径。
发明内容
为了克服上述问题，本发明的目的是提供一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌，所述工程菌包含：经密码子优化后的芳烷基胺N-乙酰转移酶编码基因hAANAT和经密码子优化后乙酰复合胺-O-甲基转移酶编码基因hASMT；
经密码子优化后编码基因hAANAT和经密码子优化后编码基因hASMT能够在绿色木霉中异源表达，分别形成具有活性的芳烷基胺N-乙酰转移酶和乙酰复合胺-O-甲基转移酶。
本发明构建筛选了能够合成褪黑素的木霉工程菌株，可为促生生物肥料的研发等提供出发菌株，也可为褪黑素的工业化生产提供优良底盘，对促进木霉菌在农业和工业生产中的应用具有重要意义。
本发明的第二个方面，提供了一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌的构建方法，包括：
用化学合成的方法获得密码子优化后的hANNAT和hAMST基因序列；
以密码子优化后的hANNAT基因序列作为模板，克隆获得带有酶切连接位点SpeI和BstEII的hANNAT基因表达盒；
以密码子优化后的hAMST基因序列作为模板，克隆获得带有酶切连接位点SpeI和BstEII的hAMST基因表达盒；
将以上获得的hANNAT基因和hAMST基因的表达盒分别连入经双酶切SpeI和BstEII的pCAMBIA1303-Hygro和pCAMBIA1303-Bleo线性载体，分别构建含有hANNAT基因的pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT表达载体，以及含有hAMST基因的pCAMBIA1303-Bleo-hAMST表达载体；
将pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT和pCAMBIA1303-Bleo-hAMST真菌表达载体，转入到绿色木霉原生质体中，经过筛选，得到能够同时表达hANNAT和hAMST的绿色木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST。
本发明的第三个方面，提供了任一上述的绿色木霉工程菌在褪黑素合成中的应用。
本发明的第四个方面，提供了上述经密码子优化后的芳烷基胺N-乙酰转移酶编码基因hAANAT和经密码子优化后乙酰复合胺-O-甲基转移酶编码基因hASMT在构建具有更好的生长和产孢特性，更强的逆境胁迫耐受能力，更高的病原菌拮抗性，以及更有效的植物促生能力的绿色木霉中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明在绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511中异源表达了来源于人基因组的hAANAT基因和hASMT基因，构建了一株能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌。该菌具有合成褪黑素的能力，在其发酵液中能够检测到褪黑素，产量达到21.26mg/L。同时，此基因工程菌具有更好的生长和产孢特性，更强的逆境胁迫耐受能力，更高的病原菌拮抗性，更有效的植物促生能力。本发明能够促进木霉菌在农业和工业生产中的应用。
(2)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1 pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT和pCAMBIA1303-Bleo-hAMST质粒图谱。
图2 hANNAT和hAMST基因在绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及工程菌中表达的qPCR检测结果。
图3绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及其工程菌株发酵液中褪黑素含量的检测。
图4绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及其工程菌株生长及产孢特性的分析。
图5绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及其工程菌株抗逆能力的分析。
图6绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及其工程菌株与病原菌平板对峙实验。
图7绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及其工程菌株发酵液对病原菌的抑制实验。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用。具体通过以下技术方案实现：
本发明所述的hANNAT和hAMST基因来源于人类基因组，它们在NCBI中的登记号分别为Gene ID:15和Gene ID:438。hANNAT基因编码的芳烷基胺N-乙酰转移酶(AralkylamineN-acetyltransferase，AANAT)和hAMST编码的乙酰复合胺-O-甲基转移酶(Acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT)都是人体褪黑素合成途径中的关键酶。
根据木霉偏好性进行密码子优化后的hANNAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：
ATGAGCACCCAGTCCACGCACCCTCTCAAGCCCGAGGCTCCAAGGCTTCCGCCCGGCATCCCGGAATCTCCCAGCTGCCAACGGAGACATACGCTGCCGGCCTCGGAGTTTCGATGTCTCACACCTGAGGACGCTGTGTCCGCGTTTGAGATAGAGAGAGAAGCGTTTATTTCTGTCCTTGGCGTCTGCCCGCTGTATCTCGACGAGATTCGCCACTTCCTGACGCTCTGCCCCGAACTTTCCCTGGGCTGGTTCGAGGAGGGCTGCCTGGTTGCGTTCATCATCGGCTCCCTCTGGGACAAGGAACGACTGATGCAGGAAAGCTTGACTCTACATCGCTCAGGTGGCCACATTGCCCACCTGCACGTCTTGGCTGTCCATCGTGCATTCCGCCAGCAGGGCCGCGGCCCCATCCTCTTGTGGCGCTACCTGCATCACCTCGGATCGCAACCAGCAGTGAGGAGGGCCGCCCTCATGTGCGAGGATGCCCTGGTGCCCTTTTACGAGCGGTTCAGCTTCCACGCCGTTGGACCTTGCGCCATCACCGTCGGTTCGTTGACCTTCATGGAGCTCCACTGCAGTCTACGGGGGCATCCGTTTCTCCGACGCAACTCGGGGTGTTGA
根据木霉偏好性进行密码子优化后的hAMST基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：
SEQ ID NO.2：
ATGGGCTCATCTGAAGACCAGGCCTACCGTCTCCTGAACGACTACGCCAATGGCTTCATGGTCAGCCAAGTCCTCTTTGCAGCCTGCGAGCTGGGCGTTTTCGATCTCCTGGCCGAGGCGCCCGGGCCCCTTGACGTGGCGGCCGTGGCCGCTGGCGTACGGGCATCAGCCCATGGAACAGAGCTGCTGCTAGATATCTGCGTCTCTCTCAAGCTCTTGAAGGTCGAGACCCGGGGGGGAAAAGCTTTCTACCGAAACACGGAGCTCTCCTCTGACTATCTCACGACAGTTTCCCCGACCAGTCAGTGCAGCATGCTGAAGTACATGGGTCGCACTTCTTACCGCTGCTGGGGGCATCTGGCAGACGCCGTCCGCGAGGGCCGCAACCAGTACCTGGAAACCTTTGGCGTGCCTGCAGAGGAACTTTTCACTGCGATTTATCGTTCAGAAGGCGAGAGATTACAATTCATGCAGGCTCTGCAGGAGGTCTGGTCCGTCAACGGCCGGTCCGTCCTGACCGCCTTCGACCTCAGTGTTTTTCCACTGATGTGCGACCTGGGAGGCACCTGGATCAAGCTGGAGACAATCATCTTGTCGAAACTGTCGCAGGGCCAGAAGACCAAGCACAGGGTGTTCAGCTTGATTGGCGGGGCTGGGGCTCTCGCCAAGGAGTGCATGAGCCTTTATCCTGGCTGCAAGATCACCGTCTTTGACATTCCGGAAGTGGTGTGGACGGCGAAGCAGCACTTTTCCTTTCAAGAAGAGGAGCAGATTGACTTCCAAGAGGGCGATTTCTTCAAGGACCCGTTGCCCGAGGCCGATCTGTACATCCTGGCTCGAGTTCTTCACGATTGGGCCGACGGCAAGTGTTCCCATCTCCTTGAGAGGATTTATCACACGTGTAAGCCCGGAGGTGGCATCCTCGTCATCGAGTCGCTCTTGGATGAGGACCGCCGAGGCCCACTTCTAACGCAGCTCTACAGCCTCAACATGCTCGTGCAAACCGAAGGACAGGAAAGGACTCCCACGCACTACCACATGTTGCTTTCGAGCGCCGGTTTCCGCGACTTTCAGTTCAAGAAGACGGGCGCCATCTACGACGCGATACTGGCGAGAAAATGA。
在一些实施例中，所述的绿色木霉(Trichodermaviride)为本课题组分离鉴定出的绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.16800。
本发明涉及一种表达hANNAT和hAMST基因的绿色木霉工程菌株的构建方法，包括如下步骤：用化学合成的方法获得密码子优化后的hANNAT和hAMST基因序列。以密码子优化后的hANNAT基因序列作为模板，利用如SEQ ID NO.3(hANNAT-YH-SpeI-Forward：CGGACTAGTATGAGCACCCAGTCCACGCA)和SEQ ID NO.4(hANNAT-YH-BstEII-Reverse：GGGTTACCTCAACACCCCGAGTTGCGTCG)所示的引物序列，克隆获得带有酶切连接位点(SpeI和BstEII)的hANNAT基因表达盒；以密码子优化后的hAMST基因序列作为模板，利用如SEQ IDNO.5(hAMST-YH-SpeI-Forward：CGGACTAGTATGGGCTCATCTGAAGACCA)和SEQ ID NO.6(hAMST-YH-BstEII-Reverse：GGGTTACCTCATTTTCTCGCCAGTATGCCGT)所示的引物序列，克隆获得带有酶切连接位点(SpeI和BstEII)的hAMST基因表达盒。将以上获得的hANNAT基因和hAMST基因的表达盒分别连入经双酶切(SpeI和BstEII)的pCAMBIA1303-Hygro和pCAMBIA1303-Bleo线性载体，分别构建含有hANNAT基因的pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT表达载体，以及含有hAMST基因的pCAMBIA1303-Bleo-hAMST表达载体。利用PEG-CaCl2介导的方法，将pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT和pCAMBIA1303-Bleo-hAMST真菌表达载体，转入到绿色木霉原生质体中，经过潮霉素和博来霉素共筛选，得到能够同时表达hANNAT和hAMST的绿色木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST。
上述木霉工程菌株的发酵液中能够检测到褪黑素的含量，产量可到21.26mg/L，表明转入hANNAT和hAMST基因增强了绿色木霉合成褪黑素的能力。上述木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST在木霉生长和产孢中的应用及效果显示，本发明构建的能够合成褪黑素的木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的生长速度和生物量明显高于出发菌株，而且其产生厚垣孢子的能力较出发菌株显著提高。
上述木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST在木霉耐受逆境胁迫中的应用及效果显示，本发明构建的能够合成褪黑素的木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST能够显著提高出发菌株在盐胁迫和高温胁迫下的生长能力。
上述木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST在木霉耐受逆境胁迫中的应用及效果显示，本发明构建的能够合成褪黑素的木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST能够显著提高小麦、黄瓜和椒样薄荷的生长，较出发菌株有更强的植物促生能力。
上述木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST在植物病害生物防治中的应用及效果显示，本发明构建的能够合成褪黑素的木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST能够更有效的防治多种植物病原菌，较出发菌株具有更强的生物防治效能。
上述木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST在植物促生中的应用及效果显示，本发明构建的能够合成褪黑素的木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST能够更有效促进植物的生长。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
生物样品保藏信息：
Tv-1511，分类命名为绿色木霉(Trichodermaviride)，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年12月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.16800。
生物材料来源：
绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511为本实验室筛选鉴定的一株具有良好植物促生和生物防治能力的木霉菌株，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCCNo.16800；
大肠杆菌DH5α、T4连接酶试剂盒、高保真Taq酶等购自于南京诺唯赞公司；
表达载体构建质粒pCAMBIA1303-Hygro和pCAMBIA1303-Bleo由本实验室经pCAMBIA1303质粒改造而来，本实验室保存；
限制性内切酶KpnI和EcoRI购自于NEB公司；
卡那霉素、潮霉素B、博来霉素和溶菌酶购自于Sigma公司；
LB培养基、PDA培养基和PDB培养基等购自于青岛海博公司。
实施例1：hANNAT和hAMST基因序列的克隆及表达载体的构建
(1)hANNAT和hAMST基因表达盒的克隆
用化学合成的方法获得密码子优化后的hANNAT和hAMST基因序列。以密码子优化后的hANNAT基因序列作为模板，利用如SEQ ID NO.3(hANNAT-YH-SpeI-Forward：CGGACTAGTATGAGCACCCAGTCCACGCA)和SEQ ID NO.4(hANNAT-YH-BstEII-Reverse：GGGTTACCTCAACACCCCGAGTTGCGTCG)所示的引物序列，克隆获得带有酶切连接位点(SpeI和BstEII)的hANNAT基因表达盒；以密码子优化后的hAMST基因序列作为模板，利用如SEQ IDNO.5(hAMST-YH-SpeI-Forward：CGGACTAGTATGGGCTCATCTGAAGACCA)和SEQ ID NO.6(hAMST-YH-BstEII-Reverse：GGGTTACCTCATTTTCTCGCCAGTATGCCGT)所示的引物序列，克隆获得带有酶切连接位点(SpeI和BstEII)的hAMST基因表达盒。
利用高保真PCR聚合酶预混液(2×Phanta Master Mix，南京诺唯赞)进行PCR扩增，获得带有酶切连接位点(SpeI和BstEII)的hANNAT和hAMST基因表达盒；对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京诺唯赞)回收扩增出的DNA片段；将DNA片段连接T载体，测序验证序列的正确性，获得hANNAT和hAMST基因表达盒的完整序列。
(2)DNA片段及表达载体双酶切
将回收得到的hANNAT和hAMST的基因表达盒与载体pCAMBIA1303-Hygro和pCAMBIA1303-Bleo用限制性内切酶SpeI和BstEII(NEB公司)进行双酶切；对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶，利用DNA回收试剂盒(FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit，南京诺唯赞)回收酶切后的基因表达盒和线性化的pCAMBIA1303-Hygro和pCAMBIA1303-Bleo质粒。
(3)表达载体的构建及转化
DNA片段与表达载体的连接采用T4连接酶(南京诺唯赞)进行，将以上获得的hANNAT基因和hAMST基因的表达盒分别连入pCAMBIA1303-Hygro和pCAMBIA1303-Bleo线性载体，反应体系10μL。
取50μL DH5α感受态细胞与10μL连接体系混匀孵育进行质粒转化，转化后涂布到含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上；37℃培养12－20h后，挑取菌落至含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基上，37℃，200rpm培养12-20h后，送菌落PCR验证。
用无内毒素质粒大提试剂盒(FastPureEndoFree Plasmid Maxi Kit)提取经测序验证的表达载体pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT(图1中A)和pCAMBIA1303-Bleo-hAMST(图1中B)。
实施例2：原生质体制备及过表达工程菌株的构建
(1)原生质体制备
接种绿色木霉Tv-1511于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水(0.9％NaCl，0.05％Tween-20)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；
在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200μL孢子悬液涂布，28℃避光培养24h，使PDA平板上的孢子萌发；
配制溶解酶溶液：取0.15g溶解酶(Lysing enzyme，Sigma：L1412)溶于20mL溶液I(1.2M D-sorbitol,0.1M KH2PO4,pH 5.6)，0.2μM滤膜过滤除菌；
取出PDA平板，将长有菌丝的纤维膜取出并反向贴在含有3－4mL裂解液的平板上，于28℃、100rpm条件下处理100min；
在无菌超净台下将平板中的纤维膜取出，确保大部分菌丝体保留在平板中，在此过程中可以用溶液I冲洗纤维膜上残留的菌丝块，利用枪头反复吹吸液体中的菌丝块200次以上，充分释放内部的原生质体；
用装有4层纱布的1.5mL管过滤上述混合液，保留下层滤液并进行4℃离心，2000rpm离心10min，弃上清，保留底部的原生质体
加1mL溶液I，再次离心，弃上清；
加1mL 4℃预冷的溶液II(1M sorbitol,50mM CaCl2,10mMTris-HCl,pH7.5)，冰上得到原生质体；用血球计数板观察计数，稀释原生质体至107个/mL。
(2)原生质体转化及突变子筛选
冰上放置15mL离心管，分别加入200μL原生质悬浮液、10μL质粒载体、50μL PEG溶液(25％PEG600,50mM CaCl2,10mMTris-HCl,pH 7.5)；用枪头混匀，冰上放置20min；
加2mL PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液II，轻轻混匀；
加2mL混合液涂布在覆盖层析纸的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；
将条形层析纸转导含潮霉素和博来霉素两种抗生素的PDA平板上，28℃避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。
转化后，获得同时表达pCAMBIA1303-Hygro-hANNAT和pCAMBIA1303-Bleo-hAMST的转化子Tv-1511-hANNAT/hAMST共8株。
采用荧光定量PCR的方法检测hANNAT和hAMST的转录表达，扩增引物分别为：hAANAT-qPCR-sense：GAGATTCGCCACTTCCTG(SEQ ID NO.7)和hAANAT-qPCR-antisense：GCATCAGTCGTTCCTTGT(SEQ ID NO.8)；hASMT-qPCR-sense：GGTCAGCCAAGTCCTCTT(SEQ IDNO.9)和hASMT-qPCR-antisense：CAGCAGCGGTAAGAAGTG(SEQ ID NO.10)。结果表明，与出发菌株相比，绿色木霉工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST中可以检测到hANNAT和hAMST的转录表达(图2)。
实施例3：绿色木霉出发菌株及工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST发酵液中褪黑素含量的检测
将200μL木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株(Tv-1511-hANNAT/hAMST)的孢子分别接种于PDB液体培养基中，28℃，180rpm培养96h，每间隔24h取一次样。通过2层无菌纱布过滤菌丝体后，回收液体发酵液，回收的发酵液经10,000rpm离心后取上清，将上清液用0.45μm的滤膜过滤后待用。利用高效液相色谱仪对褪黑素进行定量定性检测。检测发酵液中的褪黑素含量。
结果显示，出发菌株(Wildtype)发酵液中检测不到褪黑素含量，而在Tv-1511-hANNAT/hAMST工程菌株中，随着培养时间的延长，褪黑素含量逐渐上升，在培养72h的发酵液中达到最大值，产量达到21.26mg/L(图3)。
实施例4：绿色木霉出发菌株及工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST生长和产孢特性的分析
(1)无菌孢子的收集
接种绿色木霉出发菌株及工程菌株于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水(0.9％NaCl，0.05％Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；用30％的甘油悬浮，充分混匀，分装到1.5mL离心管中，标记好名称和时间，-80℃冻存；取一管孢子液进行活菌计数，确定孢子液的浓度。
(2)生长和产孢特性的分析
将200μL木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的孢子分别接种于PDB液体培养基中，28℃，180rpm培养48h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。收集菌丝体，烘干后测定菌体生物量。
在PDA平板上活化木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST，28℃避光培养48－72h，使得出发菌株和突变工程菌株长势均一，再使用打孔器制备大小均一的菌块并转移到含有PDA平板中央。将接有菌块的平板置于28℃培养10天后，用10mL生理盐水(0.9％NaCl，0.05％Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液，活菌计数，确定孢子液的浓度。
结果显示，培养48h后，工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的生物量比出发菌株(Wildtype)显著提高(图4A)。培养10天后，工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的产孢量比出发菌株(Wildtype)显著增加(图4B)。
实施例5：绿色木霉出发菌株及工程菌株耐受胁迫能力的分析
木霉无菌孢子的收集如实施例3所述。
(1)液体摇瓶耐盐实验
将200μL木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的孢子分别接种于PDB液体培养基中，28℃，180rpm培养48h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将等量的菌丝体分别接种于含有300mMNaCl的PDB液体培养基中，28℃，180rpm培养72h，收集菌丝体，烘干后测定菌体生物量。
结果发现，300mMNaCl胁迫下，工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的生物量比出发菌株(Wildtype)显著提高了73.81％(图5A)。
(2)液体摇瓶耐热实验
将200μL木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的孢子分别接种于PDB液体培养基中，28℃，180rpm培养48h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将等量的菌丝体分别接种于新的PDB液体培养基中，35℃，180rpm培养48h，收集菌丝体，烘干后测定菌体生物量。
结果发现在35℃的培养环境下，工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的生物量比出发菌株(Wildtype)显著提高了85.37％(图5B)。
实施例6：绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511出发菌株及其工程菌株对病原菌的生物防治能力分析
(1)病原菌平板对峙实验
先在PDA平板上活化木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST，28℃避光培养48-72h，使得出发菌株和突变工程菌木霉长势均一。同时在PDA平板上活化不同的植物病原菌株。
使用打孔器分别切取木霉菌菌饼(直径5mm)与病原菌菌饼(直径5mm)接种于直径为9cm装有PDA的培养皿中，使2个菌饼直线距离为6cm，28℃暗培养3d，逐日观察抑制作用，测量病原菌菌落半径。
结果发现：与出发菌株相比，工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST对不同病原菌均表现出了更强的抑制效果(图6)。
(2)发酵液平板抑菌实验
将200μL木霉出发菌株(Wildtype)和工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的孢子分别接种于PD液体培养基中，28℃，180rpm培养48h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将等量的菌丝体转接于PD培养基中，180rpm，28℃培养7d，收集其发酵液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液置于无菌离心管中备用。
将10mL无菌木霉菌发酵液与40mL PDA 培养基混合均匀后倒平板，待其冷却后在平板一侧转接病原菌，28℃静置培养，逐日观察抑制作用，测量病原菌菌落半径。对照为10mL无菌PD培养基与40mL PDA培养基均匀混合倒平板。
结果发现：与出发菌株相比，工程菌株Tv-1511-hANNAT/hAMST的发酵液对不同病原菌均表现出了更强的抑制效果(图7)。
实施例7：绿色木霉出发菌株及工程菌株发酵液对植物促生能力的分析
供试植物为小麦(济麦22)和黄瓜(津研四号)。
挑选饱满一致的种子进行消毒处理，于25℃培养箱中遮光催芽至露白，然后进行16h光照/8h黑暗，培育一定时间后，挑选长势一致的幼苗移至水培装置，进行处理。以1/2Hoagland营养液为水培溶液的为对照组(CK)，以加入木霉出发菌株及工程菌株发酵液的处理组分别记为T1组和T2组，每个处理设置4个重复，处理7d后进行主根长、株高、叶宽、叶长、鲜重、干重等指标的测定。绿色木霉出发菌株及工程菌株发酵液对植物促生的影响如表1(小麦)和表2(黄瓜)所示。出发菌株及工程菌株发酵液都能有效促进小麦和黄瓜的生长，尤其是工程菌株发酵液促生效果更加明显。与出发菌株发酵液处理组T1相比，工程菌株发酵液处理组T2中，小麦的主根长、株高、叶宽、叶长分别增加了31.89％、24.79％、26.64％、32.73％、22.35％和40.74％(表1)，黄瓜的各项指标则分别增加了24.98％、20.41％、17.89％、24.78％、28.57％和34.55％(表2)。
表1 绿色木霉出发菌株及工程菌株发酵液对小麦幼苗生长的影响
表2 绿色木霉出发菌株及工程菌株发酵液对黄瓜幼苗生长的影响
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用
<130> 2021.11.09
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagcaccc agtccacgca ccctctcaag cccgaggctc caaggcttcc gcccggcatc 60
ccggaatctc ccagctgcca acggagacat acgctgccgg cctcggagtt tcgatgtctc 120
acacctgagg acgctgtgtc cgcgtttgag atagagagag aagcgtttat ttctgtcctt 180
ggcgtctgcc cgctgtatct cgacgagatt cgccacttcc tgacgctctg ccccgaactt 240
tccctgggct ggttcgagga gggctgcctg gttgcgttca tcatcggctc cctctgggac 300
aaggaacgac tgatgcagga aagcttgact ctacatcgct caggtggcca cattgcccac 360
ctgcacgtct tggctgtcca tcgtgcattc cgccagcagg gccgcggccc catcctcttg 420
tggcgctacc tgcatcacct cggatcgcaa ccagcagtga ggagggccgc cctcatgtgc 480
gaggatgccc tggtgccctt ttacgagcgg ttcagcttcc acgccgttgg accttgcgcc 540
atcaccgtcg gttcgttgac cttcatggag ctccactgca gtctacgggg gcatccgttt 600
ctccgacgca actcggggtg ttga 624
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<400> 2
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cccgggcccc ttgacgtggc ggccgtggcc gctggcgtac gggcatcagc ccatggaaca 180
gagctgctgc tagatatctg cgtctctctc aagctcttga aggtcgagac ccggggggga 240
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agtcagtgca gcatgctgaa gtacatgggt cgcacttctt accgctgctg ggggcatctg 360
gcagacgccg tccgcgaggg ccgcaaccag tacctggaaa cctttggcgt gcctgcagag 420
gaacttttca ctgcgattta tcgttcagaa ggcgagagat tacaattcat gcaggctctg 480
caggaggtct ggtccgtcaa cggccggtcc gtcctgaccg ccttcgacct cagtgttttt 540
ccactgatgt gcgacctggg aggcacctgg atcaagctgg agacaatcat cttgtcgaaa 600
ctgtcgcagg gccagaagac caagcacagg gtgttcagct tgattggcgg ggctggggct 660
ctcgccaagg agtgcatgag cctttatcct ggctgcaaga tcaccgtctt tgacattccg 720
gaagtggtgt ggacggcgaa gcagcacttt tcctttcaag aagaggagca gattgacttc 780
caagagggcg atttcttcaa ggacccgttg cccgaggccg atctgtacat cctggctcga 840
gttcttcacg attgggccga cggcaagtgt tcccatctcc ttgagaggat ttatcacacg 900
tgtaagcccg gaggtggcat cctcgtcatc gagtcgctct tggatgagga ccgccgaggc 960
ccacttctaa cgcagctcta cagcctcaac atgctcgtgc aaaccgaagg acaggaaagg 1020
actcccacgc actaccacat gttgctttcg agcgccggtt tccgcgactt tcagttcaag 1080
aagacgggcg ccatctacga cgcgatactg gcgagaaaat ga 1122
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggttacctc attttctcgc cagtatgccg t 31
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<212> DNA
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<400> 8
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagcagcggt aagaagtg 18

Claims (3)

1.经密码子优化后的芳烷基胺N-乙酰转移酶编码基因hAANAT和经密码子优化后乙酰复合胺-O-甲基转移酶编码基因hASMT在构建具有更好的生长和产孢特性，更强的逆境胁迫耐受能力，更高的病原菌拮抗性，以及更有效的植物促生能力的绿色木霉中的应用，其特征在于，
经密码子优化后编码基因hAANAT和经密码子优化后编码基因hASMT能够在绿色木霉中异源表达，分别形成具有活性的芳烷基胺N-乙酰转移酶和乙酰复合胺-O-甲基转移酶；
所述经密码子优化后编码基因hAANAT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；
经密码子优化后编码基因hASMT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；
所述逆境胁迫耐受能力为耐盐、耐热能力；
所述病原菌拮抗性中的病原菌为尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、棒孢菌、盾壳霉、立枯丝核菌和禾谷镰孢；
所述植物为小麦和黄瓜。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因hAANAT和hASMT来源于人基因组。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述绿色木霉Trichoderma viride为绿色木霉Trichoderma viride Tv-1511，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCCNo.16800。
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