CN117683794B - 一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因及其应用，属于基因工程技术领域，该PgCOMT2基因来自于受MeJA、JA‑Ile或COR诱导后的人参发根，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；该蛋白属于咖啡酸‑O‑甲基转移酶；通过在人参中过表达该基因，发现人参细胞中褪黑素和人参皂苷的含量增加；这种通过基因工程技术调控人参中褪黑素和人参皂苷合成的方法，对于提升人参品质、增加褪黑素和皂苷含量具有重要价值，为人参的品质改良研究提供新的思路和工具，有助于推动人参产业的可持续发展和药用植物资源的高效利用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因及其应用。
背景技术
褪黑素（melatonin），其化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一种在哺乳动物和人类体内由松果体产生的结构简单、低分子量的吲哚类激素。在生物学与医学领域，褪黑素因其多重生理功能而备受关注，它具有促进睡眠、调节时差、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等作用，已被广泛应用于保健和医疗产品中。近年来，研究不仅关注褪黑素在哺乳动物和人类中的作用，还扩展到了其在植物中的功能，研究证实，褪黑素在植物中同样广泛存在，并在抵御低温、干旱、盐胁迫、病虫害等环境胁迫中发挥重要的调控作用。外源施用适宜浓度褪黑素可以促进作物生长，提高其产量和品质，并增强其抗逆性。对于一些具有重要药用价值的植物来说，褪黑素的存在不仅成为药用植物治疗疾病的重要物质，适度提高植物内源性褪黑素不仅会刺激药用植物中特定的次生代谢产物的产生，从而保护细胞不受损害，提高了植物的抗逆性，也有助于提升药用植物的品质和利用价值。
然而，植物中褪黑素生物合成途径十分灵活与复杂，除了一些拟南芥等模式植物中部分褪黑素合成关键基因被鉴定外，其它非模式植物中褪黑素的合成基因及机制尚不清楚，这些限制了褪黑素调控机理的研究及其在分子育种的应用。
研究发现，不同植物物种中褪黑素含量变化很大，如何充分利用高价值的药用植物内源性褪黑素仍是目前有待解决的问题；植物中的褪黑素合成途径之一是从色氨酸开始，通过芳族氨基酸脱羧酶转化为5-羟色胺（serotonin，5-HT），再经芳基烷基胺N-乙酰转移酶将5-HT转化为N-乙酰基丝氨酸（N-acetylserine，NAS）。最后一步是通过羟基吲哚-O-甲基转移酶（N-acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT）将NAS甲基化转化为褪黑素；一些研究表明ASMT是褪黑素合成过程中的最后一个酶，具有限速作用。除了ASMT，部分咖啡酸O-甲基转移酶（caffeic acid O-methyltransferase，COMT）也具有ASMT活性，亦发现部分COMT能够催化NAS产生褪黑素。因此，克隆和鉴定植物中参与褪黑素生物合成的COMT基因，有利于利用COMT提高植物产量、特定代谢产物含量和品质。
人参（Panax ginseng C. A. Meyer）被誉为名贵的中药材，具有悠久的使用历史，其独特的药效成分——人参皂苷，为它赢得了极高的声誉；然而，为了充分发挥人参的最佳治疗效果，高品质的药材是至关重要的。遗憾的是，由于野生人参资源的日益减少和人工种植人参受环境影响较大，高品质的人参药材变得非常稀缺。关键在于，人参中人参皂苷的组成与含量受到生物合成途径中一系列关键酶基因的调控，这些基因的表达水平和功能受到多种因素的影响，如激素调节和生物胁迫等。
发明内容
为了提升人参的药效和品质，通过调控PgCOMT2基因，可以促进植物合成更多的褪黑素和人参皂苷，旨在为人参的品质改良和提高药用活性成分人参皂苷等的含量研究提供新的思路和工具。
为达到上述目的，本发明首先提供了一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因，所述PgCOMT2基因序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述PgCOMT2基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述PgCOMT2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，所述PgCOMT2基因的获得方法为：系统地筛选出受外源物质MeJA（茉莉酸甲酯）、JA-Ile（茉莉酸异亮氨酸）和COR（冠菌素）诱导的人参COMT家族基因，通过与人参皂苷生物合成酶基因的表达模式、人参皂苷积累规律进行比较分析筛选。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因的重组载体，所述PgCOMT2基因与植物表达载体连接。
作为优选，所述植物表达载体为pCAMBIA1302。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因或促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因的重组载体在提升人参抗逆性和褪黑素、人参皂苷含量的应用。
作为优选，所述应用方法为：通过过表达所述PgCOMT2基因，提高人参细胞中褪黑素和人参皂苷的含量。
下面对本发明作进一步说明：
本方案克隆了PgCOMT2基因，并在褪黑素和人参皂苷合成方面进行了应用研究，发现褪黑素与人参皂苷的合成密切相关，通过调控PgCOMT2基因，可以促进植物合成更多的褪黑素和人参皂苷，从而提高人参药材的品质和人参皂苷的产量。
首先，通过茉莉酸甲酯（MeJA）、茉莉酸异亮氨酸（JA-Ile）和冠菌素（COR）诱导的人参基因差异表达的转录组测序分析，筛选出一系列受上述物质诱导的COMT家族基因，在众多COMT基因中，PgCOMT2基因尤为引人注目，该基因的表达模式与褪黑素和人参皂苷的合成密切相关。
进一步的研究表明，通过农杆菌A4介导的遗传转化，将PgCOMT2基因导入人参叶片中，可以实现瞬时过表达，这种过表达可以显著提高人参细胞中褪黑素和人参皂苷的含量。基于这些研究结果，可以得出结论：利用过表达PgCOMT2基因的方法可以有效地提高人参中褪黑素和人参皂苷的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明采用转录组测序技术，系统地筛选出受外源物质MeJA、JA-Ile和COR诱导的人参COMT家族基因，通过与人参皂苷生物合成酶基因的表达模式、人参皂苷积累规律进行比较分析筛选出PgCOMT基因，为后续研究提供了更为精准的候选基因。
（2）通过深入研究PgCOMT2基因的作用机制，更好地了解其在调节褪黑素、人参皂苷生物合成和提高抗逆性方面的作用。这不仅有助于提升人参的药用价值，还为药用植物的可持续发展提供了有益的参考。
（3）本发明采用瞬时过表达PgCOMT2基因的方法，能够快速、有效地提高人参中褪黑素和人参皂苷的含量，这充分证明了利用过表达PgCOMT2基因能够显著提高褪黑素和人参皂苷含量，为提高人参品质提供了一种高效的技术手段和新的途径。
（4）本发明提供了一种利用人参PgCOMT2基因促进人参中褪黑素合成的同时提高人参皂苷含量的方法，该方法基于先进的基因表达分析技术，通过瞬时过表达PgCOMT2基因，可以实现高效的人参品质改良。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1所获得的PgCOMT2基因结构示意图；
图2是本发明实施例1克隆的PgCOMT2基因编码蛋白同源进化关系图；
图3是本发明实施例2中qRT-PCR检测MeJA、JA-Ile和COR处理后人参发根中PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因的表达水平；
图4是本发明实施例2中MeJA、JA-Ile和COR处理后人参发根中人参皂苷的含量；
图5是本发明实施例3中PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因qRT-PCR分析结果；
图6是本发明实施例3中PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中褪黑素含量结果；
图7是本发明实施例3中PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中人参皂苷含量测定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
实施例1
PgCOMT2基因的获得
1、人参中总RNA的提取及cDNA的合成
（1）人参中总RNA提取
将新鲜4年生人参根诱导的发根在无菌条件下接种于1/2MS（无机盐为MS培养基的一半）固体培养基中，并在25℃下暗培3周，确保其生长旺盛。将这些生长旺盛的人参发根转移到1/2MS液体培养基中，在120rpm、25℃下继续暗培养3周。在培养基中分别加入终浓度为10μmol/L的MeJA、1μmol/L的JA-Ile和1μmol/L的COR，继续培养48h后收集人参发根。以Trizol法从这些人参发根中提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，确保其质量和纯度符合后续实验的要求。
人参cDNA的合成
以提取的人参总RNA为模板，使用oligod(T)18为引物，通过反转录合成人参cDNA，将合成的人参cDNA置于-20℃保存，备用。
2、PCR扩增克隆人参PgCOMT2基因
对COR诱导的人参发根转录组测序结果进行分析，根据筛选得到的人参PgCOMT2基因序列设计PgCOMT2基因PCR扩增特异性引物，PgCOMT2基因扩增所用的引物序列见SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3。
PgCOMT2-F：5′-ATGGTAGCTGTTTGTGGTCCC-3′；（SEQ ID NO.2）
PgCOMT2-R：5′-TCACATTTTTTTGTAGAGCTC-3′；（SEQ ID NO.3）
PgCOMT2基因PCR扩增的条件如下：预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，退火56℃30s，72℃ 30s，35个循环；终延伸72℃ 7min。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳进行分析，然后对目标电泳条带进行胶回收和测序，测序结果见SEQ ID NO.1，其开放读码框（ORF）的长度为909bp，与其基因组序列比较发现该ORF由5个外显子所组成，如图1所示，图中ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，Exon为外显子，Intron为内含子，该基因被4个内含子分为5个外显子；
该ORF编码蛋白序列见SEQ ID NO.4，其包含302个氨基酸，对编码蛋白序列在NCBI中进行序列比对分析，结果表明该基因编码蛋白为咖啡酸O-甲基转移酶（COMT），其同源进化关系如图2所示。
实施例2
荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因的表达模式
1、RNA提取及其反转录
将人参发根接种于无激素的1/2MS固体培养基中25℃暗培养3周后，取生长旺盛的人参发根，接种于1/2MS液体培养基中，在120rpm、25℃暗培养3周，然后在培养基中分别加入终浓度为1μmol/L、10μmol/L的COR和100μmol/L的MeJA，继续培养48h后分别收集人参发根，并以Trizol法提取人参总RNA，备用。以oligod（T）18为引物，逆转录合成cDNA，以β-actin作为内参，β-actin、PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因的qRT-PCR引物如下：
β-actin基因qRT-PCR引物F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；（SEQ ID NO.5）
β-actin基因qRT-PCR引物R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′；（SEQ ID NO.6）
PgCOMT2基因qRT-PCR引物F：5′-TGGTAGCTGTTTGTGGTCCC-3′；（SEQ ID NO.7）
PgCOMT2基因qRT-PCR引物R：5′-CTGGATGGTCAAGCCCAAGT-3′；（SEQ ID NO.8）
PgSE基因qRT-PCR引物F：5′-TGGCCTAAACCCGCGTCCAA-3′；（SEQ ID NO.9）
PgSE基因qRT-PCR引物R：5′-AGCGCCGAGCCACATTCGT-3′；（SEQ ID NO.10）
PgDDS基因qRT-PCR引物F：5′-TGAGATTAGATGAAAACGAAC-3′；（SEQ ID NO.11）
PgDDS基因qRT-PCR引物R：5′-GGCAATGATAAGGGGAGGTGT-3′；（SEQ ID NO.12）
2、qRT-PCR分析人参PgCOMT2和人参皂苷合成酶基因表达模式
该实施例qRT-PCR扩增采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒，在25µL的反应体系中分别加入：2×SYBR® Premix Ex TaqTM II 12.5µL，正向和反向引物（10μM）各0.5µL，cDNA模板0.5µL，ddH2O 11µL。qRT-PCR扩增反应的条件为：预变性95℃ 1min，变性95℃ 40s，退火60℃ 30s，40个循环；变性95℃ 15s，退火60℃ 60s，变性95℃ 15s，1个循环。每个样品3个重复，待反应结束后根据扩增曲线和溶解曲线判断反应的特异性，最后采用2-ΔΔCt法分析各个基因的表达模式。
图3和图4是100μmol/L的MeJA、1μmol/L的JA-Ile和1μmol/L的COR处理48h后人参发根中PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因的表达水平以及人参皂苷含量。以水作为对照处理的人参发根作为对照CK；与对照CK相比，PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因的表达受MeJA（2.47、5.39和4.86倍）、JA-Ile（3.61、4.95和6.60倍）和COR（7.25、7.10和7.27倍）的诱导，并且表达模式具有很高的相似性。与对照（CK）相比，MeJA、JA-Ile和COR诱导后人参皂苷的含量为对照的4.10、4.07和5.10倍；这表明PgCOMT2可能参与了人参皂苷的合成代谢途径，这一结果为深入研究PgCOMT2基因在人参皂苷合成中发挥的作用提供重要线索。
实施例3
PgCOMT2基因植物表达载体的构建及其在人参愈伤组织中瞬时表达
1、PgCOMT2基因表达载体的构建
（1）PCR扩增PgCOMT2基因片段
根据PgCOMT2基因序列设计引物以扩展其cDNA全长，扩增引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，并以Bgl II限制性核酸内切酶酶切pCAMBIA1302制备线性化载体，将PCR扩增产物和线性化的载体胶回收。同源重组PCR扩增引物如下：
PgCOMT2-F1：5′-GGACTCTTGACCATGGTAGCTGTTTGTGGTCCC-3′；（SEQ ID NO.13）
PgCOMT2-R1：5′-TCGCCTTTGGAAGTTGAATGCCTCACATTTTTTTGTAGAGCTC-3′；（SEQ IDNO.14）
PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min。
（2）pCAMBIA1302-PgCOMT2载体构建及农杆菌A4的转化
将PgCOMT2基因连接至pCAMBIA1302载体，连接后经PCR和测序鉴定正确后，构建的载体命名为pCAMBIA1302-PgCOMT2。将构建好的pCAMBIA1302-PgCOMT2以冻融法转化农杆菌A4，转化后阳性克隆以PCR进行筛选。再经测序鉴定成功后获得含PgCOMT2基因过表达载体的农杆菌。
2、农杆菌介导转化人参愈伤组织
（1）含pCAMBIA1302-PgCOMT2的农杆菌培养
挑取含pCAMBIA1302-PgCOMT2载体的农杆菌和对照农杆菌（含空载体pCAMBIA1302）单菌落分别接种于含有卡那霉素的50mL LB液体培养基(用于培养细菌的培养基)中培养24h。取1mL菌液转接至50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，并在其中加入10μL 100mmol/L乙酰丁香酮（acetosyringone，AS），28℃培养过夜。培养液5000rpm、4℃离心15min，收集菌体，用1/2MS液体培养基清洗3次后，用1/2MS+乙酰丁香酮（终浓度为20μmol/L）液体培养基将菌液稀释至OD600（在600nm波长处的吸光值）为0.8左右，作为侵染液。
（2）农杆菌介导PgCOMT2基因转化人参愈伤组织
取4年生人参新鲜根诱导的愈伤组织，分别放入含有pCAMBIA1302-PgCOMT2和pCAMBIA1302的农杆菌A4侵染液中5min，用无菌滤纸吸干菌液，置于1/2MS+2,4D（2,4-二氯苯氧乙酸）的培养基上避光共培养5d。
（3）qRT-PCR分析瞬时过表达PgCOMT2后的基因表达水平
取农杆菌与愈伤组织共培养5d后的人参愈伤组织，用无菌去离子水清洗吸干表面水分后，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，反转录合成cDNA，qRT-PCR分析基因表达水平，PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因所用引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12，内参基因β-actin所用引物为SEQ ID NO.5和 SEQ IDNO.6。
图5是PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中PgCOMT2、PgSE和PgDDS基因qRT-PCR分析结果，其中CK为转空载体pCAMBIA1302后的人参愈伤组织作为对照；TE为PgCOMT2基因瞬时过表达（Transient overexpression）的人参愈伤组织，其中TE4和TE9分别为筛选获得的瞬时过表达PgCOMT2基因的2个人参愈伤组织；与对照CK相比，TE4和TE9中人参愈伤组织PgCOMT2基因表达水平显著增加（4.56和3.66倍），PgSE和PgDDS基因表达亦明显上调，PgSE分别增加1.42和1.55倍，PgDDS分别增加1.61和1.43倍，表明PgCOMT2基因过表达的人参细胞中人参皂苷合成关键酶基因表达亦上调。
（4）人参细胞中褪黑素提取及含量测定
取新鲜的人参愈伤组织置于液氮中研磨至细粉，称取适量研磨的细粉，加入磷酸缓冲液提取液，4℃振荡5min；4℃ 10000r/min离心10min，取上清液；参照植物褪黑素ELISA检测试剂盒说明书中方法，测定450nm波长下上清反应液的吸光度值，计算褪黑素含量。
图6是PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中褪黑素含量测定结果；其中CK为转空载体pCAMBIA1302后的人参愈伤组织作为对照；TE为PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织，其中TE4和TE9分别为筛选获得的瞬时过表达PgCOMT2基因的2个人参愈伤组织；与对照CK相比，基因过表达的人参愈伤组织TE4和TE9的褪黑素的含量增加1.56和1.62倍。表明过表达PgCOMT2基因后，可以明显提高褪黑素的含量；
（5）人参愈伤组织中人参皂苷含量测定
取上述共培养后的新鲜的人参愈伤组织，ddH2O清洗干净后以60℃干燥，研磨成细粉，用80%甲醇60℃浸提（1g:40mL），超声波提取3次，每次15min；60℃蒸干甲醇，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃水浴蒸干正丁醇，再用适量的甲醇溶解后待测。
人参皂苷含量测定采用HPLC法测定，测定的流动相为乙腈:1%甲酸，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2和Rg3作为标准品分别测定样品中的各皂苷单体的含量，再以各皂苷单体含量之和代表人参细胞中总皂苷的含量。
图7是PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中人参皂苷含量测定结果；其中CK为转空载体pCAMBIA1302后的人参愈伤组织作为对照；TE为PgCOMT2基因瞬时过表达的人参愈伤组织，其中TE4和TE9分别为筛选获得的瞬时过表达PgCOMT2基因的2个人参愈伤组织；与对照CK相比，TE4和TE9人参愈伤组织中人参皂苷的含量分别增加1.53和1.76倍，表明可以应用PgCOMT2基因提升褪黑素的同时可以提高人参皂苷的含量，同时，褪黑素在现有技术中已研究出在增强植物抗逆性方面起着非常重要的作用，可以缓解重金属、盐离子等化学物质、紫外辐射、温度变化等逆境压力对高等植物的损害，人参皂苷可做为植物调节剂调节植物的生长以及在胁迫环境下的适应，因此，本方案能够提升人参抗逆性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因，其特征在于，所述PgCOMT2基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因，其特征在于，所述PgCOMT2基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因，其特征在于，所述PgCOMT2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因，其特征在于，所述PgCOMT2基因的获得方法为：筛选出受外源物质MeJA、JA-Ile和冠菌素诱导的人参COMT家族基因，通过与人参皂苷生物合成酶基因的表达模式、人参皂苷积累规律进行比较分析筛选。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因的重组载体，其特征在于，所述PgCOMT2基因与植物表达载体连接。
6.根据权利要求5所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因的重组载体，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1302。
7.一种如权利要求1-4任一项所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的PgCOMT2基因或如权利要求5-6任一项所述的促进人参中褪黑素和人参皂苷合成的的PgCOMT2基因的重组载体在提升人参褪黑素、人参皂苷含量的应用，所述应用的方法为：通过过表达PgCOMT2基因，提高人参细胞中褪黑素和人参皂苷的含量。
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