CN113549630B - 一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应用 - Google Patents

一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应用。所述基因来源于人参(Panax ginseng C.A.Meyer)并命名为PgJAZ1，其编码的蛋白具有JAZ家族特有的保守TIFY结构域和jas结构域。将构建的PgJAZ1基因RNA干扰载体转化人参根，获得PgJAZ1基因沉默的人参发根。与对照人参发根相比，PgJAZ1基因沉默的人参发根中原人参三醇型皂苷的含量和总皂苷的含量均显著增加。研究表明利用PgJAZ1基因调节人参发根中内源性茉莉酸甲酯的含量以调节原人参三醇型皂苷和总皂苷的生物合成。本发明在人参中利用PgJAZ1基因增加原人参三醇型皂苷产量和提高人参品质方面有着重要的应用价值。

Description

一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的 方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应用。
背景技术
人参皂苷是我国名贵中药人参中最重要的药效成分，人参皂苷根据其母核上糖苷键的位置、种类和数量，分为达玛烷型和齐墩果酸型皂苷，其中最重要的达玛烷型皂苷又分为原人参二醇型皂苷(Protopanaxdiol-type，PPD型，主要包括包括Rb1、Rb2、Rc和Rd等)和原人参三醇类皂苷(Protopanaxtriol-type，PPT型，包括Re和Rg1等)。迄今为止，已经分离并确定了结构的人参皂苷有100余种(J Ginseng Res 2020；44(4)：552–62)，而且PPT型人参皂苷占总皂苷的30％左右。中国药典在人参相关的药材质量检测中明确要求以人参皂苷Re和Rg1作为药材品质检测的指标，按干燥品计算，其中人参根及其饮片中人参皂苷Re和Rg1的总量不得少于0.3％；人参叶含人参皂苷Re和Rg1的总量不得少于2.25％；人参茎叶总皂苷中人参皂苷Re、Rg1和Rd的总量应该在30-40％(2020版药典)。研究发现许多人参皂苷单体在抗肿瘤、抗衰老和增强免疫力等方面具有独特的药理作用，临床应用十分广泛(JGinseng Res 2018；42(1)：98–106.Food Funct 2020；11(1)：456–71.BiomedPharmacother 2020；132：110832)。然而，由于野生的人参资源匮乏，人工种植的人参中人参皂苷含量低，使得高品质的人参产业化发展受到限制。高品质人参是具有高含量的人参皂苷等药效成分，而人参皂苷的组成与含量受人参皂苷生物合成关键酶及相关基因的高度调节。研究发现，施加外源性的茉莉酸及其衍生物如茉莉酸甲酯可以显著增加人参皂苷生物合成途径中的关键酶基因如FPS、SS、SE、DDS、β-AS和P450等的表达水平，最终实现人参皂苷的含量提高(Int J Mol Sci 2019；20(9).J Exp Bot 2017；68(16)：4725)。然而，外源性的茉莉酸类通常会对细胞的生长产生抑制。因此，通过分子水平调节人参内源性茉莉酸类的合成，进而实现对人参皂苷生物合成代谢相关基因的调控，以提高人参皂苷含量和人参的药用价值。
JA及其挥发性衍生物MeJA统称为茉莉酸类(JAs)，是植物体内重要的生物信息素，是起整体性调控作用的植物生长调节物质，也是植物受外界刺激后反应最快的植物激素。在植物信号转导和抗逆反应中发挥重要作用，常作为外源性的诱导剂或信号物质，以提高植物中的次生代谢产物(Sci Rep 2016；6：20919.Trends Plant Sci 2012；17(6)：349–59)。内源性JAs合成途径的激活对于应激信号的传递和放大是必不可少，其合成起始于细胞膜释放的α-亚麻酸(α-linolenic acid)(以及亚油酸)，在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase，AOS)、丙二烯氧化物环化酶(alleneoxide cyclase，AOC)和12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxophytodienoic acid reductase，OPR)的催化下，再经过三个β-氧化反应生成JA，在茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonate O-methyltransferase，JMT)催化下将JA甲基化形成重要的挥发性衍生物MeJA(Trends Genet2003；19(7)：409–13)。JAZ蛋白是JA信号通路中的一种关键调控蛋白，在正常情况下，植物体内JAs含量很低，JAZ抑制MYC等转录因子的活性，JA响应基因的表达被抑制，JA信号途径处于关闭状态。当受到外界胁迫时，JA信号通路被激活，JA合成迅速增加，JAZ蛋白被COI1结合并经过泛素化作用降解，转录因子被释放，从而启动JA应答基因的转录。在JA应答开启时，JAZ同时被诱导表达以正反馈调节的方式使转录因子的活性处于合适水平，以保护植物体自身免于过于强烈的JA应答反应的伤害(Nature 2007；448(7154)：666–71.Nature2007；448(7154)：661–5)。尽管茉莉酸类化合物的合成途径已经比较清楚，但是茉莉酸的信号传导途径及其调控植物次生代谢产物的的分子机制并不清楚。
由于JAZ家族成员众多，它们之间的功能存在很大差异(Front Plant Sci 2021；12：630424)。在丹参中发现的JAZ基因家族中，SmJAZ1和SmJAZ2通过与SmMYC2a和SmMYC2b互作正向调节丹参酮和丹酚酸B的合成(Sci Rep 2016；6：22852)。而SmJAZ3和SmJAZ9则负调控丹参酮的生物合成和JA信号通路(Sci Rep 2016；6：20919)。研究发现，JAs的合成途径中所有基因包括LOX、AOS、AOC、OPR和JMT的转录均受到JAs诱导，表明JAs的合成途径属于正反馈调控，包括调控JAs合成的JAZ基因亦受JAs的诱导(J Agric Food Chem 2020；68(18)：5270–81)。JA合成途径基因的过量表达又促进JA的合成，如番茄中过表达LeAOC基因提升了花中JAs的含量(Phytochemistry 2004；65(7)：847–56)，这种正反馈回路使信号效应逐级放大，进而诱导后续的反应。人参中药效成分人参皂苷的含量很低，目前主要通过提高人参皂苷生物合成的一系列关键酶基因表达水平调控整个代谢途径以增加目标产物的含量。而JAs生物合成的这种正反馈使得可以通过内源JAs的提高调控次人参皂苷合成途径中多个基因表达，进而提高目标次生代谢产物的合成与积累是一种可行的方式。与单纯加强代谢途径中单一或若干步骤的表达相比，在转基因植物中积累信号分子和植物激素，特别是通过JA生物合成途径的基因工程提高JAs的含量，从整体上调控受JA诱导的目标次生代谢过程中多个关键酶基因的表达，可能是一个全面调控目标化合物合成的更加有效的方法。
综合上述的研究背景，在人参中可能也存在大量的JAZ基因家族，其中可能会包含能够调控人参内源性JAs的含量的JAZ基因，通过这些基因调控内源性JAs含量，以内源性的JAs调节人参皂苷生物合成过程中的一系列基因，最终实现人参皂苷的大量合成与积累，达到提高人参皂苷产量和提升人参品质的目的。
关于人参中JAZ基因的克隆和功能研究未见报道。我们克隆并筛选出人参PgJAZ1基因，并发现其能够高效调节人参内源性JAs生物合成，可以利用该基因高效调控人参皂苷特别是PPT型人参皂苷生物合成与积累。该方法是一种高效、特异性和切实可行的提高PPT型人参皂苷的方法。
发明内容
本发明旨在在于寻找能高效提高PPT型人参皂苷含量的功能基因，进而提供一种提高人参中PPT型人参皂苷及总皂苷含量的方法，为开发人参皂苷含量高的高品质人参种质资源提供技术手段。
为了达到上述目标，本发明提供的技术方案为：
本发明的研究发现人参中发现一系列JAZ家族基因，其中多个人参JAZ基因受茉莉酸类的诱导，且基因的表达与内源性的茉莉酸类化合物及人参皂苷的含量密切相关。通过RNAi技术在人参发根中干扰PgJAZ1基因的表达，获得转基因人参发根体系，检测发现人参PgJAZ1基因沉默的人参发根中PPT型人参皂苷的含量远高于野生型的人参发根。基于这些研究结果可知，利用基因干扰、沉默或敲除PgJAZ1基因可以获得PPT型人参皂苷和总皂苷含量高的人参。
具体而言，本发明提供了一种人参PgJAZ1基因，所述人参PgJAZ1基因的基因序列如SEQ ID N0.1所示。
本发明还提供了一种人参PgJAZ1基因编码蛋白，所述人参PgJAZ1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。该人参PgJAZ1基因编码蛋白经过1至20个氨基酸残基的取代、缺失或添加可衍生出具有与人参PgJAZ1基因编码蛋白相同功能的蛋白。
本发明所述人参PgJAZ1基因可用于在人参中提高原人参三醇型皂苷含量。
进一步地，是通过基因编辑、干扰、沉默或敲除所述人参PgJAZ1基因，提高人参发根、细胞、组织和植株中原人参三醇型皂苷含量。
更进一步地，是通过构建所述人参PgJAZ1基因的RNAi载体并转化人参，提高人参发根、细胞、组织和植株中原人参三醇型皂苷含量提高的人参发根、细胞、组织和植株。
进一步地，所述人参PgJAZ1基因的RNAi载体通过如下方式进行构建：以所述人参PgJAZ1基因的特异性DNA片段作为干扰序列，将该特异性DNA片段以正反两个方向插入到植物表达载体pKANNIBAL中，再将pKANNIBAL表达载体的左边界和右边界序列之间的表达框插入到植物表达载体pART27中；所述人参PgJAZ1基因的特异性DNA片段如SEQ ID No.3所示。所述人参PgJAZ1基因的RNAi载体中，两个插入方向相反的PgJAZ1基因特异性DNA片段上游包含一个组成型启动子CaMV35S，下游包含章鱼碱合成酶终止序列(OCS)，两条特异性DNA片段中间包含有磷酸双激酶(Pdk)内含子以提高RNAi作用效率。
下面对本发明作进一步说明：
本发明提供的用于提高原人参三醇型皂苷的基因属于JAZ家族蛋白基因，PCR扩增结果如图1所示，该基因来源于人参(Panax ginseng C.A.Meyer)并命名为PgJAZ1，基因序列如SEQ ID N0.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示，该蛋白序列的108–141和191–215氨基酸之间分别含有TIFY和CCT2两个保守的功能结构域，属于JAZ家族特有的保守TIFY结构域和jas结构域。qRT-PCR分析显示PgJAZ1基因和人参皂苷合成关键酶基因PgSS、PgSE和PgDDS受MeJA诱导表达，并且具有相似的表达模式(图2和图3)。
本发明所用的人参PgJAZ1基因可以是cDNA序列(SEQ ID N0.1)，也可以是其对应的基因组序列，或者是与PgJAZ1基因序列高度同源，通常在95％以上，且编码蛋白具有相同功能的DNA序列。
本发明通过RNAi技术构建了PgJAZ1基因沉默的RNAi植物表达载体，获得了PgJAZ1基因低水平表达的转基因人参发根，与对照人参发根相比，获得的PgJAZ1基因沉默人参发根中PPT型人参皂苷和总皂苷含量显著提高。由此说明，利用基因编辑、基因沉默、基因干扰或基因敲除PgJAZ1基因能够获得PPT型人参皂苷含量显著提高的人参发根、细胞、组织或植株，为提高人参品质或提高PPT型人参皂苷产量提供了一种高效的技术手段。
本发明的一个具体实施例中，所构建的PgJAZ1基因的RNAi载体中，先将PgJAZ1中特异性序列SEQ ID No.3通过两个插入方向相反的方式插入到植物表达pKANNIBAL载体中，构建的载体包含一个组成型启动子CaMV35S，下游包含章鱼碱合成酶终止序列(OCS)，两条特异性DNA片段中间包含有磷酸双激酶(Pdk)内含子。然后将含有PgJAZ1基因RNAi表达框的片段插入到pART27植物表达载体。最后，将质粒转入发根农杆菌A4，并经由农杆菌将此质粒转化新鲜的人参根。通过Real-time PCR(qRT-PCR)方法对PgJAZ1基因的干扰效率进行检测。结果表明获得的转基因人参发根中PgJAZ1基因表达水平显著下降，PgJAZ1基因表达得到有效的干扰(图6)。PgJAZ1基因沉默的人参发根中PPT型皂苷含量显著提升。与对照组相比，PgJAZ1基因沉默的发根中PPT型人参皂苷最高可以提高2.63倍；与MeJA诱导的发根相比，PgJAZ1基因沉默的发根中PPT型人参皂苷最高可以提高2.21倍(图7)。
总之，本发明利用现有的植物基因工程技术，利用人参PgJAZ1在内源性茉莉酸合成通路中的重要作用，通过其调节内源性茉莉酸类化合物的合成实现对人参皂苷积累的调控。并根据PgJAZ1基因设计特异性的RNAi干扰序列，在人参发根中沉默PgJAZ1基因表达，实现人参总皂苷、特别是PPT型人参皂苷含量的提高，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参，获得PPT型人参皂苷含量高的优良植物品种，也是一种切实可行的生产PPT型人参皂苷的有效方法。
附图说明
图1是本发明通过PCR扩增的PgJAZ1基因电泳结果；图中，1表示PCR扩增产物，M表示DNA标准分子量；
图2是荧光定量PCR(qRT-PCR)检测100μmol/L的外源性MeJA诱导不同时间后PgJAZ1基因表达水平；以β-actin作为内参；与0h相比，PgJAZ1的表达受MeJA诱导；
图3是100μmol/L的外源性MeJA处理后人参发根中人参皂苷生物合成关键酶基因表达情况；其中PgSS为鲨烯合成酶基因；PgSE为鲨烯环氧酶基因；PgDDS为达玛烯二醇合成酶基因；以β-actin作为内参；与0h相比，PgSS、PgSE和PgDDS的表达均受MeJA诱导；
图4是100μmol/L的外源性MeJA处理后人参发根中人参皂苷含量；其中PPD为原人参二醇型皂苷；PPT为原人参三醇型皂苷；Total为人参总皂苷；与处理0h的对照相比，MeJA诱导后，PPT型人参皂苷(Re和Rg1)含量未出现明显的增加，即使在72h时，含量为2.33mg/g，仅为对照的1.47倍。然而PPD型人参皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd和Rg3)含量显著增加，与0h相比，处理12h、24h、48h和72h后，分别增加了2.01、5.74、9.10和12.27倍。在处理72h后，总皂苷因为PPT型皂苷含量的变化较小仅增加7.15倍；
图5是PgJAZ1基因RNAi载体构建示意图，该基因干扰载体中，PgJAZ1基因的RNAi序列分别以正反两个方向插入在植物表达载体Pdk intron的两侧；受CaMV 35S启动子的启动，受OSC终止子的终止；其中LB和RB分别代表左边界和右边界序列；NPT表示卡那霉素抗性基因；
图6为PgJAZ1基因沉默的人参发根PCR及qRT-PCR鉴定；其中CK为非PgJAZ1基因沉默的发根作为对照，即转pART27空载体筛选得到的人参发根；T2、T17和T32为转PgJAZ1基因RNAi载体筛选得到的转基因人参发根；与对照CK相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的PgJAZ1基因表达水平均显著下调，成功获得PgJAZ1基因沉默人参发根；
图7为PgJAZ1基因沉默的人参发根中皂苷含量测定；其中CK为非PgJAZ1基因沉默的发根作为对照，即转pART27空载体筛选得到的人参发根；T2、T17和T32为转PgJAZ1基因RNAi载体筛选得到的转基因人参发根。与对照CK相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的PPT型皂苷显著增加。与MeJA处理的对照人参发根相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的总皂苷均增加，PPT型皂苷含量相当，其中人参发根系T17的PPT性皂苷含量显著增加。考虑到外源性MeJA对细胞生长的抑制作用，与MeJA处理的对照人参发根相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的PPT型皂苷的产量均显著增加，其中T17发根系中PPT型皂苷的最高产量增加2.69倍。
具体实施方式
实施例1
PgJAZ1基因的获得
1、人参RNA提取及其反转录
将人参发根于25℃培养3周后，加入100μmol/L MeJA至培养液，120rpm，25℃，暗培养24h后，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，利用反转录酶反转录合成cDNA第一链，合成的cDNA于-20℃保存，备用。
2、PgJAZ1基因扩增
根据MeJA诱导的人参转录组测序结果，设计引物进行PCR扩增。PgJAZ1基因PCR扩增引物如下。
PgJAZ1-F:5′-ATGTTCTTCAACGGCCGGAAAT-3′；(SEQ ID N0.4)
PgJAZ1-R:5′-CTATAAGTTGAGATCAAACTG-3′；(SEQ ID N0.5)
PCR扩增条件为:94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。对PCR产物进行电泳分析和测序。
实施例2
PgJAZ1基因表达相对定量分析
1、RNA提取及反转录
将人参发根在1/2MS液体培液基中25℃，110r/min暗培养21d，分别加入MeJA(100μmol/L)进行处理，处理不同时间后分别取出发根，用于RNA，以oligod(T)18为引物，利用反转录酶反转录合成cDNA第一链。PgJAZ1、β-actin、PgSS、PgSE和PgDDS基因qRT-PCR分析引物如下：
PgJAZ1荧光定量引物F:5′-GAGAGACCTGCTGCAATGGA-3′；(SEQ ID N0.6)
PgJAZ1荧光定量引物R:5′-GGGGGCATGTTGAGGAAAGA-3′；(SEQ ID N0.7)
β-actin荧光定量引物F:5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；(SEQ ID N0.8)
β-actin荧光定量引物R:5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′；(SEQ ID N0.9)
PgSS荧光定量引物F：5′-ATCCCTCCGGAGCCACACTGG-3′；(SEQ ID N0.10)
PgSS荧光定量引物R：5′-GAGCTGAGGGCCGAGCTGTTG-3′；(SEQ ID N0.11)
PgSE荧光定量引物F:5′-TGGCCTAAACCCGCGTCCAA-3′；(SEQ ID N0.12)
PgSE荧光定量引物R:5′-AGCGCCGAGCCACATTCGT-3′；(SEQ ID N0.13)
PgDDS荧光定量引物F:5′-TGAGATTAGATGAAAACGAAC-3′；(SEQ ID N0.14)
PgDDS荧光定量引物R:5′-GGCAATGATAAGGGGAGGTGT-3′；(SEQ ID N0.15)
2、Real-time PCR(qRT-PCR)分析PgJAZ1、PgSS、PgSE和PgDDS基因表达水平
以CFX Connect荧光定量PCR仪进行分析检测，按照
Figure BDA0003134492380000071
Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒进行扩增。反应体系为:2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL，cDNA模板0.5μL，上游和下游引物(10μmol/L)各0.5μL，补ddH2O至25μL。反应条件为:95℃预变性30s；95℃变性40s，60℃退火30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。每个样品3个重复，反应结束后，采用2-ΔΔCt方法分析PgJAZ1、PgSS、PgSE和PgDDS基因的表达模式。
实施例3
人参皂苷提取及含量测定
1、人参皂苷的提取
取新鲜的人参发根或组织，自来水清洗2min后用ddH2O清洗，60℃干燥至恒重。将其研磨成细粉，用80％甲醇60℃浸提(1g:40mL)，超声波处理3次，每次15min；60℃水浴蒸干甲醇，水洗超声溶解，乙醚萃取两次，取水相，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃水浴蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容至刻度，过0.45μm的微孔滤膜，得到样品溶液。
2、人参皂苷含量测定
人参皂苷含量测定采用HPLC法，HPLC测定条件为:LC-MS 8050高效液相色谱仪；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相为乙腈(A):1％甲酸(B)，洗脱条件如下:A:B(10:90)-(25:75)2min；A:B(25:75)2-8min；A:B(25:75)–(45:55)8–16.5min；A:B(45:55)16.5–21.5min；A:B(45:55)–(98:2)21.5–21.6min；A:B(98:2)21.6–25min；A:B(98:2)–(10:90)25–25.1min；A:B(10:90)25.1–29min。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。
以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3作为标准品测定样品中的PPD型、PPT型和总皂苷的含量。图4为液体培养21d后的人参发根以100μmol/L MeJA处理后的人参皂苷含量测定结果。
实施例4
基因沉默载体构建及转化
1、基因沉默载体构建
(1)PCR扩增RNAi片段
运用OligoEngine 2.0 RNAi设计软件，根据PgJAZ1基因cDNA序列及基因组DNA序列，扩增RNAi序列的引物如下：
正义引物RNAi-F:5′-CCGCTCGAGACATGCCCCCAATATGGGT-3′；(SEQ ID N0.16)
正义引物RNAi-R:5′-CGGGGTACCTTGTTAACATTAGTGGTTG-3′；(SEQ ID N0.17)
反义引物RNAi-F:5′-GCTCTAGAACATGCCCCCAATATGGGT-3′；(SEQ ID N0.18)
反义引物RNAi-R:5′-CCATCGATTTGTTAACATTAGTGGTTG-3′；(SEQ ID N0.19)
分别以正义引物对(SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17，下划线分别为Xho I和Kpn I酶切位点)和反义引物对(SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.19，下划线分别Cla I和Xba I酶切位点)进行PCR扩增。扩增得到正义RNAi序列包含Xho I和Kpn I酶切位点，反义RNAi序列包含Cla I和Xba I酶切位点。
(2)pKANNIBAL-PgJAZ1-RNAi载体构建
反义片段PCR产物用1.5％琼脂糖胶电泳分离，回收目标条带，并与pKANNIBAL质粒经Xho I和Kpn I双酶切，电泳分离目的片段，回收pKANNIBAL质粒和PgJAZ1正义干扰片段。酶切片段的回收和纯化同上。用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α中，挑取阳性单克隆，PCR和酶切鉴定。经鉴定后提取质粒，命名为pKANNIBAL-Sense-PgJAZ1。
反义片段的PCR扩增产物以1.5％琼脂糖胶电泳分离，胶回收目标条带，并与构建好的pKANNIBAL-Sense-PgJAZ1质粒经Cla I和Xba I双酶切，反义片段PCR产物及pKANNIBAL-Sense-PgJAZ1双酶切产物电泳分离并胶回收pKANNIBAL-Sense-PgJAZ1质粒双酶切片段和含Cla I和Xba I酶切位点的反义RNAi序列片段，酶切片段的回收和纯化后。用T4 DNA连接酶16℃下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒后使用Cla I和Xba I双酶切，检测成功后，对含有正义和反义RNAi的重组质粒分别以Xho I/XbaI双酶切和Not I单酶切。鉴定后提取重组质粒，并命名为pKANNIBAL-PgJAZ1-RNAi。
(3)pART27-PgJAZ1-RNAi载体构建
pKANNIBAL-PgJAZ1-RNAi与pART27质粒经检测后，使用Not I酶切。电泳分离目的片段，回收pKANNIBAL-PgJAZ1-RNAi质粒上的RNAi表达框片段，其表达框示意图如图5所示。用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出连接成功的克隆，经Not I酶切和测序确定插入方向的正确性，构建好的载体命名为pART27-PgJAZ1-RNAi。
2、发根农杆菌感受态细胞的转化
分别取1μg pART27-PgJAZ1-RNAi和pART27(对照)质粒与发根农杆菌(A.rhizogenes)A4感受态细胞于冰上轻轻混匀，冰上放置30min；液氮速冻2min，37℃热激5min，再冰浴2min，加入800μL YEB液体培养基，28℃培养3-4h；5000rpm离心5min沉淀菌体，弃掉上清，重悬菌体，涂布于50μg/mL卡那霉素的YEB筛选培养基上，28℃培养2-3d。
3、发根农杆菌介导转化人参根
(1)发根农杆菌A4菌株的培养
将含有pART27-PgJAZ1-RNAi和pART27的发根农杆菌A4于YEB液体培养基中28℃、110rpm培养过夜，使其OD600至0.6左右，4℃离心5-10min，收集菌体，用1/2MS液体培养基清洗3次后，用1/2MS+乙酰丁香酮20mg/L培养基将菌液稀释10倍后作为侵染液。
(2)人参发根的诱导及培养
取4年生人参新鲜根，清洗干净，用质量分数为70％的酒精及质量分数为0.1％的氯化汞消毒，无菌水冲洗2-3次，将新鲜人参根切成2–3mm的薄片，置于1/2MS固体培养基上预培养1–2d。取预培养的人参薄片，放入含有pART27-PgJAZ1-RNAi和pART27的发根农杆菌A4侵染液中5-10min，用无菌滤纸吸干菌液，置于1/2MS培养基上避光共培养3-5d；待发根长出后将其切下，接于1/2MS基本培养基中培养。每隔5–7d转移1次，直至无细菌生长，每4周继代1次。
(3)qRT-PCR分析转基因人参发根PgJAZ1基因表达水平
取筛选的转基因人参发根，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，利用反转录酶反转录合成cDNA第一链，并通过qRT-PCR的方法对转基因发根进行筛选鉴定，获得的阳性人参发根，PgJAZ1基因分析所用引物为SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7，内参β-actin所用引物为SEQID N0.8和SEQ ID N0.9。图6为PgJAZ1基因沉默的人参发根qRT-PCR鉴定结果；其中CK为空白发根作为对照，即转pART27空载体筛选得到的人参发根；T2、T17和T32为转PgJAZ1基因RNAi载体筛选得到的转基因人参发根。结果显示，与对照CK相比，获得的T2、T17和T32发根中PgJAZ1基因水平均明显的下降，结果初步表明获得了PgJAZ1基因沉默的人参发根。
(4)转基因人参发根中人参皂苷含量测定
取新鲜的转基因人参发根或组织，自来水清洗2min后用ddH2O清洗，60℃干燥至恒重。将其研磨成细粉，用80％甲醇60℃浸提(1g:40mL)，超声波处理3次，每次15min；60℃水浴蒸干甲醇，水洗超声溶解，乙醚萃取两次，取水相，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃水浴蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容至刻度，过0.45μm的微孔滤膜，得到样品溶液。
人参皂苷含量测定采用HPLC法，HPLC测定条件为:LC-MS 8050高效液相色谱仪；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相为乙腈(A):1％甲酸(B)，洗脱条件如下:A:B(10:90)-(25:75)2min；A:B(25:75)2-8min；A:B(25:75)–(45:55)8–16.5min；A:B(45:55)16.5–21.5min；A:B(45:55)–(98:2)21.5–21.6min；A:B(98:2)21.6–25min；A:B(98:2)–(10:90)25–25.1min；A:B(10:90)25.1–29min。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3作为标准品测定样品中的PPD型、PPT型和总皂苷的含量。图7为PgJAZ1基因沉默的人参发根中皂苷含量测定结果，与对照CK相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的PPT型皂苷显著增加。与MeJA处理的对照人参发根相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的总皂苷均增加，PPT型皂苷含量相当，其中人参发根系T17的PPT性皂苷含量显著增加。考虑到外源性MeJA对细胞生长的抑制作用，与MeJA处理的对照人参发根相比，基因沉默的人参发根系T2、T17和T32的PPT型皂苷的产量均显著增加，其中T17发根系中PPT型皂苷的最高产量增加2.69倍。
序列表
<110> 湖南工程学院
<120> 一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应
<141> 2021-06-23
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> null
<400> 1
atgttcttca acggccggaa atcagcaccg gaaaataagt ccaattttgc gctcttcacc 60
cactacttga aagaaaagga aagcaaaact tgtctagaac atctgaatca tcttggcatc 120
atgaatggaa aacaagaatc ttcagagaga cctgctgcaa tggatcaatt attaaaaggt 180
gacacggaca agtcgggcca aatatccaca caatcttcga atctctttcc tcaacatgcc 240
cccaatatgg gtgcctacac tactgtacaa gatgccataa ataatatcac taattcaagt 300
atcggtgagc aggcagcaat ggagcctaaa actgcgcaaa tgactatatt ttacagggga 360
caagttttgg tgtttgatga tttttcagct gccaaagcta aggaggtgat gctattagca 420
agcaagggtg ctaccactac tggatttgat tcaaccacta atgttaacaa aatggtcgac 480
aaccccatgc cctcgtaccc gtacccgtac aatctttcga attctggatc tgaaactcag 540
ccgcaatctc aaccaattgg ttctgatcta ccaattgcaa gaagagtatc actgcatagg 600
ttcttggaga agaggaaaga cagggccact gcaagagcgc catatcaatt acacaactca 660
tctccagagt ctcccaagga acagtttgat ctcaacttat ag 702
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> null
<400> 2
Met Phe Phe Asn Gly Arg Lys Ser Ala Pro Glu Asn Lys Ser Asn Phe
1 5 10 15
Ala Leu Phe Thr His Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Ser Lys Thr Cys Leu
20 25 30
Glu His Leu Asn His Leu Gly Ile Met Asn Gly Lys Gln Glu Ser Ser
35 40 45
Glu Arg Pro Ala Ala Met Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asp Thr Asp Lys
50 55 60
Ser Gly Gln Ile Ser Thr Gln Ser Ser Asn Leu Phe Pro Gln His Ala
65 70 75 80
Pro Asn Met Gly Ala Tyr Thr Thr Val Gln Asp Ala Ile Asn Asn Ile
85 90 95
Thr Asn Ser Ser Ile Gly Glu Gln Ala Ala Met Glu Pro Lys Thr Ala
100 105 110
Gln Met Thr Ile Phe Tyr Arg Gly Gln Val Leu Val Phe Asp Asp Phe
115 120 125
Ser Ala Ala Lys Ala Lys Glu Val Met Leu Leu Ala Ser Lys Gly Ala
130 135 140
Thr Thr Thr Gly Phe Asp Ser Thr Thr Asn Val Asn Lys Met Val Asp
145 150 155 160
Asn Pro Met Pro Ser Tyr Pro Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Asn Ser Gly
165 170 175
Ser Glu Thr Gln Pro Gln Ser Gln Pro Ile Gly Ser Asp Leu Pro Ile
180 185 190
Ala Arg Arg Val Ser Leu His Arg Phe Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg
195 200 205
Ala Thr Ala Arg Ala Pro Tyr Gln Leu His Asn Ser Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Pro Lys Glu Gln Phe Asp Leu Asn Leu
225 230
<210> 3
<211> 237
<212> DNA
<213> null
<400> 3
acatgccccc aatatgggtg cctacactac tgtacaagat gccataaata atatcactaa 60
ttcaagtatc ggtgagcagg cagcaatgga gcctaaaact gcgcaaatga ctatatttta 120
caggggacaa gttttggtgt ttgatgattt ttcagctgcc aaagctaagg aggtgatgct 180
attagcaagc aagggtgcta ccactactgg atttgattca accactaatg ttaacaa 237
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> null
<400> 4
atgttcttca acggccggaa at 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> null
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 6
gagagacctg ctgcaatgga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> null
<400> 7
gggggcatgt tgaggaaaga 20
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<211> 21
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tgccccagaa gagcaccctg t 21
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atccctccgg agccacactg g 21
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gagctgaggg ccgagctgtt g 21
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cggggtacct tgttaacatt agtggttg 28
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<400> 19
ccatcgattt gttaacatta gtggttg 27

Claims (7)

1.一种人参PgJAZ1基因，其特征在于，所述人参PgJAZ1基因的基因序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种人参PgJAZ1基因编码蛋白，其特征在于，所述人参PgJAZ1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求1所述人参PgJAZ1基因在人参中提高原人参三醇型皂苷含量的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述用途是通过基因编辑、干扰、沉默或敲除所述人参PgJAZ1基因，提高人参发根、细胞、组织和植株中原人参三醇型皂苷含量。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途是通过构建所述人参PgJAZ1基因的RNAi载体并转化人参，提高人参发根、细胞、组织和植株中原人参三醇型皂苷含量提高的人参发根、细胞、组织和植株。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述人参PgJAZ1基因的RNAi载体通过如下方式进行构建：以所述人参PgJAZ1基因的特异性DNA片段作为干扰序列，将该特异性DNA片段以正反两个方向插入到植物表达载体pKANNIBAL中，再将pKANNIBAL表达载体的左边界和右边界序列之间的表达框插入到植物表达载体pART27中；所述人参PgJAZ1基因的特异性DNA片段如SEQ ID No.3所示。
7.一种人参PgJAZ1基因的特异性DNA片段，其特征在于，所述人参PgJAZ1基因的特异性DNA片段如SEQ ID No.3所示。
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