CN101220353B

CN101220353B - 一种甘草查尔酮合成酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101220353B
Application number: CN2008100572683A
Authority: CN
Inventors: 周骅; 刘敬梅; 张海超; 夏勉; 李毅
Original assignee: BEIJING WEIMING KAITUO AGRICULTURE BIOTECH Co Ltd
Current assignee: Beijing Weiming Kaituo Agriculture Biotech Co., Ltd.
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: CN101220353A

Abstract

本发明公开了一个来源于乌拉尔甘草的查尔酮合成酶及其编码基因。实验证明，本发明的甘草查尔酮合成酶基因转化到甘草毛状根中后，查尔酮合成酶基因表达增强，相应的甘草毛状根中总黄酮含量较没有转化的毛状根最高可以提高2.5倍左右。查耳酮合成酶是植物体内黄酮类化合物代谢途径中的第一个关键酶，本发明提供的甘草查尔酮合成酶基因为基因工程改良植物体内黄酮类化合物的合成提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值，特别是可使甘草在医药、保健品、食品及化妆品领域得到更广泛的应用。

Description

一种甘草查尔酮合成酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及查尔酮合成酶及其基因与应用，具体涉及到乌拉尔甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch)中一个查尔酮合成酶基因及其在提高植物总黄酮含量中的应用，属于植物分子生物学领域。

背景技术

黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有轻基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。

黄酮类化合物具有广泛重要的生理功能，是许多中草药的主要有效成分，普遍被应用于临床治疗和以黄酮类化合物为功能因子的保健食品中。在药学方面，目前已经有不少以黄酮类化合物起主要作用的中草药制剂，如安宫宁胶囊、双黄连注射液、雪莲注射液、银杏口服液等。也有黄酮类的提取物单独使用或添加到其他药物中发挥作用。如大豆提取物染料木黄酮对前列腺癌的多个细胞系具有明确的抑制作用；沙棘黄酮口服液能降低高脂而且症患者的总胆固醇、甘油三醇，极高密度脂蛋白含量，对高脂血症患者的临床总有效率为90％；橙皮(二氢黄酮苷)具有和芦丁相同的用途，也有维生素P样功效，是治疗冠心病药物“脉通”的重要原料之一；杜鹃素(二氢黄酮)是祛痰成分，临床用于治疗慢性支气管炎。在食品方面，黄酮类化合物可应用于食品中以增加其保健作用。一种是将富含黄酮类的原料直接加工成食品，如以富含黄酮类物质的植物叶部为原料，采用一般茶叶的炒制加工方法，制作出来的冲泡型叶茶：银杏茶、柿叶茶、核桃茶叶、桑叶茶等；或以黄酮类化合物来源的植物为原料制成液体饮料：复方沙棘饮料、黑米饮料。另一种是先从原料中提取出黄酮类物质，再把它添加到其它原料中进行加工制成产品。如银杏叶黄酮芒果汁保健饮料、灵芝杏叶保健饮料、二绿天然保健饮料、山碴酮酒等。

甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为“众药之王”。甘草的主要有效次生代谢产物包括三萜类甘草酸和甘草黄酮，甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、抗衰老、保肝等药理作用，是一类天然抗菌剂和防腐剂。然而甘草野生资源的濒临灭绝阻碍了甘草的深入开发利用。

随着生物工程技术的不断提高，利用毛状根培养来生产次生代谢产物成为研究热点，其生长迅速，分支多，不需要外源激素，而且比细胞培养容易放大，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。但是甘草毛状根培养系统仍然存在活性成分低的问题，影响了甘草毛状根的进一步发展放大和工业化。如张荫麟等(甘草的发状根培养，中草药，1990，21(12)：23-26)报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39％，远远低于生药根的含量2.38％；杜旻等(甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分析，植物资源与环境学报，2001，10(1)7-10)研究的乌拉尔甘草毛状根黄酮含量也约为0.39％；王裔惟等(光果甘草毛状根培养过程中对活性氧清除能力和总黄酮含量的变化，植物资源与环境学报，2004，13(2)：6-9)检测光果甘草毛状根在生长31d后总黄酮达到最高含量为0.78％；杨世海等(甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响，中国中药杂志，2006，131(11)：875-878)检测了乌拉尔甘草毛状根中各种不同黄酮的含量，其总黄酮的含量约为0.15％。

甘草黄酮类化合物为次生代谢产物总黄酮的混合物，整个代谢途径十分复杂(Stefan M.，Axel M.(2005)，Flavones and flavone synthases.Phytochemistry，66：2399-2407.)。然而在此生物合成途径中，其下游的各种类型黄酮均来源于上游的同一骨架，即查耳酮。1分子4一香显酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下产生查耳酮(苯基苯乙烯酮)。因此，查耳酮合酶是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成的第一个酶。查耳酮形成后经异构化反应转变成黄烷酮(Flavanone)，再经过不同的催化反应和修饰产生不同类型的黄酮类化合物包括黄酮(Flavone)、异黄酮(Isoflavone)、黄酮醇(Flavonol)、花青素(Anthocyanidin)(J B Harborne H Baxter·The Handbook of Natural Flavonoids·JohnWiley&Sons Chichester，1999//P)等，因此查耳酮骨架的形成决定了其下游各种黄酮类化合物的合成，是一个极其重要的限速步骤。也因此查耳酮合成酶(CHS)是整个代谢过程中最重要的关键酶。

随着现代分子生物学的飞速发展，应用基因工程技术，分离克隆次生代谢产物生物合成途径中关键酶基因，并将其转化到目的植物基因组中，达到提高植物中次生代谢活性成分已被证明是一条十分有效的途径。Seo等人(Seo JW，Jeong JH，Shin CG，et al.(2005)，Overexpression of squalene synthase in Eleutherococcus senticosus increases phytosterol andtrierpene accumulation.Phytochemistry.66(8)：869)把来自人参的鲨烯合成酶(squalenesynthase，SS)以农杆菌介导转入刺五加中，结果表明该酶的活性比对照增强了3倍，其下游产物植物甾醇类和三萜皂苷类的水平提高了2-2.5倍。2006年，Lunkenbein等将35S启动子驱动反义查耳酮合成酶基因导入草莓，获得的25个转基因株系中，9个株系CHS mRNA积累比未转化植株减少50％以上，以查耳酮为前体的花青素、黄酮醇、原花青素的积累减少(Lunkenbein S，Coiner H，de Vos CH，Schaart JG，Boone MJ，Krens FA，Schwab W，SalentijnEM.(2006)，Molecular characterization of a stable antisense chalcone synthase phenotype instrawberry(Fragaria x ananassa).J Agric Food Chem.54(6)：2145-53)。反义转化结果表明，查耳酮合成酶调控下游黄酮类化合物的合成，是关键酶。在甘草中，查尔酮合成酶基因的克隆还没有见到报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个甘草查尔酮合成酶及其编码基因。

本发明所提供的查尔酮合成酶，来源于乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)，是下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)具有序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有相同功能的由(i)衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸序列由389个氨基酸残基组成，将具有该氨基酸序列的蛋白命名为CHS7G；所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后通过检测该突变基因在植物中超表达后是否能够有效提高植物中总黄酮含量，可以判断发生这些变化后的蛋白是否还具有查尔酮合成酶的功能。

编码本发明来源于甘草的查尔酮合成酶的基因CHS7G，既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，例如：序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增CHS7G中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种提高植物中总黄酮含量的方法。

本发明发现，查尔酮合成酶基因的超表达能够有效提高植物中总黄酮含量。本发明所提供的提高植物总黄酮含量的方法，是将编码本发明甘草查尔酮合成酶基因或者是与该基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物总黄酮含量获得提高。

在上述提高植物总黄酮含量的方法中，本发明中甘草查尔酮合成酶基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明甘草查尔酮合成酶基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、Gateway^TW系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明中甘草查尔酮合成酶基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actinl启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM_118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受乙烯、乙醇等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

本发明的一个具体实施方式是以pXQ-35s(pCambia1301敲除GUS基因之后而得)为出发载体，构建含有本发明甘草查尔酮合成酶基因的植物表达载体pXQ-35s-CHS7G。携带有本发明甘草查尔酮合成酶基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，培养总黄酮合成提高的植物细胞系、组织或器官，还可以进一步将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、根、茎尖、叶片和种子等。

黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花、叶部位，主要存在于芸香料、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。因此本发明的方法对多种植物均适用，所述被转化的植物细胞、组织或器官来源广泛，包括雪莲、葛根、甘草、苜蓿等多种植物。

本发明首次克隆了甘草查尔酮合成酶的基因，并利用发根农杆菌转化技术，成功将查尔酮合成酶基因转化到甘草毛状根中，改变甘草次生代谢产物积累方式，大幅提高了甘草发根中总黄酮含量。实验证明，本发明克隆的甘草查尔酮合成酶基因转化到甘草毛状根中后，查尔酮合成酶基因表达增强，相应的甘草毛状根中总黄酮含量较没有转化的毛状根最高可以提高2.5倍左右。查耳酮合成酶是植物体内黄酮类化合物代谢途径中的第一个关键酶。因此，本发明提供的甘草查尔酮合成酶基因(CHS7G)为基因工程改良植物体内黄酮类化合物的合成提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值，特别是可使甘草在医药、保健品、食品及化妆品领域得到更广泛的应用，将带来巨大的经济效益和社会效益，意义深远。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为表达载体pXQ-35s-CHS7G的构建过程示意图。

图2为甘草查尔酮合成酶基因CHS7G通过发根农杆菌A4的介导转化甘草毛状根的Southern杂交结果。

图3为甘草查尔酮合成酶基因(CHS7G)在转基因甘草毛状根系中的表达模式图，上方为RT-PCR结果，下方为内参actin RT-PCR结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》(第三版)，本申请发明人克隆到了乌拉尔甘草中查尔酮合成酶基因的cDNA，并确定了其碱基序列。

实施例1、查尔酮合成酶基因CHS7G cDNA的分离

1、植物材料准备、总RNA的分离

将乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的成熟种子消毒后于1/2MS培养基上萌发，在25℃恒温与16小时光照周期的培养室中无菌培养20天左右，植株生长健壮，准备用于总RNA提取。

用Invitrogen公司的Trizol reagent进行材料的总RNA提取，整个操作过程保证无RNA酶污染并严格按照Trizol试剂的RNA提取流程说明，将提取的RNA分装成小份，冻存在-80℃下备用。

2、CHS7G基因序列的获得：

根据大豆查尔酮合成酶基因CHS7(GenBank Accession No.M98871)序列设计引物：

Gmchs7F： 5’-AGGAAAGATGGTTAGCGTAGC-3’

Gmchs7R： 5’-CTCAGATGGCCACACTATGCA-3’

应用首链cDNA合成试剂盒(Fermantas)合成cDNA。条件如下：

总RNA 0.1-5.0μg(4μl)

Oligo(dT)¹⁸引物 0.5μg(1μl)

DEPC H₂O 补充到总体积 12μl

轻轻混匀，瞬时离心到管底，70℃水浴中反应5min后冰上放置冷却，离心收集反应液体至管底。在冰上按顺序加入以下组分：

5 ×reaction buffer 4μl

Riblock^TM Ribonuclease inhibitor 1μl

dNTP(10mM)mix 2μl

轻轻混匀，37℃反应5min。

加入M-MLV Reverse Transcriptase 1μl

总体积为20μl，42℃反应1h后，70℃，10min终止反应。冰上放置。其cDNA产物用于PCR。反应体系及参数如下：

cDNA 1μl

2×PCR缓冲液 2μl

dNTP(10mM) 0.4μl

正向引物(10μM) 0.5μl

反向引物(10μM) 0.5μl

Taq酶(2.5U/μl) 0.4μl

H₂O(灭菌超纯水) 15.2μl

反应条件：

94℃3min；94℃3min，55℃0sec，72℃1min 30次循环；72℃10min。

PCR扩增得到的产物经过电泳跑胶回收后连接到pGEM-Teasy载体上(购自promega公司)，命名为pGEM-T1，并转化E.coli DH5α，用于测序。使用3730 DNA Sequencer(Invitrogen公司)测定，所确定的碱基序列如序列表SEQ ID NO：2所示，将其命名为CHS7G。

实施例2、表达载体构建并通过发根农杆菌A4介导转化甘草毛状根。

1、植物表达载体pXQ-35s-CHS7G的构建

将甘草查尔酮合成酶基因CHS7G利用酶切位点XbaI/SacI从T载体上切下，与带有35s启动子和nos终止子的植物表达载体pXQ-35s同样用XbaI/SacI酶切后(pCambia1301敲除GUS基因之后而得)连接，构建表达载体pXQ-35s-CHS7G(如图1所示)。

2、将重组质粒pXQ-35s-CHS7G采用冻融法转化到发根农杆菌A4中

A、取2-3μl质粒(浓度1μg/μl)转化刚制好的发根农杆菌A4感受态细胞，冰上放置30min；

B、浸入液氮中5min，37℃水浴5min，加入500μl空YEB(牛肉浸膏5g/L，酵母膏1g/L；蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，七水合硫酸镁4g/L，pH7.4)，28℃，150-160rpm摇3-5h；

C、涂板，28℃培养箱中培养2-3天；

D、挑取单克隆进行菌落PCR鉴定。

3、发根农杆菌转化甘草毛状根

将携带外源CHS7G基因的发根农杆菌先涂布于固体YEB培养基，28℃培养2天后，选取单克隆菌斑于液体YEB培养基中，28℃振荡培养至一定浓度，再取少量菌液至YEB培养基中扩大培养至OD₆₀₀≈0.5-0.7，然后，将菌液离心收集，去上清，加入同体积的MS液体培养基混匀。

将萌发3-4天后的甘草无菌苗的子叶节外植体，在其中浸泡20分钟后，取出，用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基，共培养2天后(暗培养)，以无菌水冲洗后转入无激素的MS固体培养基(含500mg/L的头孢噻肟钠)。4天后即有发根出现，得到的甘草发根转接入无激素的MS固体培养基中(250mg/L的头孢噻肟钠)继代生长。继代4-5次除菌完全后，将其转入液体培养(不含头孢噻肟钠，含有卡那霉素20mg/L)，进行抗性筛选。

实施例3、转基因毛状根系的分子检测

随机选取实施例2中经过抗性筛选后得到的7个甘草发根株系，用CTAB法提取总DNA(参照《分子克隆实验指南》)；使用Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection kit，以地高辛标记的CHS7G基因片段作探针，进行Southern杂交。全部操作过程严格按照该试剂盒的说明进行。杂交结果如图2所示。图2中，M为DNA分子量标准(λDNA/HindIII)；+为阳性对照重组质粒pXQ-35s-CHS7G；fx1为阴性对照非转化外源基因的野生型毛状根；其它为抗性筛选后得到的7个甘草发根株系。杂交结果显示：所选的转基因毛状根根系中所有7个均为阳性的，且均为多拷贝插入。阳性对照的杂交信号最强，阴性非转基因的野生型毛状根没有杂交的信号。

实施例4、CHS7G在转基因甘草毛状根系中的表达模式

将经过分子检测为阳性的毛状根准确称量0.1克，并立即用液氮速冻，置于-80℃冰箱中用于总RNA的分离。总RNA的提取方法同实施例1。

使用上海申能博采公司的反转录试剂盒，以β-actin做为内参利用所选的毛状根分析CHS7G基因在不同转基因毛状根系中的表达情况，结果如图3所示。结果显示：所选的转基因毛状根系中，CHS7G基因表达较没有转化外源基因的野生型毛状根的要强，而且表达增强的趋势与总黄酮含量提高的趋势基本一致。然而，89-1根系中CHS7G基因的表达较野生型(ck)的要低，推测为转化的外源基因与内源基因产生了共抑制所致。

实施例5、转基因毛状根系的总黄酮含量检测

1、甘草毛状根中总黄酮的提取

将经过分子检测为阳性的毛根收集、晾干后60℃烘烤过夜至恒重，研钵研磨破碎后过60目的筛子，称重0.1g，用4ml的甲醇浸泡过夜后40Hz、30min超声提取，离心10min后吸取上清；收集残渣再用4ml甲醇重复提取合并续滤液，定容至10ml。

2、采用紫外分光光度计进行黄酮含量的测定：

以柚皮苷为标准品，配制成1.0mg/ml的标准品溶液。精密吸取4μl、8μl、12μl、16μl、20μl、24μl标准品溶液分别加入10％的KOH(W/V，g/ml)溶液500μl，然后以甲醇补充总体积至2ml，以分光光度计在420.5nm处测量其吸收值(ABS)。以浓度为横座标，吸收值为纵座标得出标准曲线和对应的回归方程。

紫外分光光度计检测所选毛状根的总黄酮含量，结果如表1所示。其中，Fx1为非转化外源基因的野生型毛状根系；生药根为药店购买的甘草饮片；其余的为经过分子检测为阳性的毛状根系。

表1

样品编号	总黄酮含量(％)
		CK(Fx1)	0.427
生药根	0.709
		CHS7G 141	0.373
CHS7G89-1	0.476
		CHS7G 184-3	0.508
CHS7G 183	0.766
		CHS7G 146	1.287
CHS7G 197	1.549

从表1可以看出，转基因的毛状根系中总黄酮含量较野生型的要高，而且提高的趋势与RT-PCR检测的基因表达情况基本一致。

尽管为说明目的公开了本发明的具体实施例和附图，其目的在于帮助理解本发明的内容并据以实施，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于最佳实施例和附图所公开的内容。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京未名凯拓农业生物技术有限公司

<120>一种甘草查尔酮合成酶及其编码基因与应用

<130>JSP080024

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>389

<212>PRT

<213>乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)

<400>1

Met Val Ser Val Ala Glu Ile Arg Lys Ala Gln Arg Ala Glu Gly Pro

1 5 10 15

Ala Asn Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Cys Val Asp

20 25 30

Gln Ser Thr Tyr Pro Asp Phe Tyr Phe Lys Ile Thr Asn Ser Glu His

35 40 45

Lys Thr Glu Leu Lys Glu Lys Phe Gln Arg Met Cys Asp Lys Ser Met

50 55 60

Ile Lys Lys Arg Tyr Met Tyr Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn

65 70 75 80

Pro Asn Ile Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln Asp

85 90 95

Met Val Val Val Glu Val Pro Arg Leu Gly Lys Glu Ala Ala Val Lys

100 105 110

Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Ile

115 120 125

Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Tyr Val Lys Arg Tyr Met Met Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Gly Cys Ser Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp

165 170 175

Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu

180 185 190

Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Thr Asp Thr His Leu Asp Ser

195 200 205

Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val

210 215 220

Gly Ser Asp Pro Val Pro Glu Ile Glu Lys Pro Ile Phe Glu Leu Val

225 230 235 240

Trp Thr Ala Gln Thr Ile Ala Pro Asp Ser Glu Gly Ala Ile Asp Gly

245 250 255

His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro

260 265 270

Gly Ile Val Ser Lys Asn Ile Asp Lys Ala Leu Thr Glu Ala Phe Gln

275 280 285

Pro Leu Gly Ile Ser Asp Tyr Asn Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Gln Lys Leu Ala Leu Lys

305 310 315 320

Pro Glu Lys Met Lys Ala Thr Arg Asp Val Leu Ser Asp Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Ser Ala Gln Asp Gly Leu Lys Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu Thr Val Val Leu

370 375 380

His Ser Val Ala Ile

385

<210>2

<211>1170

<212>DNA

<213>乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)

<400>2

atggttagcg tagctgaaat tcgcaaagct caaagggcag aaggccctgc aaacatcttg 60

gccattggta ctgcaaatcc accaaattgt gttgatcaaa gtacttatcc tgatttttac 120

tttaagatca caaacagtga gcacaagacc gagcttaagg aaaaatttca gcgcatgtgt 180

gacaaatcta tgatcaagaa gagatatatg tacctaacgg aagagatttt gaaagagaat 240

cctaacattt gcgcttatat ggcaccttct ttggatgcta ggcaagacat ggtggtcgta 300

gaggtgccta gactagggaa ggaagctgcg gtcaaggcta taaaagaatg gggccaacca 360

aagtcaaaga ttacccactt aattttttgc actactagcg gtgtggacat gcctggcgct 420

gattaccaac ttactaaact cttgggtctt cgcccatatg tgaaaaggta tatgatgtac 480

cagcaagggt gttctgcagg tggcacggtg cttcgcttgg ccaaagactt ggcagagaac 540

aacaaaggtg ctcgtgtgct agttgtttgt tctgaaatta ctgcagtcac atttcgtggc 600

cctacagata ctcacttgga tagccttgtg ggacaagcat tatttggaga tggagcagct 660

gcagtcattg ttggttctga cccagtacct gaaattgaga agcctatatt tgagttggtt 720

tggacggcac aaacaatagc tccagatagt gaaggagcca ttgatggtca ccttcgtgaa 780

gttgggctca catttcatct tcttaaagat gttcccggga tagtctcaaa gaacattgat 840

aaagcactga ctgaggcatt ccaaccatta ggcatatctg attacaactc aatcttttgg 900

attgcacacc caggtgggcc tgcaattctt gaccaagttg agcaaaagtt agctttgaaa 960

cctgaaaaga tgaaggccac tagggatgtg cttagtgatt atggtaatat gtcaagtgca 1020

tgtgttctat tcatcttgga tgagatgaga aagaaatcag ctcaagatgg acttaagacc 1080

actggcgaag gactcgaatg gggtgtatta ttcggctttg gacctggact taccatcgaa 1140

actgttgttt tgcatagtgt ggccatctga 1170

Claims

1.一种蛋白质，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。

4.权利要求1所述蛋白质及其编码基因在提高植物总黄酮含量中的应用，所述植物为甘草。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将权利要求2或3所述的基因导入植物细胞、组织或器官，获得总黄酮合成提高的植物细胞系、组织、器官或转基因植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官，用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：用所述基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：用所述基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在所述植物表达载体中加入选择性标记基因，所述选择性标记基因选自：可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶的基因、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物和抗化学试剂标记基因。