CN101942467B - 双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于提高中药材丹参中丹参酮含量的方法，双基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，但是丹参中丹参酮含量低，无法满足医疗需要。本发明从丹参中克隆SmHMGR和SmGGPPS基因，构建含SmHMGR和SmGGPPS基因的表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmHMGR和SmGGPPS基因的丹参毛状根，半定量RT-PCR分析、高效液相色谱法测定丹参酮含量，DPPH清除自由基法测定转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。本发明优点是：转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高；丹参酮成本低。生产过程无环境污染。

Description

双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法

技术领域

本发明属于提高中药材丹参中丹参酮含量的方法，具体地说是一种双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

背景技术

心脑血管疾病是威胁人类健康与生命的“头号杀手”。全世界每年有1700万人死于心脑血管疾病,占全球总死亡人数的1/3。我国每年大约有260万人死于心脑血管疾病。积极研究及开发高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具有十分深远的意义。

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），又名紫丹参、红根、赤参、活血参，唇形科鼠尾草属，多年生草本植物。作为一种传统中药，丹参在临床上主要应用于对心血管疾病的治疗。丹参主要药用成分包括脂溶性的二萜醌类化合物丹参酮类成分和水溶性的酚酸类化合物。现代研究表明丹参所含的丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。然而由于野生资源日益减少，加之丹参为多年生草本植物,生长周期长，药用活性成分含量低,在传统的栽培模式下，面临着品质严重退化及品种选育成本过高等诸多弊端。如何使丹参这一原料药的供应在数量和质量上更好地满足临床应用的需要，成为一个迫切需要解决的重要技术问题。同时丹参酮的结构复杂导致其化学合成工艺复杂，成本高，而且合成过程易造成环境污染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞，其活性成分积累量很低而且稳定性很差。

检索已有技术文献，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因SmHMGR和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因SmGGPPS是丹参酮生物合成途径中的两个关键限速酶基因，是丹参酮代谢工程的重要靶点。本发明采用基因工程手段将上述两个关键酶基因SmHMGR和SmGGPPS共转化丹参，打破丹参酮生物合成途径的瓶颈，获得丹参酮含量高的丹参毛状根或植株，为提高丹参酮产量，满足人类医疗需要，提供了新的技术方法。

经广泛检索专利文件和国内外公开出版物，未发现与本发明利用双关键酶基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量完全相同的技术方案，本发明具有新颖性和创造性；由于本发明在解决丹参酮药源紧缺，满足人类心血管疾病治疗需要，延长人类寿命具有重要意义，本发明具有实用性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种技术可靠、丹参酮成本低、无环境污染、能够有效提高丹参中丹参酮含量的双基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，步骤如下：

(1)采用基因克隆方法从丹参中克隆丹参酮生物合成酶基因SmHMGR和SmGGPPS基因；

(2)将SmHMGR和SmGGPPS基因连于表达调控序列，形成含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体；

(3)将步骤（2）获得含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体转化发根农杆菌；获得含SmHMGR和SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；

(4)将步骤（3）获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；

(5)半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中SmHMGR和SmGGPPS基因的相对表达量；

(6)高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量高的丹参转基因毛状根株系；

(7)DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。

步骤（4）所述的PCR检测方法为：

分别设计发根位点基因rol B, 潮霉素磷酸转移酶基因hpt的特异PCR引物；

启动插入基因SmHMGR，SmGGPPS表达的组成型启动子CaMV35S；

启动子的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行DNA扩增；

紫外线下观察目的条带的株系，为阳性转基因丹参毛状根株系。

步骤（5）所述的半定量RT-PCR检测SmHMGR和SmGGPPS基因表达量方法为：

对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，并统一定量到0.5μg RNA反转成30μl体系的cDNA第一条链；

分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的cDNA第一链为模板进行半定量RT-PCR扩增；

分析SmHMGR及SmGGPPS基因的相对表达量。

步骤（6）所述的高效液相色谱法如下：

色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65：35的乙腈和水；检测波长270 nm；柱温30 ℃；流速1 ml／min，进样量20 μl。

步骤（7）所述的DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性的方法为：

从转基因毛状根中提取收集丹参酮；

将提取的丹参酮稀释为梯度浓度：0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml，2μg/ml、4μg/ml的溶液各1ml；

向上述溶液分别加入0.2 mM的甲醇溶液；

在25 ℃下保温30 min；

将上述产物在分光光度计下517nm测吸收值。

本发明的要点是从丹参中克隆两个丹参酮生物合成关键酶基因：SmHMGR和SmGGPPS基因，构建含上述两种cDNA分子的植物表达载体，以发根农杆菌C58C1为介导，将SmHMGR和SmGGPPS基因同时导入丹参细胞中并获得毛状根。因此本发明提高毛状根中丹参酮含量效果更显著。

本发明利用克隆技术和已有的生物学实验手段如载体构建、遗传转化、分子检测、半定量RT-PCR分析、丹参酮提取及含量测定、DPPH清除自由基法测定转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性等，发明了一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。为大量生产临床医疗需要的丹参酮提供了一种优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺起到积极的促进作用。

本发明在丹参生产技术领域首次采用克隆技术提高了丹参中的丹参酮含量，并提供了一整套完善的配套技术，实现了本发明的目的。

本发明包括如下具体步骤：

采用基因克隆方法从丹参中克隆获得丹参酮生物合成关键酶基因SmHMGR和SmGGPPS；

把SmHMGR和SmGGPPS基因可操作性地连于表达调控序列，构成含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体；

将上述含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含SmHMGR和SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌工程菌株；将菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根株系；

半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中SmHMGR和SmGGPPS基因的表达；高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，获得丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根株系；利用DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中总丹参酮的抗氧化活性。

 PCR检测中，分别设计发根位点基因rolB,潮霉素磷酸转移酶基因hpt的特异PCR引物，并在植物表达载体上，启动插入基因SmHMGR、SmGGPPS表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部，及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物，进行DNA的PCR扩增；在紫外线下观察到目的条带的株系，即为阳性转基因毛状根株系。

半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中丹参酮生物合成相关基因SmHMGR，SmGGPPS的表达的方法为：对经PCR鉴定为阳性的毛状根株系进行总RNA的提取，并定到同一量的总RNA反转成cDNA第一条链体系作为模板，分别设计插入目的基因及看家基因18SrRNA的引物，取相同量的上述cDNA第一链体系为模板进行半定量RT-PCR扩增,分析相关基因SmHMGR，SmGGPPS的相对表达量。

高效液相色谱测定丹参酮含量的条件如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65：35的乙腈、水溶液，检测波长270 nm，柱温30℃，流速1ml／min，进样量20 μl。

 DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性的方法为：将从丹参转基因毛状根中提取收集的丹参酮样品稀释成一定浓度梯度：0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的甲醇溶液各1 ml，然后分别向个浓度溶液加入1 ml DPPH溶液（0.2 mM的甲醇溶液）作为自由基来源，并在25 ℃下保温30 min，样品在分光光度计517 nm下测吸收值。

本发明利用双关键酶基因共转化策略提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，将双关键酶基因SmHMGR和SmGGPPS共同导入丹参细胞中，获得了高产丹参酮的丹参毛状根株系。共转SmHMGR及SmGGPPS基因的毛状根中所检测的3种丹参酮（隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA）含量与对照组相比显著提高，其中丹参酮ⅡA的含量提高最为明显。共转SmHMGR和SmGGPPS基因的丹参转基因毛状根总丹参酮的平均含量为1.815 mg／g DW，是对照组毛状根0.475 mg／g DW的3.82倍。其中隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的平均含量分别为0.324 mg／g DW、0.787 mg／g DW和0.704 mg／g DW。对照组隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮是0.194 mg／g DW、0.149 mg／g DW、0.132 mg／g DW。本发明结果分别是对照组毛状根的1.67倍、5.28倍和5.33倍。在测试的共转SmHMGR和SmGGPPS基因丹参毛状根株系中，9号克隆（HG9）丹参酮含量最高，其隐丹参酮含量为0.315 mg／g DW，丹参酮Ⅰ含量为1.196 mg／g DW，丹参酮ⅡA含量为1.215 mg／g DW及总丹参酮含量为2.727 mg／g DW。分别是对照组的1.62倍，8.03倍，9.20倍，5.74倍。

本发明的优点是：

1、显著提高丹参毛状根中总丹参酮含量；

2、发明方法效果可靠；

3、丹参酮成本低；

4、生产过程无环境污染。

附图说明

图1 除菌培养4-5周的丹参毛状根。

图2 转基因毛状根的PCR鉴定图：

A：SmHMGR基因PCR检测；B：SmGGPPS基因PCR检测；

M,DL-2000 Marker(100—2,000bp)；

PC,阳性对照（pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS质粒）；

NC,阴性对照（野生型丹参）；

BC,空对照（pCAMBIAl304 ⁺ 质粒遗传转化丹参获得的毛状根）；

HG3-HG59为SmHMGR和SmGGPPS双基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。

图3 液体培养的丹参转基因毛状根。

图 4 转基因丹参毛状根RT-PCR：

图中：SmHMGR A，SmGGPPS A 分别代表总SmHMGR，SmGGPPS基因的表达；

SmHMGR B，SmGGPPS B 分别代表内源SmHMGR，SmGGPPS基因的表达；18S rRNA基因作为内参；

BC,为空对照：pCAMBIAl304 ⁺ 质粒遗传转化获得的丹参毛状根；

HG3-HG59为SmHMGR和SmGGPPS双基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。

图5 丹参共转SmHMGR, SmGGPPS基因株系平均丹参酮含量图：

CT，隐丹参酮；T1，丹参酮Ⅰ；T2A，丹参酮ⅡA；TT，总丹参酮；

HG，共转SmHMGR, SmGGPPS基因丹参毛状根株系；

BC,空对照：pCAMBIAl304 ⁺ 质粒遗传转化丹参获得的毛状根。

图6 DPPH自由基清除活性随丹参酮浓度变化趋势图：

HG9, SmHMGR和SmGGPPS双基因遗传转化丹参获得的9号毛状根克隆; BC，空对照；pCAMBIAl304 ⁺ 质粒遗传转化丹参获得的毛状根。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的，通常按照现有技术进行，例如分子克隆Sambrook等，或者按照制造厂商提供的试剂或试剂盒说明书规定的条件进行。

实施例1。

（1）丹参总RNA的提取及cDNA第一链的合成：

使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit从丹参转基因毛状根中提取总RNA，提取步骤按照试剂盒内的说明书。用于提取总RNA的丹参转基因毛状根的鲜重量为0.1g左右，提取过程中样品中的DNA已用DNase工作液清除。将提取的RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。根据不同RNA样品的浓度通过计算后，分别以0.5μg RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成，操作步骤按照Promega公司提供的说明书。

（2）SmHMGR和SmGGPPS编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得。

根据SmHMGR基因的编码序列SEQ ID NO.1和SmGGPPS基因的编码序列SEQ ID NO.2, 分别设计、扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上视选用的载体分别引入限制性内切酶位点，构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，克隆的序列与实验室在GenBank上登录的丹参SmHMGR基因SEQ ID NO.1)和SmGGPPS基因SEQ ID NO.2的编码序列完全一致。

实施例2

含丹参SmHMGR及SmGGPPS基因的植物表达载体的构建。

（1）中间载体pCAMBIAl304 ⁺ 的构建：

以pBIl21和pCAMBIAl304为材料，构建植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ 。具体为HindIII／EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIAl304；回收pBIl21-GUS表达盒及pCAMBIAl304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ 构建成功。

（2）植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS的构建：

在上述构建成功的pCAMBIAl304 ⁺ 基础上，用从丹参中克隆到的SmGGPPS基因替换GUS基因。具体为BamHI／SacI双酶切pMD18T-SmGGPPS和pCAMBIAl304 ⁺ ；回收SmGGPPS基因和pCAMBIAl304 ⁺ 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmGGPPS基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ 中，从而获得含SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS。

（3）植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS的构建：

以pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS为基础，使用从丹参中克隆的SmHMGR基因替换pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS上的GFP+GUS基因。具体为BglII／BstEII双酶切pMD18T-SmHMGR和pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS；回收SmHMGR基因及pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmHMGR基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmGGPPS中，从而获得含SmHMGR和SmGGPPS的植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS。

本实施例将丹参酮生物合成途径关键酶基因SmHMGR和SmGGPPS可操作性地连于表达调控序列，形成含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高丹参中丹参酮含量。

实施例3

发根农杆菌介导SmHMGR和SmGGPPS基因遗传转化丹参获得转基因毛状根。

（1）含植物表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS发根农杆菌工程菌的获得；

将实施例2中含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物双价表达载体pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。

（2）发根农杆菌介导SmHMGR，SmGGPPS基因遗传转化丹参：

①外植体的预培养：剪取丹参健壮无菌苗叶片(0.5 cm ² )，接种到预培养培养基(MS)上，25℃暗培养2 d；

②农杆菌与外植体的共培养：将上述预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的发根农杆菌工程菌的1／2MS悬液中浸泡10分钟，轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触；取出浸染后的丹参叶片，用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1／2 MS中，暗培养3-4 d；

③毛状根的诱导和继代培养

将上述的共培养3-4 d的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1／2 MS+Cef 500 mg／L)中，25℃暗培养3周；外植体伤口处长出毛状根。将已发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基1／2 MS+Cef 300 mg／L)上，25℃暗培养2周，毛状根长至3 cm以上，见图1。剪取单一毛状根作为无性系，继续接种于除菌培养基1／2 MS+Cef 100 mg／L中暗培养两周，直至无农杆菌溢出。

（3）转基因丹参毛状根的PCR检测。

①提取转基因毛状根基因组DNA：

采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取除菌完毕的转基因毛状根5 cm左右放入1.5 ml离心管中，加入石英砂，和65 ℃预热、含1% β巯基乙醇CTAB裂解液600 μl，用研磨棒将材料充分磨碎。置于65 ℃水浴锅中40-50分钟，搅拌混匀样品多次，每次10 min，冷却至室温后加入等体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化10 min，12000 rpm离心20 min，吸取上清于新EP管中，加入体积比1:1的苯酚/氯仿溶液，轻轻混匀，12000 rpm离心20 min。缓慢吸取上清于新EP管中，再次加入等体积的氯仿混匀，12000 rpm离心20 min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇，4 ℃洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50 μl水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80 ℃超低温冰箱冻存，备用。

②引物设计及PCR检测：

分别设计发根位点基因rol B, 潮霉素磷酸转移酶基因hpt的特异PCR引物，在pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS上启动插入目的基因SmHMGR和SmGGPPS表达的组成型表达启动子CaMV35S插入基因SmHMGR和SmGGPPS上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中能检测到和pCAMBIAl304 ⁺ -SmHMGR-SmGGPPS质粒为模板的阳性对照大小相当的PCR产物。以pCAMBIAl304 ⁺ 空载体遗传转化丹参所发出的毛状根及野生型丹参植株根的基因组DNA为模板时，检测不到插入基因SmHMGR和SmGGPPS，见图2。结果说明SmHMGR，SmGGPPS基因已经整合到丹参基因组中。

本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含SmHMGR和SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参细胞，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选获得高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。

实施例4

半定量RT-PCR检测转基因丹参毛状根中SmHMGR和SmGGPPS基因的表达。

（1）毛状根液体培养，见图3：

选择实施例3中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3 cm用无菌蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有200ml 1／2 MS液体培养基的培养瓶中，100 rpm，25 ℃黑暗下培养，每20天更换新鲜1／2 MS液体培养基继代一次，80天后收获。取新鲜毛状根，用吸水纸吸干表面水分，用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻，保存于-80 ℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮含量提取。

（2）引物的设计和合成：

根据丹参酮生物合成代谢途径关键酶基因SmHMGR和SmGGPPS的编码序列分别设计引物，用于检测丹参毛状根中总的SmHMGR和SmGGPPS基因的表达情况，SmHMGR，SmGGPPS为丹参来源基因。通过在SmHMGR和SmGGPPS的3’编码序列分别设计一个下游引物和目的基因上的上游引物配对，检测内源基因的表达情况，转入的外源基因仅是基因的编码框序列，不带有5’及3’非编码序列，看家基因18S rRNA用来作为内参。引物由上海生工生物工程公司合成。

（3）RNA的提取及cDNA第一链的合成：方法同实施例1中的（1）。

（4）半定量RT-PCR检测SmHMGR，SmGGPPS及看家基因18S rRNA基因的表达：

以相同量的上述cDNA第一链为模板，分别用上述设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

MilliQ                   15.75 μl

dNTP（2mM）                2.5 μl

10×Buffer（Mg ²⁺ -）         2.5 μl

Mg ²⁺                         1.5 μl

F上游引物                    1μl

R下游引物                    1μl

模板                        0.5μl

Taq酶                     0.25μl 

总体积                       25μl。

 PCR反应条件：94 ℃10 min，30个循环，94 ℃变性45 sec，55 ℃退火60 sec，72 ℃延伸100 sec，72 ℃10 min。看家基因18SrRNA基因检测的PCR反应条件，将循环数改为20个。结果显示，SmHMGR，SmGGPPS基因在转入相应基因的毛状根克隆中都过量表达，强于其在对照组中的表达，但不同克隆之间的表达量有一定的差异，见图4。

本实施例采用半定量RT-PCR技术测定转基因丹参毛状根中SmHMGR，SmGGPPS基因的表达情况，为分析SmHMGR，SmGGPPS基因在丹参酮合成过程中所起的作用提供依据。

实施例5

利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量。

（1）色谱条件及标准品贮备液的配制：

色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水（65：35），检测波长270nm，柱温30 ℃，流速1 ml／min，进样量20 μl；

精密称取隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA标准品，分别配置成浓度为36μg/ml，36μg/ml，22μg/ml标准品贮备液，-20 ℃保存备用。

（2）标准曲线的制作：

本发明中流动相乙腈：水在体积比65：35时，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的保留时间分别为18.90 min, 20.53 min和34.00 min，三种丹参酮成分完全分离，且峰型良好。将上述标准品贮备液品分别取5 ul，10 ul，20 ul，30 ul，40 ul在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，μg/ml)进行回归分析。结果表明，隐丹参酮在9-72ug／ml、丹参酮Ⅰ在9-72μg／ml、丹参酮ⅡA在5.5-44μg／ml范围内呈现良好的线性关系。

（3）转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定：

将实例4中获取并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨，取200mg毛状根干粉加入体积比3：1的甲醇、二氯甲烷溶液16ml；超声波提取60min；室温放置过夜；次日拿出离心12000rpm，10 min；吸取上清萃取液真空干燥。残余物重新用1ml的色谱甲醇：二氯甲烷（3:1）混合液体溶解；样品用0.22μM的滤膜过滤后各取20 μl，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算得样品丹参酮含量。

本发明中共转SmHMGR及SmGGPPS基因的毛状根中所检测的隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA 三种丹参酮含量与对照组相比显著提高，其中丹参酮ⅡA的含量提高最为明显。共转SmHMGR和SmGGPPS基因的丹参转基因毛状根总丹参酮的平均含量为1.815 mg／g DW，对照组毛状根0.475 mg／g DW，为3.82倍。其中隐丹参酮平均含量为0.324 mg／g DW，丹参酮Ⅰ含量为0.787 mg／g DW，丹参酮ⅡA含量为0.704 mg／g DW，对照组毛状根的平均含量分别为0.194 mg／g DW，0.149 mg／g DW，0.132 mg／g DW。转基因毛状根和对照组毛状根相比较，分别为1.67倍、5.28倍、和5.33倍，见图5。在所测试的共转SmHMGR和SmGGPPS基因丹参毛状根株系中，9号克隆（HG9）丹参酮含量最高，其隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA及总丹参酮含量分别为0.315 mg／g DW，1.196 mg／g DW，1.215 mg／g DW，2.727 mg／g DW。分别是对照组的1.62倍，8.03倍，9.20倍和5.74倍。

本实施例采用HPLC法测定了转基因丹参毛状根丹参酮含量。结果表明共转SmHMGR和SmGGPPS基因的丹参毛状根总丹参酮含量比对照组显著提高，其中丹参酮ⅡA含量提高的最为明显。

实施例6

DPPH清除自由基法测定转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性，见图6。

（1）样品溶液制备：

将样品稀释成浓度梯度：0.25 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml的甲醇溶液各1 ml；加入1，1-二苯基苦基苯肼DPPH溶液1ml和0.2 mM的甲醇溶液作为自由基来源，在25℃下保温30min。

（2）样品的吸光度测定及DPPH自由基清除活性的换算：

将梯度浓度样品分别在分光光度计下517 nm测定并记录其吸收值，根据下面的公式将吸光度值转换成DPPH自由基清除活性：

DPPH自由基清除活性（%）=[(A ₀ -A ₁ )/A ₀ ×100]

A ₀ 是对照样品吸光度值；

A ₁ 是样品或标准品吸光度值。

（3）DPPH自由基清除活性能力的比较：

IC50为50%抑制浓度，即清除该样品中一半的DPPH自由基所需该样品中活性成分的浓度，半数抑制是衡量样品中活性成分灵敏度指标，半数抑制越低,说明其灵敏度越高，清除DPPH自由基能力越强，抗氧化能力亦越强。

结果表明：DPPH自由基清除活性计算出样品HG9及对照组的IC50分别为0.3045，0.3049 μg/ml，差异不明显。但样品HG9的总丹参酮含量比对照组高5.74倍，结论为样品HG9丹参酮的总抗氧化活性显著高于对照组。

本实施例证明了通过转基因方法获得的丹参毛状根中的单位丹参酮的抗氧化能力和对照相当，因此通过本发明方法获得高含量丹参酮的丹参毛状根是可行的。

本发明采用共转SmHMGR, SmGGPPS基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状根株系，为规模化生产丹参酮，缓解丹参酮的药源紧缺提供了一种新的有效方法。

以上所述本发明的实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，步骤如下：

(1)采用基因克隆方法从丹参中克隆丹参酮生物合成酶基因SmHMGR和SmGGPPS基因；

(2)将SmHMGR和SmGGPPS基因连于表达调控序列，形成含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体；

(3)将步骤（2）获得含SmHMGR和SmGGPPS基因的植物表达载体转化发根农杆菌；获得含SmHMGR和SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；

(4)将步骤（3）获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；

(5)半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中SmHMGR和SmGGPPS基因的相对表达量；

步骤（5）所述的半定量RT-PCR检测SmHMGR和SmGGPPS基因相对表达量方法为：

（a）对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，并统一定量到0.5μg RNA反转成30μl体系的cDNA第一条链；

（b）分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的cDNA第一链为模板进行半定量RT-PCR扩增；

（c）分析SmHMGR及SmGGPPS基因的相对表达量；

(6)高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量高的丹参转基因毛状根株系；

所述的高效液相色谱法如下：

色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65：35的乙腈和水；检测波长270nm；柱温30℃；流速1ml/min，进样量20μl；

(7)DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。

2.根据权利要求1所述的双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征在于：步骤（7）所述的DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性的方法为：

（1）从转基因毛状根中提取收集丹参酮；

（2）将步骤（1）提取的丹参酮稀释为梯度浓度：0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml，2μg/ml、4μg/ml的溶液各1ml；

（3）向步骤（2）所得溶液分别加入0.2mM的甲醇溶液；

（4）步骤（3）所得产物在25℃下保温30min；

（5）将步骤（4）产物在分光光度计下517nm测吸收值。

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