CN102586288A - 一种提高丹参中丹参酮含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种提高丹参中丹参酮含量的方法。本发明从丹参中克隆出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因的编码框序列，并构建含DXS基因的植物高效表达载体，遗传转化丹参叶片获得转DXS基因的丹参毛状根，半定量RT-PCR分析DXS在丹参转基因毛状根中的表达。高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中总丹参酮(隐丹参酮，丹参酮工和丹参酮IIA)含量。本发明获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，其中表现最好的一个株系的总丹参酮含量为对照的2.89倍。本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，也为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质原料。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种关键酶基因DXS遗传转化提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)又名紫丹参、红根、赤参、活血参等，隶属于唇形科鼠尾草属，为多年生草本植物。作为一种传统中药，丹参在临床上主要应用于对心血管疾病的治疗。丹参主要药用成分包括脂溶性的二萜醌类化合物(丹参酮类成分)和水溶性的酚酸类化合物。现代研究表明丹参所含的丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。目前生长周期长，品质严重退化是丹参传统植株栽培的一个弊端；丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞其活性成分积累量很低而且稳定性很差。代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。
据文献报道，1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXS)可能是丹参酮合成途径中的限速酶基因，是丹参酮代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将上述关键酶基因DXS遗传转化丹参，将打破丹参酮生物合成途径的瓶颈效应，获得高产丹参酮的丹参毛状根或植株，为商业化生产丹参酮提供新途径，但目前尚未发现与本发明主题所提及的关键酶基因转化策略提高丹参毛状根中丹参酮含量的相关报道。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。一些常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、半定量RT-PCR分析、丹参酮提取及含量测定、DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性等应用于本发明，建立了一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，为丹参毛状根商业化生产奠定坚实的基础，对缓解丹参酮药源的紧缺性具有一定的积极意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从丹参中克隆获得DXS基因，构建含DXS基因的植物表达载体，以发根农杆菌C58C1为介导，将DXS基因导入丹参细胞中并获得毛状根；PCR检测目的基因DXS的整合情况，半定量RT-PCR分析DXS在丹参转基因毛状根中的表达情况，高效液相色谱测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。
本发明包括如下具体步骤：
(1)采用基因克隆方法获得丹参关键酶酶基因DXS；
(2)把DXS基因可操作性地连于表达调控序列，形成含DXS基因的植物表达载体；
(3)将含DXS基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含DXS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；
(4)利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；
(5)半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中DXS基因的表达；
(6)高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根株系。
所述的提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征是，所述的经PCR检测的阳性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因(DXS)表达的组成型启动子CaMV35S的内部及插入基因DXS的内部分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系。
所述的提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征是，半定量RT-PCR检测DXS基因在丹参转基因毛状根中的表达情况，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，并统一定量到0.5μg RNA反转成30μl体系的cDNA第一条链，分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的上述cDNA第一链为模板进行半定量RT-PCR扩增，分析DXS基因的相对表达量情况。
所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征是，所述的对经PCR检测为阳性的转基因毛状根中丹参酮含量进行高效液相色谱法测定，具体测定方法如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈∶水(65∶35)，检测波长270nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。
本发明的关键酶基因转化策略提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，采用基因工程方法，将丹参酮合成途径关键酶基因DXS导入丹参细胞中，获得了高产丹参酮的丹参毛状根株系。转DXS基因的丹参毛状根中所检测的总丹参酮(隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA)含量相比于对照组显著提高。转DXS基因的丹参毛状根总丹参酮的平均含量为1.02mg/g DW，是对照组毛状根(0.49mg/g DW)的2.08倍。在所测试的转DXS基因丹参毛状根株系中，9号克隆(D9)总丹参酮含量最高(1.42mg/g DW)，是对照组的2.89倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。
实施例1
丹参DXS基因的克隆
1.1.丹参总RNA的提取
取少量丹参(采用产于山东平邑丹参酮含量较高的丹参品种)幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RNA preppure plant kit使用说明提取总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
1.2.丹参DXS基因的克隆
以所获的0.5μg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。根据所述丹参DXS基因的编码序列(序列表中的序列1)，分别设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链CDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的DXS基因的编码序列一致。
实施例2
含DXS基因的植物表达载体的构建
2.1.中间载体pCAMBIA1304+的构建
以pBIl21和pCAMBIAl304为材料，构建植物表达载体pCAMBIAl304+。具体地，HindIII/EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIAl304；回收pBIl21-GUS表达盒及pCAMBIAl304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体pCAMBIAl304+构建成功。
2.2.植物表达载体pCAMBIAl304+-DXS的构建
在上述构建成功的pCAMBIAl304+基础上，用从丹参中克隆到的DXS基因替换其上的GUS基因。具体地，BamHI/SacI双酶切pMD18T-DXS和pCAMBIAl304+；回收DXS基因和pCAMBIAl304+大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，DXS基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304+中，从而获得含DXS基因的植物表达载体pCAMBIAl304+-DXS。
本实施例将丹参酮生物合成途径关键酶基因DXS可操作性地连于表达调控序列，形成含DXS基因的植物表达载体pCAMBIAl304+-DXS，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高丹参中丹参酮含量。
实施例3
发根农杆菌介导DXS基因遗传转化丹参获得转基因丹参毛状根
3.1.含植物表达载体pCAMBIAl304+-DXS发根农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含DXS基因的植物表达载体pCAMBIAl304+-DXS转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含DXS基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。
3.2.发根农杆菌介导DXS基因遗传转化丹参
3.2.1.外植体的预培养
剪取丹参健壮无菌苗叶片(0.5cm2)，接种到预培养培养基(MS)上，25℃暗培养2d。
3.2.2.农杆菌与外植体的共培养
将上述经预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的丹参叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养3-4d。
3.2.3.毛状根的诱导和继代培养
将上述的共培养3-4d的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cef500mg/L)中，25℃暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cef300mg/L)上，25℃暗培养2周待毛状根长至3cm以上时剪取单一毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基(1/2MS+Cef 100mg/L)中暗培养两周，直至无农杆菌溢出。
3.3.转基因丹参毛状根的PCR检测
3.3.1.转基因毛状根基因组DNA的提取
本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3.2.3中除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入1.5ml离心管中，加入适量的石英砂及600μl CTAB裂解液(65℃预热，含1％β巯基乙醇)，用研磨棒将材料充分磨碎。置于65℃水浴锅中40-50分钟，其间多次混匀样品(次/10min)，冷却至室温后加入等入体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化10min，12000rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿(1∶1)，轻轻混匀，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加等体积的氯仿混匀，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75％乙醇4℃洗涤过夜。次日用75％乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50μl水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80℃超低温冰箱冻存，备用。
3.3.2.引物设计及PCR检测
在pCAMBIAl304+-DXS上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子CaMV35S及插入基因(DXS)上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中能检测到和阳性对照大小相当的PCR产物。而以pCAMBIAl304+空载体遗传转化丹参所获得的毛状根及野生型丹参植株根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。结果说明DXS基因已经整合到丹参基因组中。
本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含DXS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参细胞，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选获得高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。
实施例4
半定量RT-PCR检测丹参转基因丹参毛状根中DXS基因的表达
4.1.毛状根液体培养
选择实施例3中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌水蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有200ml 1/2MS液体培养基的培养瓶中100rpm，25℃黑暗下培养，每20天更换新鲜1/2MS液体培养基继代一次，80天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻后保存于-80℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮含量提取。
4.2.转基因丹参毛状根的半定量RT-PCR检测
根据丹参酮生物合成代谢途径关键酶基因DXS的编码序列设计引物用于检测丹参毛状根中总的DXS的表达情况(DXS为丹参内源基因)，而通过在DXS的3’上设计一个下游引物和该基因上的上游引物配对则可以检测内源基因的表达情况(转入的部分为基因的编码序列，不带有5’及3’非编码序列)，看家基因18S rRNA用来作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。结果显示，DXS基因在丹参转基因毛状根克隆中都过量表达且表达量都强于对照组，但不同克隆之间的表达量有一定的差异。
本实施例采用半定量RT-PCR技术测定丹参转基因毛状根中DXS基因的表达情况，为分析DXS基因在丹参酮合成过程中所起的作用提供一定的依据。
实施例5
利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量
5.1.色谱条件及标准品贮备液的配制
色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈∶水(65∶35)，检测波长270nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。
精密称取隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮II A标准品分别配置成浓度为36μg/ml，36μg/ml，22μg/ml标准品贮备液，保存于-20℃备用。
5.2.标准曲线的制作
本发明中流动相乙腈∶水在体积比65∶35时，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮II A的保留时间分别为18.90min，20.53min和34.00min，三种丹参酮成分完全分离，且峰型良好。将上述标准品贮备液品分别取5ul，10ul，20ul，30ul，40ul在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，μg/ml)进行回归分析。结果表明，本发明中隐丹参酮在9-72ug/ml、丹参酮I在9-72μg/ml、丹参酮II A在5.5-44μg/ml范围内呈现良好的线性关系。
5.3.转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定
将实例4中收获并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨，取200mg毛状根干粉加入甲醇∶二氯甲烷(3∶1，v/v)16ml，超声提取60min，室温放置过夜，次日拿出离心(12000rpm，10min)，吸取上清萃取液真空干燥，残余物重新用1ml的色谱甲醇∶二氯甲烷(3∶1)混合液体溶解，样品用0.22μM的滤膜过滤后各取20μl，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品丹参酮含量。
在本发明中转DXS基因的毛状根中所检测的总丹参酮(隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮II A)含量相比于对照组显著提高。转DXS基因的丹参毛状根总丹参酮的平均含量为1.02mg/g DW，是对照组毛状根(0.49mg/g DW)的2.08倍。在所测试的转DXS基因丹参毛状根株系中，9号克隆(D9)总丹参酮含量最高(1.42mg/g DW)，是对照组的2.89倍。
本实施例采用HPLC法测定了丹参转基因毛状根丹参酮含量。结果表明转DXS基因的丹参毛状根总丹参酮含量比对照组显著提高。
在本发明中通过转DXS基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状根株系，为商业化化生产丹参酮，缓解丹参酮的药源紧缺性问题提供了一条理想方法。
Claims (5)
1.一种1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS遗传转化丹参提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征在于，从丹参中克隆1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用发根农杆菌介导法将DXS基因导入丹参叶片并获得毛状根，PCR检测目的基因DXS的整合情况，半定量RT-PCR检测目的基因DXS在丹参转基因毛状根中的表达情况，高效液相色谱测定丹参转基因毛状根丹参酮含量，筛选获得丹参酮含量提高的转基因丹参发根。
2.根据权利要求1所述的转DXS基因提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征是，包括如下具体步骤：
(1)采用基因克隆方法获得丹参关键酶酶基因DXS；
(2)把DXS基因可操作性地连于表达调控序列，形成含DXS基因的植物表达载体；
(3)将含DXS基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含DXS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；
(4)利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；
(5)半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中DXS基因的表达；
(6)高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根株系；
3.根据权利要求2所述的提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征是，所述的经PCR检测的阳性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因(DXS)表达的组成型启动子CaMV35S的内部及插入基因DXS的内部分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系。
4.根据权利要求2所述的提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征是，半定量RT-PCR检测DXS基因在丹参转基因毛状根中的表达情况，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，并统一定量到0.5μg RNA反转成30μl体系的cDNA第一条链，分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的上述cDNA第一链为模板进行半定量RT-PCR扩增，分析DXS基因的相对表达量情况。
5.根据权利要求2所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征是，所述的对经PCR检测为阳性的转基因毛状根中丹参酮含量进行高效液相色谱法测定，具体测定方法如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈∶水(65∶35)，检测波长270nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120718 |