CN114891810B

CN114891810B - 丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用

Info

Publication number: CN114891810B
Application number: CN202210448800.4A
Authority: CN
Inventors: 刘谦; 邓华亮; 杨然; 梁从莲; 胡晶红; 李佳; 蒲高斌; 张永清
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN114891810A

Abstract

本发明公开了丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用，属于基因工程技术领域。所述丹参SmSnRK2.7基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述丹参酮为隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA中的至少一种或两种以上。本发明还公开了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。本发明通过实验研究发现，SmSnRK2.7基因对丹参酮类成分的合成与积累具有正调控作用，过表达SmSnRK2.7基因可有效提高丹参酮类成分的含量。本发明对培育有效成分含量高的丹参新种质具有重要的理论价值，对保障丹参质量具有重要的产业意义。

Description

丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用

技术领域

本发明涉及丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.)的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈等功效，在治疗心脑血管、心绞痛等疾病上丹参的应用频率非常高。

脂溶性成分丹参酮是丹参的主要有效成分之一，属于次生代谢物质，具有抗凝血、抗炎、抗纤维化、抗肿瘤、脏器保护等药理活性。丹参酮作为一种重要的有效成分而备受关注，国内外对丹参次生代谢调控的研究也越来越多。如何提高丹参中丹参酮类化合物的含量、培育丹参优良品种已成为当前研究的重要方向。随着分子生物学以及基因工程手段的不断发展，药用植物次生代谢工程日趋完善，对丹参酮类成分合成途径中的关键酶基因和参与调控的转录因子的过表达或者沉默，成为提高丹参酮类成分积累的有效手段。

蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)是植物中特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了对干旱等非生物胁迫的响应和对逆境信号分子ABA的转导。已有研究表明，过表达小麦TaSnRK2.10可显著增强水稻的抗旱性；在丹参中过表达SmSnRK2.6，转基因毛状根中丹酚酸B和迷迭香酸的含量显著升高；在对青蒿次生代谢调控的研究中发现，AaAPK1是SnRK2家族的成员之一，通过激活青蒿素生物合成的相关基因，促进青蒿素的合成；而SnRK2家族基因在调控丹参根系发育以及丹参酮类次生代谢产物合成和积累方面的研究尚未见报道，其作用机制和分子机理值得深入解析。

丹参SnRK2家族共有5个成员，其中SmSnRK2.7属于第Ⅱ亚类SnRK2s蛋白激酶，在丹参根中的表达量最高，受ABA微弱诱导而强烈响应外源PEG的处理，SmSnRK2.7能够对干旱胁迫作出积极应答。

发明内容

针对上述现有技术，针对上述现有技术，本发明提供了丹参SmSnRK2.7基因的一种新用途——在提高丹参酮含量中的应用。本发明还提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用，所述丹参SmSnRK2.7基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

进一步地，所述丹参酮为隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA中的至少一种或两种以上。

进一步地，具体应用时，在丹参毛状根中过表达丹参SmSnRK2.7基因，以提高丹参毛状根中丹参酮的含量。

进一步地，在丹参毛状根中过表达丹参SmSnRK2.7基因的具体方式可以为：构建含有丹参SmSnRK2.7基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达丹参SmSnRK2.7基因的阳性毛状根。

一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，包括以下步骤：构建含有丹参SmSnRK2.7基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达丹参SmSnRK2.7基因的阳性毛状根，其丹参酮含量高于野生型毛状根。

本发明基于丹参全基因组数据，对丹参SnRK2基因家族进行鉴定及表达分析，筛选出可能调控丹参酮类成分合成和积累的SmSnRK2.7基因，构建了含有SmSnRK2.7基因片段的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，获得SmSnRK2.7基因过表达阳性毛状根。利用实时荧光定量PCR方法检测SmSnRK2.7基因过表达阳性毛状根中丹参酮合成路径关键酶基因的表达水平，利用高效液相色谱法检测SmSnRK2.7基因过表达阳性毛状根中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量。结果表明，SmSnRK2.7基因对丹参酮类成分的合成与积累具有正调控作用，过表达SmSnRK2.7能够显著提高丹参酮类物质的合成和积累，可有效提高丹参酮类成分的含量，SmSnRK2.7调控丹参酮类成分生物合成可能是通过非ABA依赖途径。

本发明综合利用载体构建、高效液相色谱法等技术，发现了SmSnRK2.7基因调控丹参酮含量的用途，提供了一种利用SmSnRK2.7基因提高丹参毛状根中丹参酮的方法，对提高丹参酮产量提供了重要的理论依据，对培育有效成分含量高的丹参新种质具有重要的理论价值，对保障丹参质量具有重要的产业意义。

附图说明

图1：pMDC202载体的结构图谱。

图2：重组质粒转化农杆菌的电泳检测结果示意图。

图3：毛状根DNA的PCR鉴定电泳图(pMDC202-SmSnRK2.7)，其中，M：DL2000；泳道1～10：待鉴定毛状根。

图4：毛状根DNA的PCR鉴定电泳图(rolB)，其中，M：DL2000；泳道1：WT；泳道2：EV；泳道3～8：OE。

图5：毛状根DNA的PCR鉴定电泳图(rolC)，其中，M：DL2000；泳道1：WT；泳道2：EV；泳道3～8：OE。

图6：毛状根DNA的PCR鉴定电泳图(hpt)，其中，M：DL2000；泳道1：WT；泳道2：EV；泳道3～8：OE。

图7：毛状根的照片，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。

图8：丹参酮合成路径关键酶基因SmCPS1的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图9：丹参酮合成路径关键酶基因SmCPS2的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图10：丹参酮合成路径关键酶基因SmDXS的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图11：丹参酮合成路径关键酶基因SmIDS的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图12：丹参酮合成路径关键酶基因SmGGPPS的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图13：丹参酮合成路径关键酶基因SmAACT的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图14：丹参毛状根中丹参酮成分——二氢丹参酮Ⅰ含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图15：丹参毛状根中丹参酮成分——隐丹参酮含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图16：丹参毛状根中丹参酮成分——丹参酮Ⅰ含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图17：丹参毛状根中丹参酮成分——丹参酮ⅡA含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE-1～OE-8：编号为OE-1～OE-8的过表达毛状根株系。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1pMDC202-SmSnRK2.7过表达载体的构建及转化

(1)目的片段PCR扩增

以丹参组培苗为实验材料，用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取总RNA，用TaKaRa反转试剂盒反转获得cDNA。根据SnRK2.7基因编码区序列设计上游引物和下游引物。以反转录得到的cDNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增。引物序列如下：

上游引物：5’-GAGGACCTCGACTCTAGAATGGAAAGATACGATATTTTGAAAG-3’；

下游引物：5’-CATTTTTTCTACCGGTACCTCATAGCGCACAAACAAAAT-3’。

PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix，12.5μL；引物P1(10μmol/L)，1μL；引物P2(10μmol/L)，1μL；cDNA，2μL；ddH₂O补足至25μL。

PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，切下1kb左右条带。用天根的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该目的基因片段。回收产物于-20℃冰箱保存备用。

(2)线性化载体的制备

载体pMDC202的图谱如图1所示。使用XbaⅠ和KpnⅠ酶切载体pMDC202，酶切体系为：Buffer，2μL；XbaⅠ，1μL；KpnⅠ，1μL；载体质粒DNA，1μg；RNase Free H₂O补足至20μL。金属浴37℃反应30min。酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。利用Vazyme胶回收试剂盒，回收目的载体大片段，得线性化载体。

(3)同源重组

将回收的目的基因片段与酶切后的线性化载体于冰上进行重组反应，PCR仪37℃反应30min，立即置于冰上冷却，得重组产物。重组反应体系如表1所示，同时设置阳性对照、阴性对照-1、阴性对照-2。

表1

(4)重组产物转化

取10μL重组产物，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，转化方法为：重组产物加入100μl的DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s，立刻冰上冷却2min，加入500μl已灭菌的无抗生素的LB培养基，37℃、200rpm摇菌1小时，7000rpm离心3min，吸掉400μl上清，将菌体重悬，用涂布器涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时。

(5)重组产物鉴定

挑取单克隆菌落，加入含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养器中培养8小时，进行菌液PCR鉴定，选取阳性克隆测序。测序正确的阳性质粒用于后续实验。利用天根试剂盒提取质粒，成功得到重组质粒——pMDC202-SmSnRK2.7过表达载体。

(6)重组质粒转化Ar.Qual发根农杆菌

取出Ar.Qual发根农杆菌感受态细胞，于手心放置片刻，待其部分融化、处于冰水混合状态时插入冰中；每100微升感受态分别加入0.05μg的重组质粒、空载质粒及Marker质粒，快速弹拨管底以混匀，按冰上、液氮、37℃水浴、冰浴依次放置5分钟；加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃摇床培养3小时；6000rpm离心1分钟，留取100μL的上清，混匀后涂布于含有利福平的LB平板上，28℃培养箱中倒置培养3天。挑取单菌落，接种于7.5mL的YEB液体培养基，28℃，200rpm培养12小时，通过菌落PCR方法鉴定阳性克隆，电泳检测的结果如图2所示。

实施例2丹参毛状根诱导

步骤如下：

(1)分别挑取含有过表达载体和空载体的Ar.Qual单菌落，接入含抗生素的YEB培养基。同时挑取不含任何外源质粒的Ar.Qual单菌落，接入不含抗生素的YEB培养基液体中活化，活化至OD600(在600nm波长处的吸光值)为0.6，5000rpm离心10min，留取沉淀。

(2)取继代30天的丹参无菌苗第二轮叶片，剪刀剪成0.5cm²的小块，并在叶片上用刀片轻划几下，在MS(pH5.8)培养基上预培养2天。

(3)向步骤(1)中的沉淀加入MS液体培养基，并加入400μmol/L的乙酰丁香酮，重悬20min，得菌液。

(4)菌液侵染叶片10min，无菌滤纸吸干菌液，MS(pH5.8)培养基上共培养3天。

(5)用无菌水清洗5次，无菌滤纸吸干多余水分，于一次分化培养基(MS+Cef500mg/L)上进行培养；每隔14天转移一次，同时逐渐降低抗生素的浓度至无抗生素。

(6)两个星期左右开始长出毛状根，待其长至2厘米左右，用剪刀剪下单独培养。

(7)待毛状根在固体分化培养基上生长两个月左右后，转移至液体6,7-V培养基中进行扩大培养，液体培养一个月左右进行后续分析，其中，利用含有过表达载体的农杆菌菌液培养得到的毛状根为过表达毛状根(OE)，利用含有空载体的农杆菌菌液培养得到的毛状根为空载型毛状根(EV)，利用不含外源质粒的农杆菌菌液培养得到的毛状根为野生型毛状根(WT)。

实施例3过表达SmHD-Zip12毛状根阳性株系的鉴定

(1)提取转基因毛状根基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，并借助电泳进行鉴定。分别以pMDC202-SmSnRK2.7，pMDC202质粒上的潮霉素基因hpt，发根农杆菌Ri质粒上的rol B和rol C基因为模板设计引物，引物序列如表2所示。

表2

利用pMDC202-F和SmSnRK2.7-R判断SmSnRK2.7过表达阳性毛状根：前期，从培养得到的多个pMDC202-SmSnRK2.7单株系中选取10个进行检测，结果如图3所示，10个中有7个为阳性株系，阳性率为70.0％。随后对其它pMDC202-SmSnRK2.7单株系进行同样的检测，得到多个阳性株系，从这些阳性株系(包括前期的6个阳性株系)中随机选取8个进行下一步实验(实施例4)。

WT、EV和OE株系用3对引物进行PCR鉴定，分别为rolB(423bp)、rolC(626bp)、hpt(855bp)。电泳结果如图4、图5、图6所示，从图中可以看出，阳性株系的条带大小与预期的大小一致，表明发根农杆菌中重组质粒的T-DNA区域成功插入到丹参毛状根基因组中。

实施例4丹参酮合成路径关键酶基因表达分析

选取空载型毛状根(1个株系)、野生型毛状根(1个株系)、过表达毛状根(实施例3中选取的8个阳性株系，编号为OE-1～OE-8)作为实验对象，它们的照片如图7所示。提取毛状根的RNA，反转录为cDNA，利用qRT-PCR检测SmSnRK2.7及丹参酮代谢途径上相关合成酶基因(SmCPS1、SmCPS2、SmDXS、SmIDS、SmGGPPS、SmAACT)表达量的变化，以β-actin作为内参基因，定量引物序列如表3所示。

表3

qRT-PCR反应体系为：TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)，12.5μL；正向引物(10μmol/L)，1μL；反向引物(10μmol/L)，1μL；cDNA模板，2μL；RNase-freeddH₂O，8.5μL；共20μL。

qRT-PCR反应条件为：预变性95℃，30s；变性95℃，10s，退火55℃，30s，延伸72℃，1min，40个循环。

结果如图8～图13所示，SmSnRK2.7在空载(EV)和野生型(WT)株系中的表达量相差不大，过表达(OE)株系中的含量均显著高于WT和EV型，其中表达量最高的OE-5，为WT型的40倍，表达量最低的OE-8为WT型的10倍，表明SmSnRK2.7确实在毛状根中进行了过表达。EV型株系与WT型株系相比较，6个关键酶基因的表达量无显著差异。与野生和空载型株系相比，OE-5株系6个关键酶基因的表达量均最高，表明SmSnRK2.7在OE-5株系中的过表达能力相对更强。与野生型株系相比，SmDXS基因的表达水平出现了显著性升高，最高株系OE-5达到了18倍，SmIDS基因的表达水平变化相对不明显，最高株系OE-5仅变化了1.5倍，SmCPS1、SmCPS2、SmAACT和SmGGPPS基因的表达量变化在2～5倍之间。由此可见，SmSnRK2.7基因过表达可以提高丹参酮合成路径关键酶基因的表达，尤其促进SmDXS基因的表达水平。

实施例5丹参酮类成含量测定

(1)标准曲线的制定

精密称取二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA标准品，用甲醇配置成浓度为1mg/mL的母液，分别稀释成浓度为0.5、0.8、1、5、8、100μg/mL的混合标准溶液，进行高效液相色谱分析，记录4种标准品的峰面积。以各标准品溶液的浓度(X)和峰面积(Y)为横、纵坐标，绘制4种丹参酮类成分的标准曲线。

(2)丹参酮类成分的提取和HPLC含量测定

将同一转化周期的SmHD-Zip12过表达毛状根、空载型毛状根和野生型毛状根(与实施例4中的样品相同)置于6,7-V液体培养基中培养，待生长30天后取出，液氮速冻放于-80℃用于高效液相色谱分析。样品分析前毛状根材料经冷冻干燥48小时，研磨成粉末，过40目筛。精密称取0.25g，置于50mL离心管中，加入25mL甲醇，涡旋振荡，100W，100Hz，50℃，超声50min，4000rpm离心10min，吸取上清过0.22μm有机滤膜，利用高效液相仪检测丹参酮类成分。

(3)色谱条件

色谱柱DIamonsIl C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，理论塔板数按丹参酮ⅡA计。0.01％磷酸(A)-乙腈(C)为流动相，流动相洗脱梯度见表4；检测波长270nm；体积流量1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL。

表4

结果如图14、图15、图16、图17所示，空载EV和野生WT中4种丹参酮类物质的含量无显著性变化；OE-5过表达株系中，4种丹参酮类物质的含量均显著升高，以二氢丹参酮Ⅰ含量升高的最显著，几乎达到了对照株系的200倍；OE-4过表达株系中，以二氢丹参酮Ⅰ和隐丹参酮含量升高的最显著，几乎达到了对照株系的200～300倍；在OE-3过表达株系中，含量升高最显著的的丹参酮ⅡA，达到对照株系的300倍左右，表明丹参酮含量的变化与SmSnRK2.7在毛状根中过表达能力的强弱关系密切，SmSnRK2.7对丹参酮类物质的合成和积累具有正调控作用。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 山东中医药大学

<120> 丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用

<141> 2022-04-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> Salvia miltiorrhiza Bunge.

<400> 1

atggaaagat acgatatttt gaaagatttg ggatctggga attttggtgt ggccaagctt 60

gtgaaggata aatggagcgg tgagctctat gcagttaagt acattgagag aggcaaaaag 120

gcaagatttt tctttcaaca gctgatttct ggagtcagtt attgccattc catgcaaatt 180

tgccatagag atcttaagct tgaaaacaca ttgttagatg ggagccctgc gccccgcctc 240

aagatatgtg acttcggtta ttctaagtca gctgtgttgc attctcaacc taagtcgact 300

gtgggaactc cggcctatat cgcaccggag gtgttatcga ggaaagaata cgacggcaag 360

attgcagatg tttggtcatg tggggttaca ctatatgtga tgctagttgg tgcgtatcca 420

tttgaagatc ctgatgatcc aagaaatttc aagaaaacaa tcaacagaat actcagcgtc 480

cactactcca tccccgacta cgttagagtc tccaaagaat gcaaacatct tttatctcga 540

atatttgttg ccgaccctca aaagagaata agcattccag aaattaagaa gcatccttgg 600

tttctacaga accttccaat agaattcatg gaaggagatg aagctagttt ggagatgaga 660

aacgcagacg actactctac tcaaagtatt gaagaggcat tggctgccat acaagaagct 720

agaagagcat cggacgaccc taaaacgggt tgtccgatgc tccaaggaag catggatctt 780

gatgacatcg atacggacga agatatagat gaggtcgaga caagtgggga ttttgtttgt 840

gcgctatga 849

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> Salvia miltiorrhiza Bunge.

<400> 2

Met Glu Arg Tyr Asp Ile Leu Lys Asp Leu Gly Ser Gly Asn Phe Gly

1 5 10 15

Val Ala Lys Leu Val Lys Asp Lys Trp Ser Gly Glu Leu Tyr Ala Val

20 25 30

Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Lys Lys Ala Arg Phe Phe Phe Gln Gln Leu

35 40 45

Ile Ser Gly Val Ser Tyr Cys His Ser Met Gln Ile Cys His Arg Asp

50 55 60

Leu Lys Leu Glu Asn Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Arg Leu

65 70 75 80

Lys Ile Cys Asp Phe Gly Tyr Ser Lys Ser Ala Val Leu His Ser Gln

85 90 95

Pro Lys Ser Thr Val Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Glu Tyr Asp Gly Lys Ile Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly

115 120 125

Val Thr Leu Tyr Val Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro

130 135 140

Asp Asp Pro Arg Asn Phe Lys Lys Thr Ile Asn Arg Ile Leu Ser Val

145 150 155 160

His Tyr Ser Ile Pro Asp Tyr Val Arg Val Ser Lys Glu Cys Lys His

165 170 175

Leu Leu Ser Arg Ile Phe Val Ala Asp Pro Gln Lys Arg Ile Ser Ile

180 185 190

Pro Glu Ile Lys Lys His Pro Trp Phe Leu Gln Asn Leu Pro Ile Glu

195 200 205

Phe Met Glu Gly Asp Glu Ala Ser Leu Glu Met Arg Asn Ala Asp Asp

210 215 220

Tyr Ser Thr Gln Ser Ile Glu Glu Ala Leu Ala Ala Ile Gln Glu Ala

225 230 235 240

Arg Arg Ala Ser Asp Asp Pro Lys Thr Gly Cys Pro Met Leu Gln Gly

245 250 255

Ser Met Asp Leu Asp Asp Ile Asp Thr Asp Glu Asp Ile Asp Glu Val

260 265 270

Glu Thr Ser Gly Asp Phe Val Cys Ala Leu

275 280

Claims

1.在丹参毛状根中过表达丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用，其特征在于：所述丹参SmSnRK2.7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丹参酮包括隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在丹参毛状根中过表达丹参SmSnRK2.7基因的具体方式为：构建含有丹参SmSnRK2.7基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达丹参SmSnRK2.7基因的阳性毛状根，其丹参酮含量高于野生型毛状根。

3.一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于：构建含有丹参SmSnRK2.7基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达丹参SmSnRK2.7基因的阳性毛状根，其丹参酮含量高于野生型毛状根；所述丹参SmSnRK2.7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丹参酮包括隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。