CN114717257B - SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用 - Google Patents

SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SmHD‑Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用，属于基因工程技术领域。所述SmHD‑Zip12基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述丹参酮为隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA中的至少一种或两种以上。本发明还提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。本发明利用基因工程手段将SmHD‑Zip12基因成功转化到丹参毛状根中，获得SmHD‑Zip12过表达毛状根，通过研究发现，该基因可以提高丹参酮的生物合成。本发明对加速选育丹参酮高产的丹参新品种具有重要的产业价值。

Description

SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用
技术领域
本发明涉及SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效，主要用于心脑血管疾病的治疗，是临床常用的活血化瘀药。
次生代谢产物丹参酮是丹参中的主要活性成分之一，属于二萜醌类化合物，主要包括隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。丹参酮的产量较低，通过转录因子同时调控次生代谢产物合成路径的多个关键酶基因以提高次生代谢产物的含量是当前的研究热点。
同源异型域-亮氨酸拉链Ⅰ(HD-ZipⅠ)亚家族蛋白是一类存在于植物中的转录因子，可调节植物生长发育，响应干旱等非生物胁迫反应，属于HD-Zip家族，包含同源结构域(HD)，HD羧基末端有一个亮氨酸拉链基序(LZ)，二者紧密相连，前者与DNA特异性结合，后者介导蛋白质二聚体的形成。HD-ZipⅠ亚家族基因相关成员可参与ABA信号转导，响应干旱等非生物胁迫，并能提高植物抗逆性。目前尚未见到关于HD-ZipⅠ转录因子调控丹参酮类成分的合成的研究报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了SmHD-Zip12基因的一种新用途——在提高丹参酮含量中的应用。本发明还提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。本发明利用基因工程手段，通过农杆菌介导遗传转化的方法将SmHD-Zip12基因成功转化到丹参毛状根中，获得SmHD-Zip12过表达毛状根，通过研究发现，该基因可以提高丹参酮类成分的生物合成，为提升丹参品质提供可用的基因资源，对加速选育丹参酮高产的丹参新品种具有重要的产业价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用，所述SmHD-Zip12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述丹参酮为隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA中的至少一种或两种以上。
进一步地，具体应用时，在丹参毛状根中过表达SmHD-Zip12基因，以提高丹参毛状根中丹参酮的含量。
进一步地，在丹参毛状根中过表达SmHD-Zip12基因的具体方式可以为：构建含有SmHD-Zip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达SmHD-Zip12基因的阳性毛状根。
一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，包括以下步骤：构建含有SmHD-Zip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达SmHD-Zip12基因的阳性毛状根，其丹参酮含量高于野生型毛状根。
本发明基于丹参基因组数据及响应非生物胁迫表达分析筛选出可能调控丹参酮类成分合成的HD-ZipⅠ家族成员SmHD-Zip12基因，构建了含有SmHD-Zip12基因片段的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，获得SmHD-Zip12基因过表达阳性毛状根。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测SmHD-Zip12基因过表达阳性毛状根中丹参酮合成路径关键酶基因的表达水平，利用高效液相色谱法检测SmHD-Zip12基因过表达阳性毛状根中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量。结果表明，SmHD-Zip12基因对丹参酮类成分的合成与积累具有正调控作用，过表达SmHD-Zip12基因可有效提高丹参酮类成分的含量。
本发明综合利用载体构建、高效液相色谱法等技术，发现了SmHD-Zip12基因调控丹参酮含量的用途，提供了一种利用SmHD-Zip12基因提高丹参毛状根中丹参酮的方法，对培育有效成分含量高的丹参新种质具有重要的理论价值，对保障丹参质量具有重要的产业意义。
附图说明
图1：载体pMDC202的结构图谱。
图2：载体pMDC202酶切后的电泳检测结构示意图，其中，M：DL 15000；1～2：酶切的pMDC202载体。
图3：SmHD-Zip12基因PCR扩增后的电泳检测结构示意图，其中，M：DL 2000；1～6：SmHD-Zip12基因的PCR产物。
图4：重组质粒转化农杆菌鉴定的电泳检测结果示意图，其中，M：DL2000；1～5：农杆菌菌液的PCR产物。
图5：毛状根的电泳检测结果示意图，其中，M：DL 2000；1：野生型毛状根；2：空载型毛状根；3～10：过表达毛状根。
图6：毛状根的电泳检测结果示意图，其中，M：DL 2000；N1：H2O；N2：野生型毛状根；PC：载体质粒；1～17：过表达毛状根。
图7：丹参酮合成路径关键酶基因SmAACT的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图8：丹参酮合成路径关键酶基因SmCPS1的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图9：丹参酮合成路径关键酶基因SmCPS2的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图10：丹参酮合成路径关键酶基因SmCYP76AH1的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图11：丹参酮合成路径关键酶基因SmCYP76AH3的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图12：丹参酮合成路径关键酶基因SmCYP76AK1的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图13：丹参酮合成路径关键酶基因SmDXS的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图14：丹参酮合成路径关键酶基因SmGGPPS的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图15：丹参酮合成路径关键酶基因SmIDS的表达分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图16：丹参毛状根丹参酮成分——隐丹参酮的含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图17：丹参毛状根丹参酮成分——二氢丹参酮Ⅰ的含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图18：丹参毛状根丹参酮成分——丹参酮Ⅰ的含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图19：丹参毛状根丹参酮成分——丹参酮ⅡA的含量分析示意图，其中，WT：野生型毛状根；EV：空载型毛状根；OE1、OE2、OE3、OE4分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4；*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1pMDC202-SmHD-Zip12过表达载体的构建及转化
(1)线性化载体的制备
载体pMDC202的图谱如图1所示。使用XbaⅠ和KpnⅠ酶切载体pMDC202，酶切体系为：10×FastDigest Green Buffer，2μL；XbaⅠ，1μL；KpnⅠ，1μL；质粒DNA，2μL；ddH2O，14μL；共20μL。金属浴37℃反应1小时。酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。由图可知，用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切后有特异性目的条带出现。利用诺唯赞公司胶回收试剂盒，回收目的载体大片段，得线性化载体。
(2)目的片段PCR扩增
以继代培养的丹参无菌苗作为实验材料，利用诺唯赞公司RNA提取试剂盒提取总RNA，Takara反转录酶反转获得cDNA，根据SmHD-Zip12基因编码区序列设计引物SmHD-Zip12-F和SmHD-Zip12-R，进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2×Phanta Max Buffer a，25μL；dNTP Mix(10mmol/L each)，1μL；SmHD-Zip12-F(10μmol/L)，2μL；SmHD-Zip12-R(10μmol/L)，2μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1μL；cDNA，2μL；ddH2O，17μL；共50μL。扩增程序为：95℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min，4℃恒温保存。PCR扩增后，1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，结果如果图3所示。由图可知，PCR扩增得到的目的片段的大小显示在500～750bp之间，与SmHD-Zip12基因的大小相符。利用诺唯赞公司胶回收试剂盒回收目的片段。
引物的核苷酸序列如下所示：
SmHD-Zip12-F：5’-GAGGACCTCGACTCTAGAATGTCTACCAGTATTAAGAAGGGCACCA-3’；
SmHD-Zip12-R：5’-CATTTTTTCTACCGGTACCCTAGAAGTCCCACCACTGCGCA-3’。
(3)同源重组
于冰上配制同源重组反应体系：线性化载体，2μL；目的片段，1μL；5×CE IIBuffer，4μL；ExnaseⅡ，2μL；ddH2O，11μL；共20μL。使用移液器轻轻吸打混匀反应液，短暂离心将反应液收集至管底，37℃反应30min；立即置于冰上冷却，得重组产物。
(4)重组产物转化
取10μL重组产物，加入到100μL的DH5α大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min；42℃水浴热激45s，立即置于冰上冷却3min；加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm摇菌1小时；5000rpm离心5min，弃掉900μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16小时。
(5)重组产物鉴定
挑取单克隆菌落，加入含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，震荡培养4小时，进行菌液PCR验证，验证为阳性的菌落送去基因公司测序。测序成功后，保存菌液，并利用天根试剂盒提取重组质粒，成功得到pMDC202-SmHD-Zip12质粒。
(6)重组质粒转化Ar.Qual发根农杆菌
100μL的Ar.Qual发根农杆菌加入5μL的pMDC202-SmHD-Zip12质粒，用枪吹吸混匀；依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。拿出，加入700μL无抗生素的YEB液体培养基，于28℃振荡培养2小时。6000rpm离心1min，弃掉700μL上清，轻轻吹打重悬菌块，涂布于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养3天。挑取单菌落，接种于7.5mL的YEB液体培养基中，28℃、200rpm培养12小时，通过菌落PCR方法鉴定阳性克隆，电泳检测的结果如图4所示。由图可知，1％琼脂糖凝胶电泳显示条带大小与预期一致，说明重组质粒转入了Ar.Qual发根农杆菌。
挑选单菌落，接种至YEB液体培养基中，28℃振荡培养2小时，得转化pMDC202-SmHD-Zip12的农杆菌菌液，用于下述实施例2。
同时，使用载体pMDC202转化Ar.Qual发根农杆菌，转化及培养方法同上，得空载质粒pMDC202的重组工程菌，接种至YEB液体培养基中，28℃振荡培养2小时，得空载pMDC202的农杆菌菌液，用于下述实施例2。
实施例2丹参毛状根的诱导
吸取转化pMDC202-SmHD-Zip12的农杆菌菌液、空载pMDC202的农杆菌菌液各750μL，分别加入到75mL的含50mg/mL链霉素和50mg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃、200rpm摇至OD600(在600nm波长处的吸光值)为0.6，得活化菌液。同时，挑取不含任何外源质粒的Ar.Qual单菌落，接入不含抗生素的YEB液体培养基中活化，用于诱导野生型毛状根。
上述活化的三种菌液，分别转移至50mL离心管，4000rpm离心10min，弃上清；用50mL的MS液体培养基重悬菌体，加入400μmol/L乙酰丁香酮，转移至锥形瓶中，200rpm，28℃培养30min；选取继代30天左右长势良好的丹参无菌苗叶片，将叶片剪成0.5cm2，转入锥形瓶中，200rpm，28℃侵染10min；在超净工作台中用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，转移至含200μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，置于暗环境下共培养3天；无菌水冲洗5遍，用无菌滤纸吸干后，接种于含500mg/L头孢噻肟钠和200μmol/L乙酰丁香酮的MS分化培养基；待毛状根长出3cm以上后，分离单根系，每7天更换一次培养基，并逐渐降低头孢噻肟钠浓度，最终转移至无抗生素的MS培养基上培养；在MS固体培养基上培养1个月后无细菌生长，转移至50mL的6,7-V培养基中，25℃、120rpm暗环境下扩大培养，得到丹参毛状根，其中，利用转化pMDC202-SmHD-Zip12的农杆菌菌液培养得到的毛状根为过表达毛状根(OE)，利用空载pMDC202的农杆菌菌液培养得到的毛状根为空载型毛状根(EV)，利用不含外源质粒的农杆菌菌液培养得到的毛状根为野生型毛状根(WT)。
实施例3过表达SmHD-Zip12毛状根阳性株系的鉴定
根据载体中包含的35S启动子，设计上游引物35S-F，根据SmHD-Zip 12基因编码序列，设计下游引物SmHD-Zip 12-R，选择RolB的F和R作为内参，进行PCR检测。
引物的核苷酸序列如下所示：
35S-F：5'-GAGCACGACACACTTGTCTACT-3'。
SmHD-Zip12-R：5'-CTGCGCAGTACCACCAGTATT-3'。
rolB-F：5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'。
rolB-R：5'-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'。
取实施例2中培养得到的丹参毛状根，提取DNA。以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR mix，10μL；上游引物(10μmol/L)，0.5μL；下游引物(10μmol/L)，0.5μL；DNA，2μL；ddH2O补足至20μL。
扩增程序为：95℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min，4℃恒温保存。
对PCR产物进行电泳检测。利用rolB-F和rolB-R引物判断毛状根是否为Ar.Qual发根农杆菌诱导的丹参毛状根，结果如图5所示，WT、EV和OE株系均有条带，PCR产物大小在250～500bp之间，与目的条带大小一致(423bp)。利用35S-F和SmHD-Zip12-R判断SmHD-Zip12过表达阳性毛状根，结果如图6所示，共分离得到了17个pMDC202-SmHD-Zip12单根系，其中有12个为阳性株系，阳性率为70.5％，随机选取4个阳性株系进行下一步实验，重新编号为过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4。
实施例4丹参酮合成路径关键酶基因表达分析
利用qRT-PCR检测丹参酮合成路径关键酶基因SmAACT、SmCPS1、SmCPS2、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、SmDXS、SmGGPPS、SmIDS在过表达毛状根(过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4)、空载型毛状根(EV)和野生型毛状根(WT)中的表达水平，以β-actin作为内参基因。
qRT-PCR检测所采用的引物如表1所示。反应体系为：TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)，12.5μL；正向引物(10μmol/L)，1μL；反向引物(10μmol/L)，1μL；cDNA模板，2μL；RNase-free ddH2O，8.5μL；共20μL。
表1
Figure BDA0003616746040000071
Figure BDA0003616746040000081
qRT-PCR反应条件如下：预变性95℃，30s；变性95℃，10s，退火55℃，30s，延伸72℃，1min，40个循环。
结果如图7～图15所示，野生型毛状根和空载型毛状根中关键酶基因的表达量无显著性差异，说明空载体对丹参酮合成路径关键酶基因变化没有影响，在过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中，关键酶基因的表达水平相比于WT显著升高，其中关键酶基因表达量最高的是株系OE2。SmGGPPS基因在株系OE2中表达量是WT型的25.7倍，SmCYP76AH3基因在株系OE2中表达量是WT型的14.9倍，SmDXS基因在株系OE2中表达量是WT型的8.4倍，SmCYP76AK1基因在株系OE2中表达量是WT型的7.6倍，SmCPS2基因在株系OE2中表达量是WT型的7.0倍，SmAACT、SmCPS1、SmCYP76AH1基因在株系OE2中表达量为WT型的3.5～4.3倍，SmIDS基因在株系OE2中表达量为WT型的2.6倍。由此可见，SmHD-Zip12基因过表达可以提高丹参酮合成路径关键酶基因的表达，尤其是促进了SmGGPPS基因和SmCYP76AH3基因的表达。
实施例5丹参酮类成含量测定
(1)标准曲线的制定
精密称取二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA标准品，用甲醇配置成浓度为1mg/mL的母液，分别稀释成浓度为0.5、0.8、1、5、8、100μg/mL的混合标准溶液，进行高效液相色谱分析，记录4种标准品的峰面积。以各标准品溶液的浓度(X)和峰面积(Y)为横、纵坐标，绘制4种丹参酮类成分的标准曲线。
(2)丹参酮类成分的提取和HPLC含量测定
将同一转化周期的SmHD-Zip12过表达毛状根(实施例4中的过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4)、空载型毛状根和野生型毛状根置于6,7-V液体培养基中培养，待生长30天后取出，液氮速冻放于-80℃用于高效液相色谱分析。样品分析前毛状根材料经冷冻干燥48h，研磨成粉末，过40目筛。精密称取0.25g，置于50mL离心管中，加入25mL甲醇，涡旋振荡，100W，100Hz，50℃，超声50min，4000rpm离心10min，吸取上清过0.22μm有机滤膜，利用高效液相仪检测丹参酮类成分。
(3)色谱条件
色谱柱DIamonsIl C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，理论塔板数按丹参酮ⅡA计。0.01％磷酸(A)-乙腈(C)为流动相，流动相洗脱梯度见表2；检测波长270nm；体积流量1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL。
表2
Figure BDA0003616746040000091
利用HPLC检测毛状根中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量，结果如图16、图17、图18、图19所示，WT和EV中丹参酮类成分含量无显著性差异，说明空载体对丹参酮类成分含量变化没有影响，在过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中丹参酮类成分的含量相比WT显著升高，其中丹参酮类成分含量最高的是株系OE2，这与关键酶基因表达情况一致。
WT中隐丹参酮的含量为52.4μg/g，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中隐丹参酮的含量分别为115.0μg/g、306.0μg/g、90.5μg/g、96.9μg/g，与WT中隐丹参酮含量相比，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中隐丹参酮含量具有显著差异，分别是WT的2.2倍、5.8倍、1.7倍、1.9倍。
WT中二氢丹参酮Ⅰ的含量为52.3μg/g，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中二氢丹参酮Ⅰ的含量分别为56.1μg/g、181.0μg/g、69.7μg/g、81.2μg/g，与WT中隐丹参酮含量相比，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中二氢丹参酮Ⅰ含量具有显著差异，分别是WT的1.1倍、3.5倍、1.3倍、1.6倍。
WT中丹参酮Ⅰ的含量为138.0μg/g，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中丹参酮Ⅰ的含量分别为209.1μg/g、514.7μg/g、277.1μg/g、316.2μg/g，与WT中隐丹参酮含量相比，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中丹参酮Ⅰ含量具有显著差异，分别是WT的1.5倍、2.7倍、2.0倍、2.3倍。
WT中丹参酮IIA的含量为23.9μg/g，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中丹参酮ⅡA的含量分别为153.2μg/g、365.3μg/g、180.9μg/g、151.6μg/g，与WT中隐丹参酮含量相比，过表达株系OE1、OE2、OE3、OE4中丹参酮ⅡA含量具有显著差异，分别是WT的6.4倍、15.3倍、7.6倍、6.4倍。
以上结果表明，SmHD-Zip12基因过表达可显著提高毛状根中丹参酮类成分的含量，尤其是促进丹参酮ⅡA含量的增加。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 山东中医药大学
<120> SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用
<141> 2022-04-26
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> Salvia miltiorrhiza Bunge
<400> 1
atgtctacca gtattaagaa gggcaccaaa aactctagaa gaaaaagatt tagcgatgat 60
caaatcaagt ctctggagac gatgttcgag acagaggcta gaccggagct acacctcaaa 120
cagcacctag ctaacaagct tgggctgcag ccacggcaga tcgccatatg gttccagaac 180
aagagggcta gatcaaagtc caagcaaatt gagcaggaat acagcgtgct taagtccaac 240
tacgataact tagctctaca gtttgaggca ttgaggaagg agaatcaaac attgcttgtc 300
caggtgcaga aactcagaaa gatggcggat aacaaggatt gtgaggaaaa tgacaagaat 360
caaatcaaac tggcagcttc tgaaatcccg agattgctac tagacattag cggcgatgag 420
ctatgcatgc cattgtgcag cgaactgaac ggaagagaag attacctgga ggaagaggcc 480
gatgttctga atatggctca gattgctgaa agttccttag catcacctga aaacggatgc 540
agcttagaat cttgtacatt tcttgataat actggtggta ctgcgcagtg gtgggacttc 600
tag 603
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> Salvia miltiorrhiza Bunge
<400> 2
Met Ser Thr Ser Ile Lys Lys Gly Thr Lys Asn Ser Arg Arg Lys Arg
1 5 10 15
Phe Ser Asp Asp Gln Ile Lys Ser Leu Glu Thr Met Phe Glu Thr Glu
20 25 30
Ala Arg Pro Glu Leu His Leu Lys Gln His Leu Ala Asn Lys Leu Gly
35 40 45
Leu Gln Pro Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Arg
50 55 60
Ser Lys Ser Lys Gln Ile Glu Gln Glu Tyr Ser Val Leu Lys Ser Asn
65 70 75 80
Tyr Asp Asn Leu Ala Leu Gln Phe Glu Ala Leu Arg Lys Glu Asn Gln
85 90 95
Thr Leu Leu Val Gln Val Gln Lys Leu Arg Lys Met Ala Asp Asn Lys
100 105 110
Asp Cys Glu Glu Asn Asp Lys Asn Gln Ile Lys Leu Ala Ala Ser Glu
115 120 125
Ile Pro Arg Leu Leu Leu Asp Ile Ser Gly Asp Glu Leu Cys Met Pro
130 135 140
Leu Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg Glu Asp Tyr Leu Glu Glu Glu Ala
145 150 155 160
Asp Val Leu Asn Met Ala Gln Ile Ala Glu Ser Ser Leu Ala Ser Pro
165 170 175
Glu Asn Gly Cys Ser Leu Glu Ser Cys Thr Phe Leu Asp Asn Thr Gly
180 185 190
Gly Thr Ala Gln Trp Trp Asp Phe
195 200

Claims (6)

1.SmHD-Zip12基因在提高丹参酮含量中的应用，所述SmHD-Zip12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述丹参酮为隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA中的至少一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在丹参毛状根中过表达SmHD-Zip12基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在丹参毛状根中过表达SmHD-Zip12基因的具体方式为：构建含有SmHD-Zip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达mHD-Zip12基因的阳性毛状根。
5.一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于：构建含有SmHD-Zip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达mHD-Zip12基因的阳性毛状根；所述SmHD-Zip12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于：所述丹参酮为隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA中的至少一种或两种以上。
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