CN104805092A - 小麦TaSPL3基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了小麦TaSPL3基因及其应用，属于作物分子生物学领域。本发明设计特异性引物从中国春小麦叶的cDNA中克隆TaSPL3的编码区序列，利用缺体四体将TaSPL3定位在小麦第六同源群上，TaSPL3基因编码区序列在A、B、D同源染色体中的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。本发明通过将TaSPL3基因上miR156的靶位点突变，使miR156无法识别位点，miR156的靶位点突变后的TaSPL3基因转化拟南芥，该基因能够使拟南芥早花、叶片增大、生物量增加。

Description

小麦TaSPL3基因及其应用

技术领域

本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及小麦TaSPL3基因及其在染色体中的定位、以及该基因miR156靶位点突变后的应用。

背景技术

小麦作为一种重要的粮食作物，全世界有35％-40％的以小麦为主要粮食。同时作为三大谷物之一，产量几乎全做食用，是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物。随着水稻、玉米等在内的多种植物全基因组测序的完成，人类开始进入功能基因的时代。利用物种已知功能的目标基因进行序列比对和分析，利用高保守序列对研究物种进行引物设计和同源序列克隆，是发现新基因的常用方法之一。

SPL(squamosa promoter binding protein-like)是一类植物特有的转录因子,在调控植物生长和生殖阶段转变、花和果实发育、光信号转导及植株形态建成等多种发育过程中发挥重要作用。SPL含有一个由80个氨基酸残基组成的高度保守的SBP结构域,以此同下游靶基因启动子区域结合,调控靶基因的表达。大多数SPL均具有miR156/157识别位点,miR156/157可以通过靶mRNA剪切或翻译抑制来调控SPL的表达。

目前，在水稻中，对SPL基因有了比较详尽的认识。小麦作为人类重要的粮食作物，但是关于SPL基因家族在小麦中结构和功能分析还是知之甚少。对该基因在小麦的生物功能和分子基础尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供小麦TaSPL3基因及其应用。

利用水稻SPL基因保守的SBP结构域和小麦二倍体AA、DD基因草图测序结果，先在二倍体中克隆SPL基因，利用二倍体与六倍体的同源性，然后以普通小麦中国春叶片cDNA为模板利用PCR方法扩增得到在A、B、D同源染色体上的基因序列，分别如SEQ ID NO.1-3所示，该基因命名为TaSPL3。该基因定位于第六染色体同源群上。

本发明提供了小麦TaSPL3基因在小麦育种中的应用。

本发明提供了小麦TaSPL3基因在促进植物生长中的应用。

本发明提供了小麦TaSPL3基因在制备转基因植物中的应用。

具体地，本发明所述的小麦TaSPL3基因位于小麦第六同源群上，其在小麦6A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦6B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦6D同源染色体的序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明提供了用于克隆小麦TaSPL3基因的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

本发明提供了上述引物组合在小麦遗传育种中的应用。

含有上述引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。

相应地，本发明提供了小麦TaSPL3基因的克隆方法，利用SEQ IDNO.4-5所示的特异性引物组合，以小麦叶cDNA为模板，PCR扩增得到小麦TaSPL3基因。

进一步，本发明还提供了检测小麦TaSPL3基因的SNP分子标记，检测小麦TaSPL3A基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：

SPL3A-F-primer CGGCAGCGGCAGCGGCAA

SPL3A-R-primer CCTATCAGTGTTTTTGACGG；

检测小麦TaSPL3B基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：

SPL3B-F-primer ATTCTTCTGGCGGCAGTG

SPL3B-R-primer CAACTTTACCCAACTCAGGG；

检测小麦TaSPL3D基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：

SPL3D-F-primer TCCATTCTTCTGGCGGTAG

SPL3D-R-primer AACTTTACCCAGCTCGGTG。

本发明提供了上述SNP分子标记在检测小麦TaSPL3基因中的应用。

进一步地，利用上述检测小麦TaSPL3基因的SNP分子标记的引物对扩增待测样品，若得到的目的条带为1.3kb，则意味着待测样品中存在TaSPL3基因。

本发明还提供了miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因，小麦TaSPL3基因突变后的miR156靶位点的核苷酸序列为CAU GCA CUG UCG CUCUUG UCU，如SEQ ID NO.12所示。

进一步地，本发明提供了一种使小麦TaSPL3A基因的miR156靶位点突变的方法，包括以下步骤：

(1)以SPL3A-OE-F和m3A-R为引物，SPL3A的PCR产物为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(2)以m3A-F和SPL3A-OE-R为引物，SPL3A的PCR产物为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(3)将前述两次PCR的产物回收后等量混匀，以此为模板，以SPL3A-OE-F和SPL3A-OE-R为引物，再进行PCR，扩增产物即为miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因；所述m3A-F、m3A-R和SPL3A-OE-F、SPL3A-OE-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-16所示；

所述SPL3A的PCR产物是以SEQ ID NO.4-5的序列为引物PCR扩增小麦基因组cDNA得到的。

miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)以SPL3A-OE-F和m3A-R为引物，SPL3A的PCR产物为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(2)以m3A-F和SPL3A-OE-R为引物，SPL3A的PCR产物为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(3)将前述两次PCR的产物回收后等量混匀，以此为模板，以SPL3A-OE-F和SPL3A-OE-R为引物，再进行PCR，扩增产物即为miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因；所述m3A-F、m3A-R和SPL3A-OE-F、SPL3A-OE-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-16所示；

所述SPL3A的PCR产物是以SEQ ID NO.4-5的序列为引物PCR扩增小麦基因组cDNA得到的。

本发明提供了miR156靶位点突变的小麦TaSPL3A基因或TaSPL3B基因或TaSPL3D基因在制备转基因植物中的应用，所述的miR156靶位点突变后的序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提供了miR156靶位点突变的小麦TaSPL3A基因或TaSPL3B基因或TaSPL3D基因在促进植物生长中的应用。

具体地，本发明提供了miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因在促进植物早花或叶片增大或增加植物生物量中的应用。更具体地，本发明提供了miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因在促进转基因拟南芥开花提前，叶片增大，生物量增加，植株的鲜重增加中的应用。

本发明提供了小麦TaSPL3基因的克隆方法、染色体定位以及miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因在促进植物早花或叶片增大或增加植物生物量中的生物学功能，本发明的小麦TaSPL3基因可广泛应用于小麦遗传育种、种质资源改良和培育转TaSPL3基因的植物领域，对改进和改良小麦等作物的种质资源具有重要作用。

附图说明

图1为TaSPL3基因在小麦染色体中定位图，1-7分别表示N6A-T6B，N6A-T6D，N6B-T6A，N6B-T6D，N6D-T6A，N6D-T6B,CS是中国春对照。

图2为TaSPL3A基因的转录激活图。PBD是指载体里有可以与其他基因结合的结构域，PBD-TaSPL3A指将TaSPL3A基因的编码序列与带有结合结构域的载体相连接)，1为-Trp，即缺色氨酸的SD固体缺素培养基，2为-Trp/-His，即缺色氨酸和组氨酸的SD固体缺素培养基、3为-Trp/-His/-Ade，即缺色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的SD固体缺素培养基。

图3为小麦TaSPL3的miR156靶位点突变图，图中*表示该处的碱基有变化。

图4为拟南芥野生型、转TaSPL3基因的拟南芥、转miR156靶位点突变的TaSPL3基因的拟南芥的植株在20d、30d的生长情况图，1表示拟南芥野生型Col-0，2表示转miR156靶位点突变的TaSPL3A过表达拟南芥植株。

图5为拟南芥野生型Col-0、转miR156靶位点突变的TaSPL3A过表达的拟南芥的植株鲜重比较图，L1-L4表示4个不同的重复组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 小麦TaSPL3基因的克隆

1、小麦叶片总RNA的提取

中国春小麦(Triticum aestivum L.)叶片总RNA的提取，使用PlantRNeasy Kit(Qiagen)。

2、TaSPL3基因cDNA第一片段的合成

按照反转录酶M-MLV(TaKaRa)的操作说明进行。

3、从中国春小麦(Triticum aestivum L.)叶的cDNA中克隆TaSPL3的编码区序列；正向、反向引物序列如SEQ ID NO.4-5所示。

PCR程序：94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；重复35次；72℃，10分钟。

PCR体系：

PCR产物回收纯化后按照北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1Simple Cloning Kit克隆连接到pEASY-T1Simple载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得TaSPL3。对获得的3条片段送测序公司测序后，与二倍体克隆的SPL3比较，确定TaSPL3基因在A、B、D同源染色体序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。

实施例2 小麦TaSPL3基因的染色体定位

根据实施例1获得的TaSPL3基因在A、B、D同源染色体序列，经过对比分析，发现三者核苷酸序列存在多态性。设计3对特异性引物，以中国春缺体四体的DNA为模板，进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳定位TaSPL3基因在染色体中的位置。

所述3对特异性引物为：

检测小麦TaSPL3A基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：

SPL3A-F-primer CGGCAGCGGCAGCGGCAA

SPL3A-R-primer CCTATCAGTGTTTTTGACGG；

检测小麦TaSPL3B基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：

SPL3B-F-primer ATTCTTCTGGCGGCAGTG

SPL3B-R-primer CAACTTTACCCAACTCAGGG；

检测小麦TaSPL3D基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：

SPL3D-F-primer TCCATTCTTCTGGCGGTAG

SPL3D-R-primer AACTTTACCCAGCTCGGTG。

利用上述检测小麦TaSPL3基因的SNP分子标记的3个引物对中任一对引物PCR扩增小麦基因组DNA，均可扩增得到1.3kb的目的条带。在检测时，若待测产物经上述引物对PCR扩增后，得到的目的条带为1.3kb，则意味着待测样品中存在TaSPL3基因。

六倍体小麦(基因型AABBDD)有缺四体材料，是利用染色体替换形成的，N6A-T6B是指缺6A补6B，相当于用6B染色体代替6A染色体(基因型为BBBBDD),同理N6A-T6D(基因型DDBBDD)，N6B-T6A(基因型AAAADD),N6B-T6D(基因型AADDDD),N6D-T6A(基因型AABBAA),N6D-T6B(基因型AABBBB)，TaSPL3A在N6A-T6B和N6A-T6D中扩不出来，在其他缺四体材料中可以扩出来，TaSPL3B和TaSPL3D同理。

实施例3 小麦TaSPL3基因在酵母中的转录激活实验

1、酵母AH109感受态制备(最好现用现配)

酵母AH109在YPDA固体培养基上划线，然后挑取单克隆在1mlYPDA混匀，再转移至50ml YPDA中，30℃，220rpm摇菌16～18h，至OD₆₀₀>1.5。取30ml摇的菌至300ml YPDA中，检测OD₆₀₀，调节OD₆₀₀在0.2-0.3之间。然后在30℃，200rpm摇菌3h，至OD₆₀₀在0.4-0.6之间(若OD₆₀₀<0.4，即有错误)。将菌液倒入两个50ml离心管中，室温1000g离心5min。弃上清，用30ml dd H₂O彻底重悬沉淀物(终体积25–50ml)。室温1000g离心5min，弃上清。用1ml无菌1×TE/1×LiAc溶液重悬菌体，分装1.5ml离心管，每管100μl置于-80℃保存备用。

2酵母转化

取100μl酵母感受态在冰上，加入5μl载体质粒(pEASY-T1Simple载体与基因TaSPL3A连接后阳性克隆的质粒)(大概1μg)和5μl pBD载体(未连接TaSPL3A的用于作对照)，轻弹混匀。加入600μl无菌的1×PEG/LiAc溶液，轻弹混匀10s。30℃，200rpm摇菌30min。加入70μlDMSO，轻轻的温和颠倒混匀(不能涡旋)。42℃水浴热激15min，然后立即在冰上放置2min。室温10000rpm离心15s，弃上清。用1ml YPD重悬菌体，然后30℃，200rpm摇菌90min。室温14000rpm离心5s，弃上清。用1ml 0.9％NaCl重悬菌体，取200μl倒入SD固体缺素培养基【-Trp(缺色氨酸)，-Trp/-His(缺色氨酸和组氨酸)、-Trp/-His/-Ade(缺色氨酸、组氨酸和腺嘌呤)】中30℃倒置培养筛选。结果说明TaSPL3A具有转录因子的转录激活作用。

实施例4 小麦TaSPL3的miR156靶位点突变

根据TaSPL3A上的miR156靶位点设计以下引物

m3A-F:

GCCCCGGATCTTCAGCATGCACTGTCGCTCTTGTCTAGCAACCCAGTGGGTGCT(SEQ ID NO.13)

m3A-R:

AGCACCCACTGGGTTGCTAGACAAGAGCGACAGTGCATGCTGAAGATCCGGGGC(SEQ ID NO.14)

(下划线部分为改变miR156的靶位点，但不改变编码的氨基酸序列)

SPL3A-OE-F ATTAggtaccATGGGGAACGAACCGCTC(SEQ ID NO.15)

SPL3A-OE-R AGTCtctagaTCAGTGCATCCGGTCGAA(SEQ ID NO.16)进行两次PCR反应：DNA模板为pEASY-T1Simple载体与基因TaSPL3A连接后阳性克隆的质粒。

PCR反应1：

PCR反应2：

两次PCR的产物进行回收后等量混匀，再进行一次PCR反应：

PCR反应3：

PCR产物回收后，测序进行验证，得到miR156靶位点突变了的TaSPL3A基因。验证结果见图3。

上述方法同样适用于TaSPL3B基因、TaSPL3D基因的miR156靶位点突变，结果与TaSPL3A基因的相同，得到miR156靶位点突变了的TaSPL3B基因、TaSPL3D基因，序列均如SEQ ID NO.12所示。

实施例5 小麦TaSPL3转化拟南芥

渗透液(200ml)：MS 0.44g,蔗糖10g,KOH调PH至6.0,120℃灭菌20min。拟南芥转化，取保存的含有过量表达载体(pCAM2300载体与TaSPL3A的连接)的农杆菌于含有卡那霉素的LB培养基上划线，挑单克隆于液体培养基(普通LB液体培养基含浓度50ug/mL的卡那霉素)中培养3至4个小时后。利用PCR检测阳性克隆【利用SPL3A-OE-F和pCAM2300载体上的一段序列(GAAACCGGCGGTAAGGAT)作为检测引物】，阳性克隆菌株移至普通LB液体培养基中，培养至菌液OD600达到1.5以上。转移至离心管中，6000rpm，室温离心5min，弃上清，用渗透液清晰沉淀表面后悬浮，最终悬浮液的OD600应在1.5左右，加0.05％的silwetl 77。采用浸花法转化拟南芥。侵染完毕后用保鲜袋套住植株，黑暗放置24小时，然后取出，置于正常生长条件下培养。

拟南芥转化实验，结果见图4、5，显示SPL3能使拟南芥早花、叶片增大、生物量增加。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.小麦TaSPL3基因在小麦育种中的应用，其特征在于，小麦TaSPL3基因位于小麦第六同源群上，其在小麦6A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦6B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦6D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.小麦TaSPL3基因在促进植物生长中的应用，其特征在于，小麦TaSPL3基因位于小麦第六同源群上，其在小麦6A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦6B同源染色体的序列如SEQ IDNO.2所示，其在小麦6D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.用于克隆小麦TaSPL3基因的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

4.权利要求3所述的引物组合在小麦遗传育种中的应用。

5.小麦TaSPL3基因的克隆方法，其特征在于，利用一对特异性引物组合，以小麦叶cDNA为模板，PCR扩增得到小麦TaSPL3基因，所述特异性引物组合核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

6.miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因，其特征在于，小麦TaSPL3基因中突变后的miR156靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

7.一种使小麦TaSPL3A基因的miR156靶位点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以SPL3A-OE-F和m3A-R为引物，SPL3A的PCR产物为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(2)以m3A-F和SPL3A-OE-R为引物，SPL3A的PCR产物为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(3)将前述两次PCR的产物回收后等量混匀，以此为模板，以SPL3A-OE-F和SPL3A-OE-R为引物，再进行PCR，扩增产物即为miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因；

所述m3A-F、m3A-R和SPL3A-OE-F、SPL3A-OE-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-16所示；

所述SPL3A的PCR产物是以SEQ ID NO.4-5的序列为引物PCR扩增小麦基因组cDNA得到的。

8.权利要求6所述的miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因在制备转基因植物中的应用。

9.权利要求6所述的miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因在促进植物生长中的应用。

10.权利要求6所述的miR156靶位点突变的小麦TaSPL3基因在小麦遗传育种中的应用。