CN108570471A

CN108570471A - 佛甲草耐盐基因sleipp及其应用

Info

Publication number: CN108570471A
Application number: CN201710142635.9A
Authority: CN
Inventors: 王洁华; 万红双; 杨少辉; 宋英今
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2018-09-25

Abstract

本发明公开了佛甲草耐盐基因SLEIPP及其应用，佛甲草耐盐基因SLEIPP是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，实验证明，佛甲草耐盐基因SLEIPP增强拟南芥或杨树耐盐性能。能使包括拟南芥、杨树在内的宿主植物具有较好的抗盐能力。

Description

佛甲草耐盐基因SLEIPP及其应用

技术领域

本发明涉及一种佛甲草(Sedum lineare Thunb)耐盐基因及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

土壤盐分不仅是制约作物生长的主要因素，还会严重影响着农业及林业的发展，同时盐分过高还可造成盐碱地，限制土壤的利用。因此通过培育耐作物新品种，减轻盐胁迫对农业及林业产生的影响，利用大面积盐渍化、荒漠化土地和以及丰富的咸水资源发展农业及林业，是未来农业及林业面临的重要问题，具有非常重要的战略意义和巨大的潜在经济价值。近年来随着分子遗传学和植物转基因技术的发展，利用生物技术提高作物的耐盐性，使作物在盐胁迫环境中能正常生长并提高作物的产量，正受到越来越多的关注。因此，利用基因工程分离出有效的抗盐基因来培育优质的抗盐品种尤为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种佛甲草耐盐基因。

本发明的第二个目的是提供含有佛甲草耐盐基因的克隆载体。

本发明的第三个目的是提供含有上述克隆载体的宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供含有佛甲草耐盐基因的表达载体。

本发明的第五个目的是提供含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明的第六个目的是提供佛甲草耐盐基因增强拟南芥或杨树耐盐性能的用途。

本发明的技术方案概述如下：

佛甲草耐盐基因SLEIPP，是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含佛甲草耐盐基因SLEIPP的克隆载体pJET1.2_SLEIPP。

含有克隆载体pJET1.2_SLEIPP的宿主细胞。

含佛甲草耐盐基因SLEIPP的表达载体pBI121_SLEIPP。

含有表达载体pB121_SLEIPP的宿主细胞。

佛甲草耐盐基因SLEIPP增强拟南芥或杨树耐盐性能的用途。

本发明的优点：

实验证明，佛甲草耐盐基因SLEIPP增强拟南芥或杨树耐盐性能。能使包括拟南芥、杨树在内的宿主植物具有较好的抗盐能力。

附图说明

图1为SLEIPP基因克隆电泳示意图。

图2为SLEIPP插入表达载体后示意图。

图3为pBI121_SLEIPP转化拟南芥后，转化子基因组PCR筛选结果。

图4为pBI121_SLEIPP转化拟南芥后，T3纯合体半定量PCR测定表达水平结果。

图5为SLEIPP转基因拟南芥T3纯合体抗盐实验效果照片。

图6为SLEIPP转基因杨树抗盐实验效果照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

载体pJET1.2pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231

载体pBIl21购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/

实施例1

1.佛甲草(Sedum lineare Thunb,简称Sl)SLEIPP基因的克隆

从150mM NaCl水溶液处理的佛甲草(取自天津市滨海新区)中，使用植物RNeasyPlant Mini Kit(Transgene Code#E101-0150rxns)提取总RNA，并且利用EasyScriptFrist-Strand cDNA SynSgesis SuperMix(Transgene Code#AE301-03100rxns)反转录出cDNA。对cDNA进行高通量测序(诺禾致源公司进行高通量测序)获得SLEIPP基因的3’端序列，使用RACE技术(Takara-RACE kit)获得SLEIPP基因的全长cDNA序列将扩增得到的SLEIPP基因进行测序分析，得到完整的SLEIPP基因全长为819bp。构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加pBI121重组位点，上游5’-ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3’(SEQ IDNo.3)，下游5’-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3’(SEQ ID No.4)，以利于后期表达载体的构建。

其具体步骤如下：

1).cDNA第一链的合成

用反转录试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转录体系如下：

反应条件：42℃60min，99℃5min。

2).佛甲草SLEIPP基因反转录质量PCR扩增检测

用佛甲草Actin基因特异引物SEQ ID No.5:5’–GAACTTACTAGCCGACTG-3’,SEQ IDNo.6：5’-CCTCAAGCCTTATACGCAA-3’，PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。

PCR反应体系如下：

反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。

3).佛甲草SLEIPP基因片段PCR扩增

利用Takara RACE kit扩增得到的SLEIPP基因进行测序分析，得到完整的佛甲草SLEIPP基因全长为819bp(SEQ ID No.1)。由佛甲草SLEIPP基因编码的蛋白质，是SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。根据已知cDNA序列利用primer软件设计SLEIPP基因上下游引物:

SEQ ID No.7:5’-AACTGGTGGAATGAAACAAAG-3’，

SEQ ID No.8:5’-GGTCCAGAGATCAATCAAAGC-3’，其PCR反应程序如下：

PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量(见图1)，其余用作产物的纯化回收。

4).构建含有佛甲草SLEIPP基因的克隆载体

构建含有佛甲草SLEIPP基因的载体pJET1.2_SLEIPP

胶回收纯化后的佛甲草SLEIPP基因目的片段利用Clone JET PCR Cloning Kit(pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231)重组到载体pJET1.2上，得到载体pJET1.2_SLEIPP。

其反应程序如下：

反应条件24℃,10min冰上静止30min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞DH5α，37℃，180r，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加抗生素Amp100uM)固体培养基中，37℃过夜培养。

分别利用目的片段的上下游引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)对不同的菌落进行菌落PCR验证，筛选阳性菌落测序，得到含有克隆载体pJET1.2_SLEIPP的宿主细胞。

注：pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为DH5α感受态细胞，TIANGEN，CB101-2。

5).构建含有佛甲草SLEIPP基因的表达载体

构建含有佛甲草SLEIPP基因的表达载体pBI121_SLEIPP

构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端和3’添加pBI121重组位点，

SEQ ID No.3:5’-ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3’,

SEQ ID No.4:5’-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3’

得到：

SEQ ID No.9:5’-ACGGGGGACTCTAGAGGATCCAACTGGTGGAATGAAACAAAG-3’

SEQ ID No.10:5’-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCGGTCCAGAGATCAATCAAAGC-3’

提取测序正确的pJET1.2-基因的质粒，作为模版，利用含有重组位点SEQ IDNo.9，SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，其反应程序如下

PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。

提取pBI121质粒，其载体图谱(见图2)，对其进行双酶切线性化，程序如下：

反应条件：37℃，12h之后80℃20min失活。

将基因和线性化的pBI121质粒使用Clon Express Entry One Step Cloning Kit试剂盒进行重组构建，反应程序如下：

反应程序：37℃，30min，冰上5min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞DH5α，37℃，180r，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加抗生素kan 50uM)固体培养基中，37℃过夜培养。

分别利用载体和目的片段的上下游引物(见SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)对同一个菌落进行菌落PCR双重验证，筛选阳性菌落测序(见SEQ ID No.11)。

注：本步骤使用Clon Express Entry One Step Cloning Kit购于vazyme，

6).含有佛甲草SLEIPP基因的重组载体转化农杆菌感受态细胞

实验所用的农杆菌菌株为C58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，C58具有利福平抗性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(Gen)。

利用电击农杆菌转化法，将含有佛甲草SLEIPP基因的大肠杆菌表达载体pBI121_SLEIPP转化到农杆菌株C58(pMP90)感受态细胞中，28℃，培养36h，菌落PCR挑选阳性克隆菌落。

实施例2

1.转化拟南芥

(1)转化拟南芥。

转化拟南芥的具体操作步骤：

①实施例1获得的阳性克隆菌落活化与扩大培养

活化：挑保存的阳性克隆菌落置于3mLYEB液体培养基中(添加Gen、Rift、Sp抗生素，使浓度分别为30mg/L,、25mg/L、50mg/L)培养15小时左右(至OD600＝0.8左右)，180rpm，28℃。

阳性克隆菌的扩大培养：新鲜的10ml的YEB液体培养基中加入适量的抗生素(Gen、Rift、Sp抗生素，浓度分别为30mg/L、25mg/L、50mg/L)，然后接种适量阳性克隆菌液到YEB液体培养基中进行培养，180rpm，在28℃培养至OD600＝0.6。

②转化

将菌液离心(3000rpm，15℃,10min)后弃上清，用体积两倍于所取菌液的质量浓度为5％的蔗糖水溶液重悬菌体(缓慢操作以保证菌体活力)，使菌体散开，调OD600＝0.8。

选取培养3-4周抽苔5-7cm的野生型拟南芥，倒置于装有转化液的容器中，使整个花序浸泡在菌液中15秒，取出拟南芥横躺在托盘中，用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h，使拟南芥直立在温度25℃，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长，直到种子成熟。种子采集后放到37℃烘箱烘干两周，以备后续试验使用。

(2)转基因拟南芥阳性转化子纯合体的筛选

将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃三天，然后在超净台上将转基因拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基上，在1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的T1代阳性转化子。当T1代阳性转化子植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤(购于EPAGMA,荷兰，http://www.epagma.eu/)中，在温度25℃，1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下继续生长14天，先作阳性转化子的鉴定(见图3)，再通过半定量PCR先对其转基因的表达水平进行鉴定(见图4)，选取表达水平高的独立转化株系8号和表达水平低的独立转化株系2号。在上述条件下继续生长，约一个半月后收集种子即为T2代转化种子。重复上述步骤得到8号和2号的T3代纯合体种子。

(3)对转基因拟南芥进行盐胁迫处理

将8号T3代纯合体种子、2号T3代纯合体种子、野生拟南芥种子分别种植在土壤中，在温度25℃，1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长21天，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分为三组平行实验，每组不同类型的植株各7株，均用盐分处理液(150mM NaCl水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理15天后植物照相(见图5)。

实施例3

1.转化杨树

供阳性克隆菌转化的杨树为欧洲山杨×银白杨(Populustremula×P.albaINRAclone N7171-B4，以下简称717杨树)组培苗。

(1)将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗1cm不带腋芽的茎段，划伤口后于24℃黑暗条件下预培养3天；

(2)将选取的实施例1获得的阳性克隆菌菌液(OD600＝0.8)在室温、4000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀用等体积的M液(M液：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮As19.86mg，定容至1L，pH＝5.7)重悬，24℃，100rpm活化1h得到侵染液；按40个，25mL的比例将步骤(1)预培养的茎段放入所述侵染液中，24℃条件下100rpm侵染1h。经过共培养(M1固体培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，琼脂7.2g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮As19.86mg，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，暗条件下共培养36小时)、延迟选择(CIM延迟选择培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：800Lux弱光下培养8天，光照/黑暗为16h/8h)、诱导不定芽(SIM筛选培养基中：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux，光照/黑暗为16h/8h)、伸长培养(SEM筛选培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h，培养4周)、诱导生根(RM培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖30g，头孢霉素500mg，，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h)多步后，待再生杨树生长正常后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定。

通过半定量PCR选取表达水平高的独立转化株系和表达水平低的独立转化株系进行抗盐实验。

(3)将717杨树进行盐处理

将生长2个月的长势均匀的转基因高表达杨树、低表达转基因杨树、野生型717杨树移栽至土盆中，待土盆苗生长30d后，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分成三组，每组不同类型的植株各7株，用盐分处理液(150mM NaCl水溶液水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理30天后观察植株并照相(见图6)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 佛甲草耐盐基因SLEIPP及其应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> Sedum lineare Thunb

<400> 1

atgaaacaaa gtaggaaata ctattcggtg atttttgtgt atttttcttt atttttttac 60

tatgtgaggt taccattata ttgcattaca tgtgtattta catttgcttt acaccagagc 120

tccgcccttg gcaaactcag tgacagcaag cgcaaccaga cccaacatgg ccagtcgtcc 180

attgacaagc tcggcgtcag aggtcatagc tccctcaaac ttggactctg gatccactcc 240

tttgaagaat ggtacaaaca aagcaacgga gaacaaaatg gatgccccga gaaagagctg 300

gaatccacca tgagatattt gtccaaacac gtcctgacca ctcagtccct cagaaccaat 360

agcagaaaca aatcccagca tagcaggccg gccgttgatc ctctctggtg cagggctgct 420

gaactccaac aagtctatga tttttggcac ggtagaagct tctttgatac cttcatcaac 480

ctgagctacg cacttcacta ctcccgtatt gacagttctc tgcgaacggc gaaccatacc 540

cgaaggtcct ggaagcaaca gtggtctggc agctctgccc aacaaactca agacaggcct 600

tattatgatg ctttgcatgg ttgctattgc ggccattgga gctgcaaact ctgttgcttg 660

agagcagaca cactagagtt gaaagtgaaa ctgttgtgct ttttctatct ttgcggtgag 720

tatgaagcta agcaagaatg gtgcaattta tataactttc gttggaatgt aattgtggat 780

tctttactgt ccacggtgct ctgtttgagc tttgattga 819

<210> 2

<211> 272

<212> PRT

<213> Sedum lineare Thunb

<400> 2

Met Lys Gln Ser Arg Lys Tyr Tyr Ser Val Ile Phe Val Tyr Phe Ser

1 5 10 15

Leu Phe Phe Tyr Tyr Val Arg Leu Pro Leu Tyr Cys Ile Thr Cys Val

20 25 30

Phe Thr Phe Ala Leu His Gln Ser Ser Ala Leu Gly Lys Leu Ser Asp

35 40 45

Ser Lys Arg Asn Gln Thr Gln His Gly Gln Ser Ser Ile Asp Lys Leu

50 55 60

Gly Val Arg Gly His Ser Ser Leu Lys Leu Gly Leu Trp Ile His Ser

65 70 75 80

Phe Glu Glu Trp Tyr Lys Gln Ser Asn Gly Glu Gln Asn Gly Cys Pro

85 90 95

Glu Lys Glu Leu Glu Ser Thr Met Arg Tyr Leu Ser Lys His Val Leu

100 105 110

Thr Thr Gln Ser Leu Arg Thr Asn Ser Arg Asn Lys Ser Gln His Ser

115 120 125

Arg Pro Ala Val Asp Pro Leu Trp Cys Arg Ala Ala Glu Leu Gln Gln

130 135 140

Val Tyr Asp Phe Trp His Gly Arg Ser Phe Phe Asp Thr Phe Ile Asn

145 150 155 160

Leu Ser Tyr Ala Leu His Tyr Ser Arg Ile Asp Ser Ser Leu Arg Thr

165 170 175

Ala Asn His Thr Arg Arg Ser Trp Lys Gln Gln Trp Ser Gly Ser Ser

180 185 190

Ala Gln Gln Thr Gln Asp Arg Pro Tyr Tyr Asp Ala Leu His Gly Cys

195 200 205

Tyr Cys Gly His Trp Ser Cys Lys Leu Cys Cys Leu Arg Ala Asp Thr

210 215 220

Leu Glu Leu Lys Val Lys Leu Leu Cys Phe Phe Tyr Leu Cys Gly Glu

225 230 235 240

Tyr Glu Ala Lys Gln Glu Trp Cys Asn Leu Tyr Asn Phe Arg Trp Asn

245 250 255

Val Ile Val Asp Ser Leu Leu Ser Thr Val Leu Cys Leu Ser Phe Asp

260 265 270

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

acgggggact ctagaggatc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgatcgggga aattcgagct c 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaacttacta gccgactg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cctcaagcct tatacgcaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aactggtgga atgaaacaaa g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggtccagaga tcaatcaaag c 21

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acgggggact ctagaggatc caactggtgg aatgaaacaa ag 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgatcgggga aattcgagct cggtccagag atcaatcaaa gc 42

<210> 11

<211> 819

<212> DNA

<213> Sedum lineare Thunb

<400> 11

atgaaacaaa gtaggaaata ctattcggtg atttttgtgt atttttcttt atttttttac 60

tatgtgaggt taccattata ttgcattaca tgtgtattta catttgcttt acaccagagc 120

tccgcccttg gcaaactcag tgacagcaag cgcaaccaga cccaacatgg ccagtcgtcc 180

attgacaagc tcggcgtcag aggtcatagc tccctcaaac ttggactctg gatccactcc 240

tttgaagaat ggtacaaaca aagcaacgga gaacaaaatg gatgccccga gaaagagctg 300

gaatccacca tgagatattt gtccaaacac gtcctgacca ctcagtccct cagaaccaat 360

agcagaaaca aatcccagca tagcaggccg gccgttgatc ctctctggtg cagggctgct 420

gaactccaac aagtctatga tttttggcac ggtagaagct tctttgatac cttcatcaac 480

ctgagctacg cacttcacta ctcccgtatt gacagttctc tgcgaacggc gaaccatacc 540

cgaaggtcct ggaagcaaca gtggtctggc agctctgccc aacaaactca agacaggcct 600

tattatgatg ctttgcatgg ttgctattgc ggccattgga gctgcaaact ctgttgcttg 660

agagcagaca cactagagtt gaaagtgaaa ctgttgtgct ttttctatct ttgcggtgag 720

tatgaagcta agcaagaatg gtgcaattta tataactttc gttggaatgt aattgtggat 780

tctttactgt ccacggtgct ctgtttgagc tttgattga 819

Claims

1.佛甲草耐盐基因SLEIPP，其特征是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.含权利要求1的一种佛甲草耐盐基因SLEIPP的克隆载体pJET1.2_SLEIPP。

3.含有克隆载体pJET1.2_SLEIPP的宿主细胞。

4.含权利要求1的一种佛甲草耐盐基因SLEIPP的表达载体pBI121_SLEIPP。

5.含有表达载体pB121_SLEIPP的宿主细胞。

6.佛甲草耐盐基因SLEIPP增强拟南芥或杨树耐盐性能的用途。