CN104531722B

CN104531722B - 盐地碱蓬rav基因及包括该基因的重组载体

Info

Publication number: CN104531722B
Application number: CN201510022757.5A
Authority: CN
Inventors: 王洁华; 魏志蓉; 罗翠; 王蕊; 杨少辉
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: CN104531722A

Abstract

本发明公开了一种盐地碱蓬RAV基因及包括该基因的重组载体，盐地碱蓬RAV基因，是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。含盐地碱蓬RAV基因的重组载体含有盐地碱蓬RAV基因。含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞，是将含盐地碱蓬RAV基因的重组载体导入到农杆菌菌株中，得到转化宿主细胞。盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐性能的用途。实验证明，含盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐的功能得到了明显的提升。

Description

盐地碱蓬RAV基因及包括该基因的重组载体

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域。涉及一种盐地碱蓬基因及包括该基因的重组载体。

背景技术

土壤盐渍化是世界农业生产面临的严重问题之一，盐胁迫是限制植物生长发育的重要因子。随着近年来国家对盐碱地的开发和利用日益重视,对抗盐基因的分离与功能研究成为生物学的热门研究方向。创制耐盐作物品种是在环球工业化大背景下取得粮食产量稳定持续增长的重要手段之一，但是由于缺乏对作物耐盐的分子机理以及与耐盐有关基因的了解，阻碍了耐盐作物的培育。随着对植物盐胁迫应答的分子机理研究不断深入，特别是以拟南芥为研究对象，植物在盐胁迫条件下的离子平衡和耐盐反应调节途径的研究取得了突破性的进展。目前，对抗盐基因的分离和应用是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培育的首要任务。

盐地碱蓬(Suaeda salsa，简称S.sa)又名翅碱蓬、黄须菜，为藜科(Chenopodiaceae)一年生草本真盐生植物，肉质化真盐生植物，生长于海涂或盐场的盐滩之上，具有耐盐碱、耐旱、耐涝等特性。盐地碱蓬在我国分布极为广泛，多数生于滨海洼地以及渠岸或田边轻度盐碱化土壤，具有抗盐碱和耐海水的特点，是广阔滩涂土地的一种指示植物。盐地碱蓬在改善并利用盐碱地、降低土壤盐分、减少土壤水分蒸发、促进植物抗盐机制研究、提供抗盐种质资源和抗盐基因工程等方面有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种盐地碱蓬RAV基因。

本发明的第二个目的是提供盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供含盐地碱蓬RAV基因的重组载体。

本发明的第四个目的是提供含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供含盐地碱蓬RAV基因的用途。

本发明的技术方案概述如下：

盐地碱蓬RAV基因，是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

含盐地碱蓬RAV基因的重组载体，含有盐地碱蓬RAV基因。

含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞，将含盐地碱蓬RAV基因的重组载体导入到农杆菌菌株中，得到转化宿主细胞。

盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐性能的用途。

实验证明，含盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐的功能得到了明显的提升。

附图说明

图1盐地碱蓬RAV基因克隆电泳示意图。

图2盐地碱蓬RAV插入表达载体pK2GW7(I)后示意图。

图3 pK2GW7(I)_S.saRAV转化C58农杆菌后PCR结果。

图4 pK2GW7(I)_S.saRAV转化拟南芥后，T3纯合体半定量PCR测定表达水平结果。

图5盐地碱蓬RAV转基因拟南芥T3纯合体抗盐实验效果照片。其中的1为未经盐水处理野生型拟南芥；2是用100mMNaCl处理野生型拟南芥；3是用100mMNaCl处理RAV低表达量拟南芥；4是用100mMNaCl处理RAV高表达量拟南芥。

图6盐地碱蓬RAV转基因杨树半定量PCR测定表达水平结果。

图7盐地碱蓬RAV转基因杨树抗盐实验效果。其中的1为未经盐水处理野生型杨树；2是用100mMNaCl处理野生型杨树；3是用100mMNaCl处理RAV低表达量杨树；4是用100mMNaCl处理RAV高表达量杨树。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1

1.盐地碱蓬RAV基因的克隆：(盐地碱蓬简称S.sa)

从五周盐地碱蓬整株幼苗(取自天津市滨海新区北塘口东海路沿线)中，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Trans gene Code#EP101-0150rxns)提取总RNA，并且利用EasyScript Frist-Strand cDNA SynSgesis SuperMix(Trans gene Code#AE301-03100rxns)反转录出cDNA。根据NCBI数据库中的RAV基因序列保守区设计简并引物SEQ IDNo.3：

5'-GTCGTCAAAATTCAAAGGCGT-3'和SEQ ID No.4：

5'-CTGCATATTTCTTGGGTATCTCA-3'，然后利用RACE-PCR技术(Introgen, RLM-RACE Kit with Manual)获得盐地碱蓬RAV基因全长cDNA序列，其具体步骤如下：

1)cDNA第一链的合成

用反转录试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，以盐地碱蓬总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转录体系如下：

反应条件：42℃60min，99℃5min。

2).盐地碱蓬RAV基因反转录质量PCR扩增检测

用盐地碱蓬Actin基因特异引物SEQ ID No.5:5'–GTGGTCGTACAACGGTATTG

TG-3',SEQ ID No.6：5'-GACCTCCAATCCAGACACTG-3'，PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。

PCR反应体系如下：

反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。

3)盐地碱蓬RAV基因片段的PCR扩增

以cDNA为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示核苷酸为上下游引物，进行PCR反应。反应体系如下：

PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5min。PCR结束后，取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

对通过RACE技术扩增得到的RAV基因进行测序分析，得到完整的盐地碱蓬RAV基因全长为1056bp(SEQ ID No.1)，见图1。

由盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4)根据盐地碱蓬RAV基因核苷酸序列设计上下游引物

SEQ ID No.7:5'-TGTCTCATTTGTTTCCTGTCTCT-3'和

SEQ ID No.8:5'-AACAAACATCTAAGTAAGTTTTCATCC-3'

构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加Gateway系统重组位点，

SEQ ID No.9:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’,

SEQ ID No.10:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’

得到：

SEQ ID No.11:

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGTCTCATTTGTTTCCTGTCTCT-3'

SEQ ID No.12:

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAACAAACATCTAAGTAAGTTTTCATCC-3'

5)attB-PCR产物的合成及纯化回收

PCR离心管中加入以下反应体系

PCR反应条件为:95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，90s；72℃，10min；4℃，∞。

PCR反应结束后，取1μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。

6)构建含有盐地碱蓬RAV基因的重组载体

构建含有盐地碱蓬RAV基因的载体pJET1.2_S.saRAV、pDONR201_S.saRAV和大肠杆菌表达载体pK2GW7(I)_S.saRAV。

pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231；pDONR201、pK2GW7(I)载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为DH5a感受态细胞，TIANGEN,CB101-2。

胶回收纯化后的盐地碱蓬RAV基因目的片段利用CloneJET PCR Cloning Kit(pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231)重组到载体pJET1.2上，得到载体pJET1.2_S.saRAV。

分别利用载体和目的片段的上下游引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)对同一个菌落进行菌落PCR双重验证，筛选阳性菌落测序。

提取测序正确菌液的质粒进行BP反应，得到载体pDONR201_S.saRAV，筛选出阳性克隆进行测序。同样，提取测序正确菌的质粒进行LR反应，得到大肠杆菌表达载体pK2GW7(I)_S.saRAV(见图2)，筛选出阳性克隆。

在BP反应中，5’端、3’端分别含有attB1和attB2位点的PCR产物，与两端分别含有attP1和attP2位点的供载体在BP克隆酶的催化下，通过同源重组生成含有目的基因的入门克隆；LR反应中，在LR克隆酶作用下，含有入门PCR产物的入门克隆与含有attR1和attR2序列的目的载体发生定向重组反应，生成带有目的PCR产物的表达载体。

注：本步骤使用的所有材料均购于invitrogen，包括Gateway BP onase IIEnzyme Mix Lor:11789-020；Qty:20rxn)),Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Lor:1356811；Qty:20rxn),

7)含有盐地碱蓬RAV基因的重组载体转化农杆菌感受态细胞

实验所用的农杆菌菌株为C58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，C58具有利福平抗性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(Gen)。

利用电击农杆菌转化法，将含有盐地碱蓬RAV基因的大肠杆菌表达载体pK2GW7(I)_S.saRAV转化到农杆菌株C58(pMP90)感受态细胞中，28℃，培养36h，菌落PCR挑选阳性克隆菌落见图3。

实施例2转化拟南芥

(1)转化拟南芥。

转化拟南芥的具体操作步骤：

①实施例1获得的阳性克隆菌落活化与扩大培养

活化：挑保存的阳性克隆菌落置于3mLYEB液体培养基中(添加Gen、Rift、Sp抗生素，使浓度分别为30mg/L,、25mg/L、50mg/L)培养15小时左右(至OD₆₀₀＝0.8左右)，180rpm，28℃。

阳性克隆菌的扩大培养：新鲜的10ml的YEB液体培养基中加入适量的抗生素(Gen、Rift、Sp抗生素，浓度分别为30mg/L,、25mg/L、50mg/L)，然后接种适量阳性克隆菌液到YEB液体培养基中进行培养，180rpm，在28℃培养至OD₆₀₀＝0.6。

②转化

将菌液离心(3,000rpm，15℃,10min)后弃上清，用体积两倍于所取菌液的质量浓度为5％的蔗糖水溶液重悬菌体(缓慢操作以保证菌体活力),使菌体散开,调OD₆₀₀＝0.8。

选取培养3-4周抽苔5-7cm的野生型拟南芥，倒置于装有转化液的容器中，使整个花序浸泡在菌液中15秒，取出拟南芥横躺在托盘中，用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h,使拟南芥直立在温度25℃，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长，直到种子成熟。种子采集后放到37℃烘箱烘干两周，以备后续试验使用。

(2)转基因拟南芥阳性转化子纯合体的筛选

将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃三天，然后在超净台上将转基因拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基上，在1800Lux,光周期16h光照/8h黑暗，生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的T1代阳性转化子。当T1代阳性转化子植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤(购于EPAGMA,荷兰，http://www.epagma.eu/)中，在温度25℃，1800Lux,光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下继续生长14天，先作阳性转化子的鉴定，再通过半定量PCR先对其转基因的表达水平进行鉴定(见图4)，选取表达水平高的独立转化株系7号和表达水平低的独立转化株系1号。在上述条件下继续生长，约一个半月后收集种子即为T2代转化种子。重复上述步骤得到7号和1号的T3代纯合体种子。

(3)对转基因拟南芥进行盐胁迫处理

将野生拟南芥种子分为两组，分别称为：第1组野生拟南芥种子、第2组野生拟南芥种子。

将7号T3代纯合体种子、1号T3代纯合体种子、第1组野生拟南芥种子、第2组野生拟南芥种子分别种植在上述土壤中，在温度25℃，1800Lux,光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长21天，每种植物保留15株长势一致的幼苗，再对第1组野生拟南芥种子生长的幼苗用水进行浇灌，对其余三组，用盐分处理液(100mmol/LnaCl水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理30天后观察植株的叶片大小，鲜重、株高，根长等指标并照相。见图5。

实施例3转化杨树

供阳性克隆菌转化的杨树为欧洲山杨×银白杨(Populus tremula×P.alba INRAclone N7171-B4，以下简称717杨树)组培苗。

(1)将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗1cm不带腋芽的茎段，划伤口后于24℃黑暗条件下预培养3天；

(2)将选取的实施例1获得的阳性克隆菌菌液(OD₆₀₀＝0.8)在室温、4000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀用等体积的M液(M液：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，乙酰丁香酮As 19.86mg，定容至1L，pH＝5.7)重悬，24℃，100rpm活化1h得到侵染液；按40个：25mL的比例将步骤(1)预培养的茎段放入所述侵染液中，24℃条件下100rpm侵染1h。经过共培养(M1固体培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，琼脂7.2g,生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，乙酰丁香酮As 19.86mg，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，暗条件下共培养36小时)、延迟选择(CIM延迟选择培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，头孢霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：800Lux弱光下培养8天，光照/黑暗为16h/8h)、诱导不定芽(SIMa筛选培养基中：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ 0.05mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux，光照/黑暗为16h/8h)、伸长培养(SEM筛选培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素2ip 1.02mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h，培养4周)、诱导生根(RM培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖30g，头孢霉素500mg，，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h)多步后，待再生杨树生长正常后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定。

通过半定量PCR选取表达水平高的独立转化株系8号(转基因8号杨树)和表达水平低的独立转化株系1号(转基因1号杨树)(见图6)进行抗盐实验。

(3)将717杨树分为两组，分别称为：第1组717杨树、第2组717杨树。

将生长2个月的长势均匀的转基因8号杨树、转基因1号杨树、第1组717杨树、第2组717杨树移栽至土盆中，待土盆苗生长30d后，每种植物保留15株长势一致的幼苗，对第1组717杨树用水进行浇灌，对其余三组，用盐分处理液(100mmol/LnaCl水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理30天后观察植株的叶片大小，鲜重、株高，根长等指标并照相。见图7。

Claims

1.盐地碱蓬RAV基因，其特征是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1的盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质是SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

3.含盐地碱蓬RAV基因的重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的盐地碱蓬RAV基因。

4.含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞，其特征是将权利要求3所述的重组载体导入到农杆菌菌株中，得到转化宿主细胞。

5.权利要求1所述的盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐性能的用途。