CN104531721B - 盐地碱蓬耐盐碱基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开盐地碱蓬耐盐碱基因及其应用，从盐地碱蓬中获取并具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，采用该基因转染的拟南芥和杨树表现出对盐碱的耐受力，说明本发明提供的耐盐碱基因在改良作物耐盐碱能力中的应用。

Description

盐地碱蓬耐盐碱基因及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物技术领域，更加具体地说，涉及选自盐地碱蓬的耐盐碱基因及其应用。
背景技术
土壤盐渍化是世界农业生产面临的严重问题之一，盐胁迫是限制植物生长发育的重要因子。随着近年来国家对盐碱地的开发和利用日益重视,对抗盐基因的分离与功能研究成为生物学的热门研究方向。创制耐盐作物品种是在环球工业化大背景下取得粮食产量稳定持续增长的重要手段之一，但是由于缺乏对作物耐盐的分子机理以及与耐盐有关基因的了解，阻碍了耐盐作物的培育。随着对植物盐胁迫应答的分子机理研究不断深入，特别是以拟南芥为研究对象，植物在盐胁迫条件下的离子平衡和耐盐反应调节途径的研究取得了突破性的进展。目前，对抗盐基因的分离是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培育的首要任务。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从盐地碱蓬中获取的耐盐碱基因及其应用。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
盐地碱蓬耐盐碱基因如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列相比具有添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的，且与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列相比具有90—95％的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
重组载体，包含上述盐地碱蓬耐盐碱基因，例如pJET1.2、pDONR201、pK2GW7。
农杆菌细胞，转染上述盐地碱蓬耐盐碱基因。
本发明的盐地碱蓬耐盐碱基因在改良植物耐盐碱性中的应用，所述植物可选择拟南芥或者杨树。
本发明公开盐地碱蓬耐盐碱基因及其应用，从盐地碱蓬中获取并具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，采用该基因转染的拟南芥和杨树表现出对盐碱的耐受力，说明本发明提供的耐盐碱基因在改良作物耐盐碱能力中的应用。
附图说明
图1是本发明的盐地碱蓬耐盐碱的基因克隆电泳示意图。
图2是转染之后pJET1.2_SgSAT的测序表达电泳图。
图3是含有本发明的盐地碱蓬耐盐碱的基因SgSAT的表达载体示意图。
图4是pK2GW7(I)_SgSAT32转化拟南芥后，T3纯合体PCR测定表达水平结果示意图。
图5是SgSAT32转基因拟南芥T3纯合体抗盐实验效果图。
图6是SgSAT32转基因杨树抗盐实验效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
使用的植物碱蓬(盐地碱蓬)来源为天津市滨海新区北塘口东海路。
首先以此为原料获取本发明的耐盐碱基因(即盐地碱蓬SAT基因的克隆)。
取五周新鲜盐地碱蓬植株，使用植物EasyPure PCR Purification Kit(Transgene Code#EP101-0150rxns)提取total RNA，并且利用EasyScript Frist-Strand cDNASynSgesis SuperMix(Trans gene Code#AE301-03100rxns)去除基因组DNA干扰，反转录出cDNA。
根据NCBI数据库中的Arabidopsis thaliana SAT32s基因的序列保守区设计简并引物SAT-5和SAT-3，然后利用RACE-PCR技术(Introgen, RLM-RACE Kit withManual)获得盐地碱蓬SAT基因全长cDNA序列，将扩增得到的SAT基因进行测序分析，得到完整SgSAT基因全长为1029bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，即本发明的耐盐碱基因。
在上述方案中，引物SAT—5如序列表中SEQ ID NO.2所示，5’-TGGAGGAGGGTTCATAAGCA-3’；引物SAT—3如序列表中SEQ ID NO.3所示，5’-ATGCTGTGAGGAAGGAGAATGA-3’。
根据SgSAT基因核苷酸序列设计上下游引物SAT-F和SAT-R，利用EasyScriptFrist-Strand cDNA SynSgesis SuperMix(Trans gene Code#AE301-03100rxns)去除基因组DNA干扰，反转录出盐地碱蓬cDNA，引物SAT-F如序列表中SEQ ID NO.4所示，5’-CTTGAGTTCTGATTTCACTGATGG-3’；引物SAT-R如序列表中SEQ ID NO.5所示，5’-TCATTCTCCTTCCTCACAGCAT-3’。反应PCR程序：42℃30min，85℃5min，4℃，进行保存。
利用RACE-PCR技术的具体步骤，如下：
(1)cDNA第一链的合成，用反转录试剂盒TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0，以兴安落叶松总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成第一链cDNA，反转录体系如下表所示。反应条件：42℃60min，99℃5min。
组分 用量(μl)
MgCl2(25mM) 2.0
10×RTBuffer 1.0
RNaseFreedH2O 4.25
dNTPMixture(各10mM) 1.0
RNaseInhibiter(40U/μl) 0.25
AMVReverseTranscriptaseXL(5U/μl) 0.5
OligodT-Adaptorprimer(2.5pmol/μl) 0.5
totalRNA(约1μg/μl) 0.5
Total 10.0
(2)盐地碱蓬基因反转录质量PCR扩增检测，用盐地碱蓬Actin基因特异引物进行PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。PCR反应体系如下表所示。反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。引物SgACT-F如序列表中SEQ ID NO.6所示，5'–GTGGTCGTACAACGGTATTGTG-3'，引物SgACT-R如序列表中SEQ ID NO.7所示，5'-GACCTCCAATCCAGACACTG-3'。
组分 用量(μl)
TaqMix 5
SgACT-F(10μM) 0.3
SgACT-R(10μM) 0.3
cDNA 2.0
ddH2O 2.4
Total 10
(3)SgSAT基因片段的PCR扩增，以cDNA为模板，SAT-5、SAT-3为引物，进行PCR反应。反应体系如下表所示，SgSAT中间片段PCR反应体系，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5min。PCR结束后，取5μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
组分 用量(μl)
10×PCRBuffer 2.5
dNTPs(各2.5mM) 2.0
SAT-5(50μM) 1.0
SAT-3(50μM) 1.0
rTaqDNApolymerase 0.3
cDNA 2.0
ddH2O 16.2
在完成本发明的基因序列之后需要对PCR产物进行提纯和去杂，得到提纯纯化后的目的片段(即提纯的本发明基因序列)，attB-PCR产物的合成及纯化回收，在PCR离心管中加入以下反应体系，PCR反应条件为:95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，90s；72℃，10min。PCR反应结束后，取1μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。
10×pfuDNApolymerasebuffer 2μL
PfuDNApolymerase(5U/μL) 0.2μL
dNTPMix(10μM) 1.6μL
Template(GenomeDNA) 1μL
ForwardPrimer(10μM) 0.4μL
ReversePrimer(10μM) 0.4μL
ddH2O 14μL
TotalVolume 20μL
第二，构建含有本发明的盐地碱蓬基因(SgSAT基因)的中间载体pJET1.2_SgSAT、pDONR201_SgSAT和大肠杆菌表达载体pK2GW7(I)_SgSAT
在构建表达载体时，可考虑分别在特异性引物的5’端添加Gateway系统重组位点，以提高目的基因的表达效率，上游引物序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’；下游引物序列序列表中SEQ IDNO.9所示，5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。
将回收纯化后的目的片段(纯化后的SgSAT基因)利用CloneJET PCR Cloning Kit(Clone JET PCR Cloning Kit#K123120rxns)连接到pJET1.2上，(质粒pJET1.2:Thermo)分别利用载体和目的片段的上下游引物SAT—F和SAT—R对同一个菌落进行菌落PCR双重验证，筛选阳性菌落测序。提取测序正确菌液的质粒进行BP反应，筛选出阳性克隆进行测序。同样，提取测序正确菌的质粒进行LR反应，筛选出阳性克隆。
采用如上述相同的方法构建中间载体pDONR201_SgSAT，pDONR201购自invitrogen公司。对中间载体进行阳性克隆筛选，如附图2所示，用1％的胶电泳，点样为5μl2×loadingbuffer+5μl PCR产物。左侧9个条带为：将pJET1.2_SgSAT进行DH5a感受态转化后，挑选单菌落，用克隆引物进行菌落PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳得到的条带。条带大小为1073。最右侧条带为Marker DL2000。
在实施例中使用琼脂糖凝胶电泳方法，用1×TAE和琼脂糖加gelRED配成1％胶，待胶凝固后放入加入电泳缓冲液(1×TAE)的电泳槽中。点样时加入2×loadingbuffer，并注意，不要将样点到点样孔之外(飘样)，也不要将胶戳漏(漏样)，跑胶时间在15分钟左右。
构建本发明基因的表达载体pK2GW7(I)_SgSAT，pK2GW7(I)载体购自invitrogen公司，大肠杆菌为DH5a感受态细胞，TIANGEN,CB101-2，使用提纯的目的基因进行转染，并通过PCR验证，筛选阳性菌落。
第三，表达载体转化农杆菌感受态细胞，利用筛选的阳性表达载体转化农杆菌，实验所用的农杆菌菌株为C58(pMP90)，其染色体具有利福平抗性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗(Gen)。转染后的菌落通过PCR验证，并挑选阳性克隆侵染拟南芥。农杆菌的活化与扩大培养
农杆菌活化：挑保存的阳性农杆菌的单菌落置于3mLYEB液体培养基中(含相应Km抗生素，浓度为50μg/ml)过夜培养15小时左右(至OD600＝0.8左右)，170rpm，28℃。农杆菌的扩大培养：新鲜的10ml的YEB液体培养基中加入适量的Km抗生素(浓度为50μg/ml)，然后接种接适量农杆菌菌液到YEB液体培养基中进行培养，170rpm，在28℃培养至OD600＝0.6。
第四，转化拟南芥
经过上述步骤筛选的阳性农杆菌进行保存，挑保存的阳性农杆菌的单菌落过夜培养(至OD600＝0.8左右)，菌液离心后弃上清，用5wt％蔗糖液体重悬菌体后浸泡待转化的拟南芥的整个花序约30-45秒，取出拟南芥横躺在托盘中，用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h,然后在温度25℃，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度：70％的培养条件下使其正常生长，直到种子成熟。种子采集后放到37℃烘箱烘干两周，以备后续试验使用。
将上述收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃春化三天，然后在超净台上将已经春化好的拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基上，在合适的光照强度下生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的T1代阳性转化子(由于农杆菌中含有卡那霉素的抗体，故成功转染的拟南芥中表现出卡那霉素的抗性)。当转化植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤中，约一个半月后收集种子即为T2代转化种子。采用相同方法进行筛选，继续生长一代后得到T3代种子，通过在选择性培养基上筛选，100％成活率的从种子即为T3代纯合体种子。
选取长势均匀的T3代纯合体种子，先对其转基因的表达水平进行鉴定，选取表达水平高的三种独立转化株系和一种表达水平低的独立转化株系(用作对照)进行抗盐实验。具体方法是待苗生长14d后，每种植物保留15株长势一致的幼苗，分别用水(普通水)、盐分处理液(100和150mmol/LNaCl水溶液)进行浇灌处理。每次浇灌量为培养基质持水量的3倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理30天后测定植株的叶片大小，鲜重、株高，根长等指标并照相。
如附图4所示，pK2GW7(I)_SgSAT32转化拟南芥后，T3纯合体PCR测定表达水平结果，用克隆引物做半定量，检测基因的表达情况，图中2、6、7、8、9、13、14均为高表达量的植株，其余为低表达量植株，选取高表达量植株6#和低表达量植株16#进行盐处理实验。如附图5所示，SgSAT32转基因拟南芥T3纯合体抗盐实验效果，WT空白组、低表达量、高表达量在相同测试环境下表现出明显不同的生长形态。
第五，转化杨树
供农杆菌转化的杨树为欧洲山杨×银白杨(Populus tremula×P.alba INRAclone N7171-B4，以下简称717杨树)组培苗。
将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗1cm不带腋芽的茎段，划伤口后于24℃黑暗条件下预培养3天；将选取的阳性农杆菌菌液(OD600＝0.8)在室温、4000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀用等体积的M液重悬，24℃，100rpm活化1h得到侵染液；按40个：25mL的比例将经3.1预培养的茎段或带有叶片的叶柄放入所述侵染液中，24℃条件下100rpm侵染1h。经过共培养、延迟选择、诱导不定芽、伸长培养、诱导生根多步后，待再生杨树生长正常后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定。选择生长2个月的长势均匀的阳性组培苗进行扩繁，用于盐处理实验，所用培养基为1/2MS(CK)、1/2MS分别添加100和150mmol/LNaCl。如附图6所示，SgSAT32转基因杨树抗盐实验效果图，WT空白组、低表达量、高表达量在相同测试环境下表现出明显不同的生长形态。
上述实验验证本发明的基因序列具有耐盐碱性能，在表达转染过程中，与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列相比具有添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的，且与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列相比具有90—95％的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列表达基本相同的性能和性状。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.盐地碱蓬耐盐碱基因，其特征在于，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.重组载体，包含如权利要求1所述的盐地碱蓬耐盐碱基因。
3.农杆菌细胞，转染了如权利要求1所述的盐地碱蓬耐盐碱基因。
4.如权利要求1所述的盐地碱蓬耐盐碱基因在改良植物耐盐碱性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或者杨树。
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