CN103215306A - 丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有芹菜丝氨酸乙酰转移酶基因且能提高植物抗高NO3 -能力的专用植物表达载体1300-superpromoter-AgSAT，本发明是利用RACE的方法从芹菜中克隆出SAT基因，用组成型超强启动子Super-promoter在烟草叶片中过量表达，并通过叶盘转化法将其转入野生型烟草中，实验结果表明在转基因烟草中SAT基因能够正常转录，在高NO3 -环境条件下，转入SAT基因和的生长情况比对照植株（未转基因的野生型）要好，说明过量表达SAT基因能够很大程度的提高增加转基因烟草中SAT的酶活性和GSH合成量，同时谷胱甘肽还原酶活性的增强也导致了GSH含量的提高。因此也更有效地提高转基因烟草抗氧化能力，从而增强其对高硝酸盐的耐受能力。
Description
技术领域
本发明属于植物工程领域，具体涉及一种丝氨酸乙酰转移酶基因SAT的植物表达载体1300-Surperpromoter-AgSAT，及其在转基因作物中的应用。
背景技术
过量使用化肥和偏施N肥是引起土壤次生盐渍化的直接原因（李文庆等，2002，土壤学报，39(2)：283-287）。由于设施土壤处于人为特殊小气候环境下，大量肥料施入，加之无雨水淋洗等原因，导致设施土壤的理化性状和生物学特性产生了很大的变化，许多研究表明，设施土壤耕层的盐分高于相应的露地土壤1-l3倍，且随着设施栽培年限的增长而增加（余海英等，2005，土壤，37(6)：581-586）。设施栽培中土壤可溶性盐组成与露地土壤明显不同，温室栽培中土壤含有的NO3 -、Cl-、SO4 2-、Na+、K+、Ca2+、Mg2+等离子含量明显高于露地土壤，导致总盐含量增加，其中引起设施栽培土壤次生盐渍化的盐离子中，阳离子以Ca2+为主，阴离子以NO3 -为主，约占阴离子总产量的67-76%（童有为等，1991，园艺学报，18(2)：159-162）。因此，硝酸盐累积是设施栽培中土壤次生盐渍化的主要特点，这是它们与滨海盐土、内陆盐碱土的最大区别。
土壤中可溶性盐分过多所诱导的对植物的伤害作用称为盐害（salt-injury）。植物在系统发育中产生了对盐渍环境的适应能力，称为抗盐性（salt-resistence）。植物对盐渍环境的适应机理主要有两种方式：避盐（salt-avoidance）和耐盐（salt-tolerance）。在盐胁迫下，植物的外部形态和内部生理生化特性都会发生一系列的变化，而这些变化是一个复杂的过程。植物体在感受高盐后，这些胁迫信号经历一系列的传递过程，最后诱导特定的功能基因的表达，在生理上作出调节反应，影响了植物生理活动的多方面。植物细胞外界溶液里的盐浓度过高会导致离子平衡和水势平衡的破坏，破坏细胞的组分和营养需求，进而造成植物整体水平上的破坏。主要表现为植物的形态构造、细胞膜、保护酶活性、光合作用、物质代谢和内源激素的变化等。
植物生长发育过程中产生的活性氧(ROS)正常条件下不会对植物造成严重伤害，但逆境条件下植物细胞结构(如:叶绿体、线粒体、过氧化物酶体)中产生的大量 ROS 会造成叶绿素、膜质、蛋白质和核酸的氧化伤害，从而破坏正常的生理代谢（Gill et al.,2010，Plant physiology and biochemistry，48,901-930）。为避免 ROS 的大量积累，具有较强抗盐性的植物体内的抗氧化酶系统在盐胁迫下活性增强，可清除过量 ROS。McCord Fridocich(1969)提出的自由基伤害学说，已广泛用于需氧生物细胞伤害机理的研究。研究表明参与清除ROS的机制有两种，一种是包括谷胱甘肽转移酶(GST)、APX、CAT、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GPOX)等在内的酶促反应系统；另一种是抗坏血酸、谷胱甘肽和类黄酮等抗氧化剂在内的非酶促反应系统。
目前已知SAT代谢途径为：丝氨酸(serine, Ser)和乙酰辅酶A (acetyl-CoA)在SAT催化下形成O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine, OAS)，在半胱氨酸合成酶[ Cys synthase, CSase; 常称 O-乙酰丝氨酸硫醇裂合酶[OAS-TL]的催化下，H2S与O-乙酰丝氨酸反应形成Cys。Cys四条代谢旁路中，合成GSH是主要的代谢途径，并且合成 Cys 的限制因素是SAT，并非OAS-TL（Wirtz et al.,2005，Photosynth Res，86: 345-362）。不同类型的SAT酶过量产生，无论是在细胞质还是在叶绿体中，都表明了SAT酶活是合成Cys和GSH量的限制因子（Sirko et al.,2004，Journal of Experimental Botany，404(55): 1881-1888）。
在植物中，大葱、拟南芥（Droux et al.,1998，Eur J Biochem，255: 235-245）大豆和菠菜（Saito et al.,1994，Plant Physiology，106:887-895）韭菜（Urano et al.,2000，Gene，257:269-277）豌豆（Droux，2003，Plant Physiol Biochem，41:619-627）等的SAT蛋白已经得到纯化并进行重组蛋白酶活的研究。几个研究小组通过细菌突变株功能互补筛选来研究植物中编码SAT基因的cDNAs（Wirtz et al.,2003，Amino Acids，24:195–203）。目前，使用常规的启动子CaMV 35S，已将西瓜的SAT基因过表达拟南芥植株（Noji et al.,2002，Amino Acids，22:231-243），拟南芥的SAT基因过表达烟草植株（Sirko et al.,2004，J Exp Bot，55: 1881-1888）、大肠杆菌的SAT基因过表达马铃薯植株（Harms et al.,2000，Plant J22 (4): 335-343）等，并且研究表明大多数转基因植物较野生型相比，植物的GSH含量有所提高，增强了对H2O2造成的氧化胁迫的抗性。但目前尚无有关芹菜SAT基因的报道。
此外，大量研究表明外源基因在受体植物内可能会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等不良现象，因此选择一个高效的启动子很重要。研究表明Super-promoter在烟草植物（Ni et al.,1995，Plant J，7: 661-676）和烟草‘BY-2’ 悬浮细胞（Lee et al.,2004，J Bacteriol，186: 7254-7261）、拟南芥植物和悬浮细胞(Kim et al.,2007，Plant J，51: 779-791）、玉米植株和悬浮细胞（Narasimhulu et al.,1996，Plant Cell，8: 873-886）等能够高效的转化和表达。Super-promoter和常规使用的启动子CaMV 35S和木薯花叶病毒相比，很少出现表达沉默（Butaye et al.,2004，Plant J，39: 440-449）。全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点，我们文库中获得的EST多为一些较短的cDNA片断。因此，通过RACE技术扩增出芹菜SAT基因的全长序列，并对其生物信息学特性进行分析，同时如果能用高效启动子Super-promoter在植物中过量表达芹菜SAT，那么SAT就可以高效催化Cys合成GSH过程，以达到增强植物的抗氧化能力来提高植物对NO3 -胁迫耐受力的目的。目前未见使用高效启动子Super-promoter过量表达芹菜SAT基因
的植物表达载体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植物过氧化物GSH合成能力的丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体，该载体是含有丝氨酸乙酰转移酶基因SAT，在SAT基因前端为3个章鱼碱合成酶启动子Aocs、甘露碱合成酶启动子Amas和甘露碱合成酶启动子组成的组成型超强启动子，丝氨酸乙酰转移酶基因SAT的cDNA来源于芹菜（Apium graveolens L.var dulce.DC.），芹菜的谷丝氨酸乙酰转移酶基因SAT的cDNA GenBank登录号为JQ723687，
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一、SAT基因的重组载体1300-superpromoter-AgSAT的构建
（1）芹菜SAT基因的扩增
① PCR引物
根据我们文库中获得的SAT基因片段的EST序列设计引物（登录号：JK480388），由上海生物工程公司合成如下引物：
B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
SAT1：5’- ACTACGCCACAACCAACAGC-3’
SAT2：5’-CTTTCTCCAATGATGCTGCTC-3’；
② 用上述反转录产物进行PCR，反应体系如下：
③ PCR反应程序如下：94℃预变性3 min，然后进行以下循环，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60 s，共计30个循环；最后72℃延伸10 min；
④ 同样的体系和反应程序，以第一次的RCR产物为模板做二次PCR，引物为SAT2和B26；
⑤ 将所得片段连入pMDl8-T，酶切鉴定后进行序列测定；
⑥ 根据已测定序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，设计引物SAT3：5’-TTCTGTCTGAAAGCAAATC-3’和SAT4：5’-AGCGAATGGAGCACATAAACT-3’，PCR扩增全长序列做进一步的验证。
（2）SAT基因的TA克隆
回收SAT的编码区基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-SAT；
（3）SAT基因植物表达载体1300-superpromoter-AgSAT的构建
将PCR所得基因全长连接入pMDl8-T载体，筛选正向阳性克隆进行菌液富集后提取质粒，并将质粒用PstI 和XbaI进行双酶切，将酶切后包含SAT全长的条带进行回收；然后用PstI 和XbaI酶切Surper1300+载体，将所得到的载体片段进行回收，所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，再将二者连接后，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起了植物表达载体1300-Surperpromoter-AgSAT。
二、农杆菌的遗传转化和转化子的检测
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载1300-Surperpromoter
-AgSAT转入农杆菌EHA105中，在加有潮霉素的平板上筛选转化子菌落，以农杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用SAT基因的特异引物SAT3和SAT4做PCR检测转化子菌落，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
三、用含有SAT基因的植物表达载体的农杆菌转化植物
挑取携带有质粒1300-Surperpromoter-AgSAT的农杆菌单菌落接种于液体培养基中培养，离心收集菌体，再用MS液体培养基悬浮，用悬浮的农杆菌感染容易分化的植物组织，然后通过组织培养获得转基因小苗，再利用抗生素筛选获得转基因植株。
四、SAT基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测
为了确认用抗生素筛选获得的转基因植物确实含有SAT基因，用PCR方法对筛选到的转基因植物做进一步的鉴定，首先提取转基因植物的基因组DNA，然后以植物基因组DNA为模板，用SAT基因内部片段的特异性引物做PCR检测，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察在含有SAT基因的转基因植株中SAT基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录合成cDNA后用于RT-PCR分析，检测SAT基因在转基因植物中的转录水平。以cDNA为模板，用SAT基因内部片段特异性引物做PCR，经RT-PCR确认的转基因植株用于后续的对高硝酸盐的耐受能力实验。
五、转基因植株对高硝酸盐耐受能力的实验
将形态大小一致的转SAT基因的植株以及对照野生型植株从培养基中取出，洗净根部琼脂，用0.1%多菌灵浸泡1min后，移栽到已消毒的v珍珠岩：v泥炭=1:1基质中进行炼苗2周，将烟草幼苗移到营养液中进行水培一周后进行100 mM NO3 -胁迫处理，正常营养液(15 mM NO3 -)作为对照，处理7 d观察植物表型的变化。转SAT基因植物比野生型植株长势好，说明转入SAT基因的植物确实具有较强抗高硝酸盐能力，达到预期效果。进行各项生理指标的测定。
本发明的优点和技术效果如下：
（1）该载体中含有的来源于芹菜（Apium graveolens L.var dulce.DC.）的SAT基因，是我们在EST序列片段的基础上，通过RACE技术获得的全长新基因（命名：AgSAT， GenBank登录号：JQ723687）；
（2）该载体中使用了高效启动子Super-promoter，使得SAT基因在烟草中高效表达，本发明的研究结果说明了，转SAT基因烟草植株对高硝酸盐耐受能力较强，且与野生型烟草植株效果差异显著（p＜0.05）。
附图说明
图1是本发明芹菜总RNA的提取结果检测示意图，图中所有泳道均为所提芹菜总RNA；
图2是本发明SAT基因的扩增结果示意图；其中：A是3’端扩增；B是基因全长扩增；C是双酶切检测全长基因。
图3是植物表达载体1300-Surperpromoter-AgSAT的构建示意图；
图4是本发明SAT基因植物表达载体的检测示意图，其中A是pMD-AgSAT和原始P-Super1300+检测图，图中M是MarkerⅢ；1是pMD-AgSAT原始质粒；2是pMD-AgSAT质粒的酶切；3是P-Super1300+；4, P-Super1300+载体的酶切；B是植物表达载体1300-Surperpromoter-AgSAT检测图，图中 M1是 MarkerⅢ；M2是Marker15000；1和2是Surper1300+-AgSAT表达载体的酶切；3是Surper1300+-AgSAT表达载体的原始质粒；
图5是本发明转基因烟草的PCR检测示意图，图中SAT1、SAT5、SAT7、SAT8和SAT10为转基因株系；WT为负对照；SAT为正对照（以表达载体DNA为模板）；
图6是本发明转SAT基因烟草的RT-PCR检测示意图，图中WT为野生型；SAT1、SAT5、SAT7、SAT8和SAT10为转基因株系；不同字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异；
图7 是本发明转基因烟草中SAT活性测定结果示意图；
图8是本发明高硝酸盐胁迫下转基因烟草植株的鲜重结果示意图；
图9是本发明高硝酸盐胁迫下转基因烟草植株的干重结果示意图；
图10 是本发明高硝酸盐胁迫下转基因烟草中SAT活性测定结果示意图；
图11是本发明转基因烟草植株中还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定结果示意图；
图12是本发明转基因烟草中H2O2含量测定结果示意图；
图13是本发明转基因烟草中MDA含量的测定结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：芹菜总RNA的制备与检测
芹菜总RNA的提取使用TRIzoL Reagent（Invitrogen公司购买）中试剂，按如下方法进行：取全株幼嫩芹菜0.1 g，加入1 ml的TRIzoL RNA 提取液，混匀室温静置5 min，加入0.2 ml氯仿，振荡混匀，4℃，12000 rpm/min离心15 min；转移上清液，加入0.5 ml异丙醇，混匀室温放置10 min后12000rpm/min离心10 min；弃上清，75％的乙醇1 ml清洗沉淀，4℃，7500 rpm/min离心5 min，真空干燥沉淀，用20 μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA，-20℃，取1ul RNA用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，图1结果说明提取到的RNA 质量符合要求。
实施例2：芹菜cDNA的合成
用芹菜总RNA为模板，使用RevertAidTM-MuLV Reverse Transcriptase Kit（Fermentas）进行cDNA的合成，取植物总RNA 0.25μg，oligo(dT) 50ng，10 mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将其收集于管底，置于65℃恒温干热加热器中加热5 min，冰浴10 min，加入9 μl反应混合物（10×reaction buffer 4μl，25 mM MgCl2 4μl，0.1 M DTT 2μl，RNA酶抑制剂 1 μl），混匀，短暂离心将其收集于管底，25℃保温2 min，加入1μl RevertAidTM-MuLV Reverse Transcriptase，混匀25℃保温20 min，然后42℃保温70 min，冰浴10 min，-20℃保存备用。
实施例3： SAT基因的全长序列的获得
SAT基因全长序列的获得TA克隆如图2所示。
根据我们SSH文库中获得的SAT的EST标签序列，为487bp，将此片段用DNAMAN软件和相近的5个物种的全长SAT基因，包括大豆GmSAT（AF452452.1）、烟草NtSAT7（AJ414053.1）、蓖麻RcSAT（XM_002522677.1）、西瓜CvSAT（D49535.1）、拟南芥AtSAT1，（NM_104470.2）序列进行分析，发现该片段具有5’端，利用RACE技术对3’进行扩增（图2A），就可获得芹菜该基因的全长序列（图2B）。
① PCR引物
根据我们文库中获得的SAT基因片段设计引物，由上海生物工程公司合成：
B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
SAT1：5’- ACTACGCCACAACCAACAGC-3’
SAT2：5’-CTTTCTCCAATGATGCTGCTC-3’
② 用上述反转录产物进行PCR，体系如下：
③ PCR反应程序如下：94℃预变性3 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，53℃退火30s，72℃延伸60 s，共计30个循环；最后72℃延伸10 min；
④ 同样的体系和反应程序，以第一次的RCR产物为模板做二次PCR，引物为SAT2和B26；
⑤ 将所得片段连入pMDl8-T，酶切鉴定后进行序列测定；
⑥ 根据已测定序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，设计引物SAT3：5’-TTCTGTCTGAAAGCAAATC-3’和SAT4：5’-AGCGAATGGAGCACATAAACT-3’，PCR扩增全长序列做进一步的验证。反应体系如下：在上述反应体系的基础上以SAT3和SAT4为上下游引物，其他条件不变。PCR反应程序如下：94℃预变性3 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸60 s，共计30个循环；最后72℃延伸10 min 。扩增出约1172bp条带（图2B），连接pMD-18T克隆载体，菌落检测、质粒提取后，用Xba1和Pst1双酶切检测（图2C），测序。
实施例4： SAT基因植物表达载体的构建
SAT基因植物表达载体的构建策略如图3所示。
将PCR所得基因全长连接入pMDl8-T载体，筛选正向阳性克隆进行菌液富集后提取质粒，并将质粒用PstI 和XbaI进行双酶切，将酶切后包含SAT全长的条带进行回收；然后用PstI 和XbaI酶切Surper1300+载体，将所得到的载体片段进行回收（图4A）。所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，再将二者连接后，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，获得SAT植物表达载体质粒1300-Surperpromoter-AgSAT。
用PstI 和XbaI进行双酶切检测后，均能得到1172bp的条带（图4B），确认是重组成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例5：用SAT基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体1300-Surperpromoter-AgSAT转入农杆菌（EHA105）中，在加有潮霉素的LB平板上筛选转化子，取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混合液落至杯底，将电转化杯置于电转化仪（BIO-RAD）滑槽中，用1mm的点击杯和200欧姆，2.5Kv/0.2cm的参数进行电击，点击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于加有潮霉素（Hyg， 10 μg/ml）的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先挑取农杆菌单菌落于20μlddH2O中，98℃处理15分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用特异性引物SAT3和SAT4进行PCR检测，转化成功的菌落能扩增出1172bp的条带，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例6：用含有SAT基因植物表达载体的农杆菌转化植物
首先挑取携带有1300-Surperpromoter-AgSAT质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB液体培养基（含Hyg， 10 μg/ml），180rpm，28℃培养2h，待菌液OD600至1.0左右，3500rpm，离心10min，沉淀菌体。再用10 ml的MS液体培养基悬浮菌体，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，重复以上操作2～3次；最后加入30 ml的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5，静置1 h备用。
本发明选取容易转化的植物烟草作为转化实验，制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，把无菌苗的叶片切成小片叶盘，将其用以上制备好的农杆菌菌液浸染20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1（MS+NAA0.21μg/ml+BAP0.02μg/ml）上黑暗共培养2天，将外植体转移至含潮霉素（10μg/ml）的芽诱导培养基MS4（MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml）上进行芽的诱导，获得转入SAT基因的植株。
实施例7： SAT基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测
为了确认从转化的烟草叶盘产生的转基因植株确实含有SAT基因，用PCR方法对筛选到的转基因植株作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取0.1 g植物叶片置于1.5 ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉状。加入900 μl预热到65℃ 的2×CTAB缓冲液（Tris-HCl pH7.5 100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2%），65℃ 水浴20 min，中间每隔2 min摇匀一次，取出冷却至室温，再加入500 μl氯仿：异戊醇（24：1）混合液，旋转摇匀，4 ℃, 7500 rpm，离心10 min，转移上清至一新的离心管，重复上述步骤。加入1/10体积3M pH5.2 NaOAc和等体积的异丙醇，摇匀后4℃，12000 rpm，离心20 min，弃上清，用75％乙醇清洗两次后干燥，用含有RNase的1×TE缓冲液溶解并降解RNA，取2μl以1%琼脂糖凝胶电泳检测（图5）。以植物基因组DNA为模板，用SAT基因内部部分序列的上下游特异性引物作PCR检测，成功转入SAT基因的植株均能扩增出1172bp的DNA条带，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察在含有SAT基因的转基因烟草株系中SAT基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于实时荧光定量PCR分析，检测SAT基因在转基因植物中的转录水平，采用ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪和SybrGreen qPCR Master Mix (ROX) (2x) 定量PCR试剂（睿安生物）。
用于实时定量PCR的引物。
16S （F）: 5’-CGTAGAGATTAGGAAGAACACCAGT-3’
16S（R）: 5’-CCATCGTTTACCGCTAGGAC-3’
SAT （F）: 5’-ACTCAGTGTCGTCAACCGCT-3’
SAT（R）: 5’-CCAACAACCACTCCAGTAGCA -3’
（1）配制PCR反应混合液（在冰上进行)，混合液体系如下：
（2）PCR扩增反应
采用两步法PCR扩增反应，扩增程序：
Stage1：(95℃10 see；60℃40 sec) 40 cyc1es
Stage2：95℃ 2 min
结果证明了SAT基因在WT株系中不表达，而转基因烟草植株中的SAT基因表达量分别显著高于WT，进一步证实所转的SAT基因cDNA已成功插入转基因烟草的基因组中(图6)。经Real-PCR确认的转基因植株用于进一步的生理生化分析。
实施例8：烟草叶片中SAT活性分析
为了在Real-PCR基础上，进一步考察转基因植株的SAT活性，分别剪取野生型和转基因烟草植株的鲜叶（由下往上数的第2-4片叶），用蒸馏水冲洗干净后吸水纸吸干，准确称量0.5 g鲜叶，加入5ml预冷的研磨缓冲液(10mM Na2EDTA，20 mM Tris-HCl (pH 7.6)，2mM DTT,0.01g/mL PVP)，冰浴快速研磨， 4℃17000rpm离心10min，取上清即为粗酶液。取粗酶液50μl 加入450μl 酶活测定液中(Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，63 mM；Na2-EDTA，1.25 mM；DTNB，1.25 mM；acetyl-CoA，0.1 mM；L-serine，1mM)，25℃水裕20分钟，加入500μl 4M HCI终止反应，如有悬浮物，10000g 离心1分种，取上清适量在232nm波长下测定吸光度，同时做粗酶液与不含丝氨酸的酶活测定液作空白对照，用对照的吸光度值减去处理的吸光度值，然后代入y=0.2405x-0.0062 (R2=0.9921)，计算出乙酰辅酶A减少量。酶活定义：25℃，pH7.6条件下，1分钟内分解1μmol乙酰辅酶A的酶量为l单位酶活。结果表明了WT烟草叶片中SAT酶活较低，和SAT1、SAT5及SAT7转基因烟草植株中叶片的SAT酶活差异显著(p＜0.05)， SAT1、SAT5及SAT7之间差异不显著(p＞0.05)。SAT1、SAT5及SAT7烟草叶片中SAT酶活分别显著高于对照24.13、24.05和24.05倍(图7)，说明了转基因烟草中SAT酶活增强。
实施例9：转基因植物在高硝酸盐环境条件下的生长情况
为了确认转SAT基因的植株确实具有生长优势，将转基因和野生型植株从培养基中取出，洗净根部琼脂，用0.1%多菌灵浸泡1min后，移栽到已消毒的v珍珠岩：v泥炭=1:1基质中进行炼苗2周，将烟草幼苗移到营养液中进行水培一周后进行100 mM NO3 -胁迫处理，正常营养液(15 mM NO3 -)作为对照，在培养一段时间后观察植物表型的变化。转SAT基因植物都比野生型植株长势好（图8-9），说明了在正常NO3 -水平和高浓度NO3 -胁迫下，过表达SAT基因的烟草植株都较WT的生物含量高；并在一定程度上缓解了NO3 -胁迫对烟草生长的影响。
实施例10：转基因烟草植株SAT酶活的测定
为了考察转基因植株在高硝酸盐环境条件下SAT的活性，取正常生长和经100 mM NO3 -处理的野生型和转基因烟草植株的根系0.5 g，测定方法同上（实施例8）。结果表明随着NO3 -浓度的增加，WT、SAT1、SAT5及SAT7烟草植株根系中的SAT酶活呈上升趋势，无论是在15或100mM NO3 -下，WT植株根系中的SAT酶活为最低。15 mM NO3 -处理下，SAT1、SAT5及SAT7植株根系中SAT酶活分别显著高于WT 25.63、24.68和24.5倍(p＜0.05)，100 mM NO3 -处理下，SAT1、SAT5及SAT7植株根系中SAT酶活分别显著高于WT 19.26、19.04和19.34倍(图10)。说明了高浓度NO3 -胁迫刺激了SAT酶活，过表达SAT基因的烟草植株较WT的SAT酶活高。
实施例11：转基因植物还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定
为了确认转入基因是否对植株GSH含量造成影响，取正常生长和经100 mM NO3 -处理的野生型和转基因烟草植株的根系0.2 g在冰浴中用1 mL 5%磺基水杨酸研磨匀浆。然后在4℃用13000 × g离心15 min，取0.25 mL样品测定GSH含量，GSH的含量用GSH试剂盒（南京建成）依照操作说明测定，结果说明了在正常生长条件下，WT和转基因烟草的降低活性氧水平的常见抗氧化物质（GSH）含量较低，而在高硝酸盐胁迫的环境中，WT和转基因烟草的抗氧化物质（GSH）增强，但转基因烟草植株根系GSH显著高于WT（图11），表明了转基因株系对缓解氧化胁迫对烟草的毒害中起了较强的作用，增强了对硝酸盐胁迫的耐受性。
实施例12：转基因植物H2O2和MDA含量的测定
为了确认转入基因是否对植株H2O2含量造成影响，故选取野生型植物和转基因植物的幼根1g，液氮充分研磨，加入4ml磷酸钾缓冲液（KH2PO4 0.27g， K2HPO4 1.83g，PH7.6）充分研磨，4℃，12000rpm离心20min，吸取上清保存至另一新的EP管中，-20℃保存备用。
H2O2含量采用二甲酚橙法进行测定。用MiliQ 水配制试剂 A（内含3.3 mMFeSO4, 3.3 mM (NH4)2SO4, 412.5 mM H2SO4）和试剂B（内含165 μ M 二甲酚橙，165 mM 山梨醇）。使用前将试剂A 和试剂B 按照1:10 的比例混合作为实验试剂。此实验试剂与H2O2 待测液按照2:1 的比例混合，30℃水浴显色30 min 后，测定560nm 处光吸收值OD560，按照标准曲线y=0.1734x-0.0055（x: H2O2 浓度（mg/mL），y: OD625，R2=0.9995）计算H2O2 含量。
MDA含量测定：取1 mL 抽提液加入1 mL 含有0.6%TBA（硫代巴比妥酸）的20%TCA（三氯乙酸）溶液中，沸水浴15 min 后立即置于冰上冷却。12000rpm 离心10 min，取上清液在532 nm和450 nm 处测定光吸收值。MDA 浓度按如下公式计算：MDA 浓度（μmol·L-1）= 6.45OD532-0.56OD450。然后再根据样品质量和加入抽提液的体积计算出MDA终浓度。结果（图12-13）证明了转基因植株具有较好的活性氧清除能力。在高浓度硝酸盐胁迫下，SAT基因缓解了转基因植株细胞膜的伤害，是转基因植株具有较高抗性的原因之一。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体及其应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gactctagac gacatcgatt tttttttttt ttttt 35
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actacgccac aaccaacagc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctttctccaa tgatgctgct c 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttctgtctga aagcaaatc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agcgaatgga gcacataaac t 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtagagatt aggaagaaca ccagt 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccatcgttta ccgctaggac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actcagtgtc gtcaaccgct 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccaacaacca ctccagtagc a 21
Claims (2)
1.一种丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体，其特征在于：含有丝氨酸乙酰转移酶SAT基因，在SAT基因前端为3个章鱼碱合成酶启动子Aocs、甘露碱合成酶启动子Amas和甘露碱合成酶启动子组成的组成型超强启动子。
2.权利要求1所述的丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体在制备耐盐的转基因植株中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150128 Termination date: 20200417 |