CN117947080A - Nest1基因在调节水稻耐盐性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用，所述蛋白质为氨基酸序列是序列表中的序列1的蛋白质。本发明还提供一种调控植物抗逆性的方法，所述方法包括：通过调控受体植物中所述蛋白编码基因的表达或调控所述蛋白的活性或含量，来调控受体植物的抗逆性。本发明首次揭示了NEST1蛋白在水稻耐盐性性能调控中的作用，在籼粳稻背景下敲除NEST1可以提高水稻耐盐性，超表达NEST1降低水稻耐盐性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程育种领域，具体涉及NEST1基因在调节水稻耐盐性中的应用。
背景技术
在水稻的生长发育过程中会受到各种各样的非生物胁迫，如高盐、高温、干旱及冷害等。水稻是一种对盐胁迫中度敏感的作物，土壤盐化自然也成为了影响水稻产量的主要不利因素之一。另外随着城市化和工业化的进程，土壤盐碱化已成为全球性问题，严重限制了水稻的种植面积。
盐胁迫是由土壤或溶液中高浓度的盐离子引发而产生的对作物的危害作用，其中的特征离子为Na+。盐胁迫对水稻的危害主要包括高浓度Na+离子引起的毒害作用和渗透胁迫、离子失衡和营养缺乏，盐胁迫几乎影响水稻所有的生长代谢过程。在盐胁迫下，水稻会产生各种生理生化变化。根据前人的研究，盐胁迫对水稻的伤害机制主要有以下几方面：(1))过多的盐离子破坏水稻细胞质膜的完整性，导致其选择透过性能下降直至消失，从而使细胞内Na+、Cl-等离子大量积累，K+、Ca2+等营养元素则大量外渗，引起细胞内离子浓度的动态平衡失调，破坏细胞膜和细胞器的结构，引起叶片的气孔导度、叶绿素含量以及核酸含量等下降，引发一系列的代谢紊乱，使细胞的功能下降，加速衰老或死亡；(2)高盐降低土壤溶液的水势，形成水分胁迫，使水稻根部吸水困难，细胞内盐分浓度提高，从而生理代谢失调，进而影响水稻的出苗和生长发育；(3)盐分胁迫促使活性氧O2 -、H2O2、·OH等的产量增加，破坏或减弱细胞内抗氧化系统如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POX)、谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(ASC)等的活性或含量，从而影响体内活性氧代谢系统的平衡；活性氧含量的增加能加剧膜质过氧化，破坏膜的完整性，选择透过性丧失，电解质及某些小分子有机物大量渗入，物质交换平衡被破坏；(4)盐胁迫降低了光合速率，同化物和能量的供给减少，抑制蛋白质的合成，此外水稻为了适应高盐环境和维持其生长，需要消耗更多的能量来进行离子的主动吸收和运输、区域化分配以及渗透调节物质的合成，从而限制水稻的生长发育，大大影响其生产量和品质。
盐胁迫影响水稻种子的萌发率、早期营养生长阶段和生殖生长阶段的生长发育。水稻在不同生长阶段对盐胁迫的耐受性不同，萌发期、分蘖期和成熟期对盐胁迫耐受性强，而苗期(1～3周)和开花授粉期对盐胁迫较为敏感，因此苗期和生殖期的耐受性是培育耐盐品种的关键时期。
水稻对盐胁迫的应答和耐盐性是近年来研究的一个重点和难点。耐盐性是水稻能在高盐基质上生长，并忍耐或抵抗耐盐胁迫并完成整个生命周期的能力。水稻的耐盐性是多个生理过程综合作用的表现，深入开展水稻对盐胁迫的适应和耐盐性的研究，对培育耐盐水稻品种，进一步扩大水稻的可种植面积，保证粮食的安全生产和品质具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何调控植物的抗逆性，例如如何提高植物的耐盐性。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：
A1)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；
A2)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；
A3)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育耐盐植物中的应用；
A4)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
A5)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)、氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
D2)、序列表中序列1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗逆性相关的蛋白质；
D3)、在D1)或D2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
进一步地，所述蛋白质来源于水稻。
进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)、编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)、抑制或降低所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)、含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
进一步地，上述的应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的DNA分子：
b1)、编码链的编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
b2)、编码链的核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b3)、与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；
B8)所述核酸分子为表达靶向所述蛋白质的编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向所述蛋白编码基因的gRNA。
进一步地，上述的应用中，所述gRNA的靶标序列为T1)和/或T2)：
T1)、核苷酸序列是序列表中序列3第157～176位的DNA分子；
T2)、核苷酸序列是序列表中序列3第1922～1941位的DNA分子。
进一步地，上述的应用中，所述植物为下述任一种：
P1)、单子叶植物，
P2)、禾本目植物，
P3)、禾本科植物，
P4)、稻属植物，
P5)、水稻。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述应用中的所述蛋白质或上述应用中的所述生物材料。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供一种调控植物抗逆性的方法，所述方法包括：通过调控受体植物中所述蛋白编码基因的表达或调控所述蛋白的活性或含量，来调控受体植物的抗逆性。
进一步地，上述的方法包括：
F1)向受体植物中导入上述应用中B8)所述的核酸分子，抑制或降低受体植物中所述蛋白编码基因的表达或所述蛋白的活性或含量，得到抗逆性高于受体植物的目的植物；
F2)向受体植物中导入上述应用中B1)所述的核酸分子，促进或提高受体植物中所述蛋白编码基因的表达或所述蛋白活性或含量，得到抗逆性低于所述受体植物的目的植物。
进一步地，上述的方法中，所述抑制或降低受体植物中所述蛋白编码基因的表达或所述蛋白的活性或含量为将受体植物中核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子进行M1)～M4)中的任意一项突变：
M1)、将序列3的第172位、第173位和第1938位核苷酸缺失。
M2)、将序列3的第172位、第173位和第1936～1938位核苷酸缺失；
M3)、将序列表中序列3的第173位和第1938位核苷酸缺失；
M4)、将序列表中序列3的第172～174位和第1934～1938位核苷酸缺失；
所述植物可为水稻。
M1)所述突变导致水稻中所述蛋白质的编码基因即序列表中序列2的第42位、第43位和第244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除；
M2)所述突变导致水稻中所述蛋白质的编码基因即序列表中序列2的第42位、第43位和第222～244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除；
M3)所述突变导致水稻中所述蛋白质的编码基因即序列表中序列2的第43位和第244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除；
M4)所述突变导致水稻中所述蛋白质的编码基因即序列表中序列2的第42～44位和第240～244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除。
为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供一种培育耐盐性植物的方法，包括下调或抑制受体植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到耐盐性植物，所述耐盐性植物的耐盐性高于所述受体植物。
进一步地，所述下调或抑制受体植物中的所述蛋白质的编码基因的表达量可通过向受体植物中导入靶向所述蛋白质的编码基因的gRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因得到耐盐性植物。
进一步地，所述gRNA的靶标序列为：为T1)和/或T2)：
T1)、核苷酸序列是序列表中序列3第157～176位的DNA分子；
T2)、核苷酸序列是序列表中序列3第1922～1941位的DNA分子。
进一步地，所述gRNA的核苷酸序列如序列表中序列4和/或5所示。
进一步地，所述耐盐性植物中所述蛋白的编码基因产生M1)～M4)中的任意一项突变：
M1)、将序列3的第172位、第173位和第1938位核苷酸缺失。
M2)、将序列3的第172位、第173位和第1936～1938位核苷酸缺失；
M3)、将序列表中序列3的第173位和第1938位核苷酸缺失；
M4)、将序列表中序列3的第172～174位和第1934～1938位核苷酸缺失；
所述植物可为水稻。
本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本发明中，所述60％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本发明中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(gene-knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
本发明中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本发明中，所述植物育种的育种目的为获得抗逆性提高的植物，例如获得耐盐性提高的植物。
本发明取得的有技术效果如下：
1、本发明首次揭示了NEST1蛋白在水稻耐盐性性能调控中的作用，在籼粳稻背景下敲除NEST1可以提高水稻耐盐性，超表达NEST1降低水稻耐盐性；
2、本发明提供了调控水稻耐盐性水平的方法，包括提高水稻的耐盐性获得耐盐性水平提高的水稻的方法。
附图说明
图1为重组质粒物理图谱。图1中A为pCRISPR-NEST1重组质粒图谱，T1表示CRISPR靶点1，T2表示CRISPR靶点2；图1中B为pUN1301-NEST1重组质粒图谱。
图2为NEST1敲除株系靶点测序鉴定。图2中A为NIP背景下敲除株系测序鉴定结果；图2中B为GLA4背景下敲除株系测序鉴定结果。
图3为NEST1超表达株系表达量鉴定。图3中A为ZH10背景下超表达植株中NEST1相对表达量；图3中B为GLA4背景下超表达植株中NEST1相对表达量。
图4为NEST1转基因株系耐盐性检测。图4中A为NIP背景下敲除株系盐处理前后的生长状态和存活率；图4中B为GLA4背景下敲除株系盐处理前后的生长状态和存活率；图4中C为ZH10背景下超表达株系盐处理前后的生长状态和存活率；图4中D为GLA4背景下超表达株系盐处理前后的生长状态和存活率。bar＝5cm，显示的值为平均值±标准差，n＝3。*，差异显著，P<0.05；**，差异极显著，P<0.01，统计分析方法为单因素方差分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)，***表示具有极显著性差异(P＜0.001)。
CRISPR/Cas载体BGK03购买于杭州百格生物技术有限公司，产品目录号BGK03。pUN1301载体为UBIQUITIN启动子驱动的双元超表达载体，由本实验室保存，记载该载体的文献为Chen et al.,Overexpression of OrbHLH001,a putative helix–loop–helixtranscription factor,causes increased expression of AKT1 and maintains ionicbalance under salt stress in rice.J Plant Physiol 2013,170:93-100。pYLsgRNA-OsU3是刘耀光研究员馈赠的质粒，记载该载体的文献为Ma et al.,A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot anddicot plants.Mol Plant 2015,8:1274-84。
转基因受体粳稻品种日本晴(NIP)、中花10号(ZH10)和籼稻品种广陆矮4号(GLA4)均有本实验室保存。记载NIP和ZH10的文献是Ma et al.,COLD1 confers chillingtolerance in rice.Cell 2015,160:1209-1221。记载GLA4的文献是Yang et al.,TheRING E3 ligase CLG1 targets GS3 for degradation via the endosome pathway todetermine grain size in rice.Mol Plant 2021,14:1699-1713。
N6D2培养基：含300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、30g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的固体MS培养基。
N6D2S1培养基：含25mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的N6D2培养基。
N6D2S2培养基：含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的N6D2培养基。
分化培养基A：含300mg/L水解酪蛋白、50mg/L潮霉素、1mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/L ZT、0.25mg/L NAA、30g/L蔗糖和30g/L山梨醇的N6D2培养基。
分化培养基B：含300mg/L水解酪蛋白、50mg/L潮霉素、1mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/L ZT、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和20g/L山梨醇的N6D2培养基。
生根壮苗培养基：含1mg/L多效唑和0.5mg/L NAA的固体1/2MS培养基。
木村B培养液的配方见表1，pH值为5.8，溶剂为dH2O。
表1.木村B培养液的配方
实施例1、目的蛋白及相关序列信息
水稻日本晴中的NEST1蛋白如序列1所示。水稻日本晴的cDNA中编码NEST1蛋白的编码序列(CDS)如序列2所示。水稻日本晴的基因组DNA中编码NEST1蛋白的基因如序列3所示。具体的氨基酸序列和核苷酸序列如表2所示。
表2.氨基酸和核苷酸序列表
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实施例2、实验方法
2.1、植物DNA提取
以生长至三叶期的日本晴作为提取核酸的样品。剪取2cm叶片加入100μL TPS提取液(12.1g/L Tris-HCl，3.72g/L EDTA，74g/L KCl，pH 8.0)；放入一颗5mm钢珠，在组织研磨仪中30rpm震荡3min；提取适量浸出液到新的PCR板内，加入4倍体积的ddH2O，混匀后备用。
2.2、植物总RNA提取及反转录
北京庄盟植物RNA提取试剂盒(ZP405K)用于RNA提取，北京翊圣反转录试剂盒(11123ES60)用于反转录，具体操作如下：
快速剪取适量植物组织放入2mL研磨离心管内液氮速冻，而后在低温冷冻研磨仪中充分研磨，加入1mL低温预冷的裂解液R；震荡混匀后加入200μL氯仿，震荡混匀；12000rpm离心5min，此时上清分为三层，RNA在上层水相中；吸取上层水相于新的EP管内，加入0.5倍体积的乙醇，混匀；吸取混合后的溶液到吸附柱内(吸附柱放入收集管内)，12000rpm离心1min，去除滤液；加入500μL清洗液PW，12000rpm离心1min，去除滤液；重复清洗一次；将吸附柱放入收集管内12000rpm离心2min，去除残余液体；吸附柱放入新的EP管内，加入50μLddH2O(RNAase-free)，12000rpm离心1min收集RNA；根据提取的RNA浓度加入适宜量的RNA，加入1μL gDNA digester和2μL 5×gDNA digester Buffer，ddH2O(RNAase-free)补齐到10μL，混匀；42℃反应2min；加入10μL 2×SuperMix plus，混匀；25℃反应5min，42℃反应30min，85℃反应5min，获得cDNA。
2.3、PCR扩增
反应体系如下：10μL预混合Mix，0.6μL 10μM引物，适量模板，ddH2O补齐到20μL。
反应程序如下：1，95℃3min；2，95℃30s,；3，50℃～60℃30s；4，72℃适宜时间；5，72℃10min；步骤2至步骤4设置30－35个循环。
2.4、荧光实时定量PCR(qRT-PCR)
根据目标基因设计引物；将合成的cDNA原液稀释20倍后备用；配制20μl反应体系：10μL SYBR Green Mix，0.5μL 10μM引物，适量cDNA模板，ddH2O补齐到20μL；混匀后进行反应：1，95℃3min；2，95℃15s,；3，55℃15s；4，72℃15s；5，95℃30s，6，58℃30s；步骤2至步骤4设置42个循环。
以水稻UBIQUITIN为内参基因，利用ΔΔCt方法计算基因相对表达量。
2.5、CRISPR敲除载体构建的边切边连方法
反应体系如下：
载体100～200ng
PCR扩增DNA 10～20ng
反应缓冲液1μL
BsaI(Eco31I)0.5μL
T4 ligase 2.5μL
ddH2O补齐到10μL
边切边连反应程序：
37℃5min
20℃5min
10cycles
37℃5min。
2.6、核酸纯化回收
按照OMEGA(美国)胶回收试剂盒(D2500-01)进行：核酸电泳结束后在切胶仪下切取目的条带的凝胶，加入适量的Binding Buffer，放置在55℃下溶解凝胶；将完全融化的凝胶溶液转移至吸附柱(吸附柱放置在收集管内)，12000rpm离心1min；去除滤液，再加入300μL Binding Buffer；12000rpm离心1min，去除滤液；加入500μL Wash Buffer，12000rpm离心1min，去除滤液；重复清洗一次；将吸附柱重新放入收集管内，12000rpm离心2min，彻底去除残余液体；将吸附柱放入新的EP管内，加入约50μL ddH2O，12000rpm离心1min，收集核酸溶液。
2.7、酶切反应
酶切体系为：核酸10μL，酶切缓冲液5μL、内切酶2μL、ddH2O补充反应体系至50μL，37℃酶切2个小时。琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行纯化回收。
2.8、重组连接
超表达载体构建策略采用Gibson组装的方法参考北京全式金公司的重组连接试剂盒(CU101-02)说明：根据重组连接的方法设计合成引物，利用PCR扩增目的条带，凝胶回收纯化；载体质粒经过特异性限制性内切酶线性化，凝胶回收纯化；将纯化的PCR产物和线性化的载体质粒用北京全式金公司的重组连接试剂盒进行重组连接；连接产物转化DH5α感受态，涂布相应抗性的LB培养基，37℃培养；挑选测序正确的菌株，保存备用。
实施例3、转基因载体pCRISPR-NEST1和pUN1301-NEST1的构建
3.1、敲除载体pCRISPR-NEST1载体构建
选择NEST1的如下两个序列作为敲除载体的靶序列：
5’-GTCCTCCTCCGGAGATGTCG-3’(靶点1，序列3第157～176位)；
5’-GGTTTCAAAGGGGAGGGAAG-3’(靶点2，序列3第1922～1941位)。
委托生物公司合成单链DNA分子Ⅰ和合成单链DNA分子Ⅱ，用单链DNA分子Ⅰ和单链DNA分子Ⅱ作为引物，以质粒pYLsgRNA-OsU3作为模板，进行PCR扩增获得结构为：“靶点1-sgRNA-U3-靶点2”的双链DNA分子，该双链DNA分子的核苷酸序列是表3中的序列6，并回收纯化该双链DNA分子。
其中单链DNA分子Ⅰ的核苷酸序列如下：5’-GCAGGTCTCATGTGGTCCTCCTCCGGAGATGT CGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；
单链DNA分子Ⅱ的核苷酸序列如下：5’-GCAGGTCTCTAAAACCTTCCCTCCCCTTTGAAACCTGCCACGGATCATCTGCA-3’。
采用实施例2中2.5所示的边切边连的方法将扩增得到的双链DNA分子与载体BGK03连接，获得连接产物，将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，将测序正确的载体质粒命名为pCRISPR-NEST1，其物理图谱如图1中A所示。重组质粒pCRISPR-NEST1结构为：将核苷酸序列是序列表中序列6第11～584位所示的DNA分子插入载体BGK03的BsaI(Eco31I)酶切位点之间，保持载体BGK03的其它核苷酸序列不变得到的重组质粒。重组质粒pCRISPR-NEST1可表达核苷酸序列是序列表中序列4和序列5所示的sgRNA基因和Cas9蛋白。
表3.序列4、序列5和序列6
3.2、超表达载体pUN1301-NEST1的构建
利用Gibson组装的方法构建超表达载体。根据重组连接的方法设计合成引物对“(5’-GCAGGTCGACTCTAGAggatccATGGCTGGTCCTCCTCCGCA-3’和5’-GGGGAAATTCGAGCTCggtaccTCATAGGTCCAACGGAGGTG-3’)，以水稻cDNA为模板PCR扩增序列2，并凝胶回收纯化；用限制性内切酶BamHⅠ和KanⅠ对质粒pUN1301进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收纯化；将纯化的PCR产物和线性化的载体质粒用重组连接试剂盒进行重组连接；得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，将测序正确的载体质粒命名为pUN1301-NEST1，其物理图谱如图1中B所示。根据测序结果，对重组质粒pUN1301-NEST1进行结构描述如下：pUN1301-NEST1是用核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子替换质粒pUN1301的限制性内切酶BamHⅠ和KanⅠ酶切识别位点间的片段(KanⅠ和BamHⅠ酶切识别位点间的小片段)，保持质粒pUN1301的其它核苷酸序列不变，得到的重组表达质粒。重组质粒pUN1301-NEST1具有序列表中序列2所示的DNA分子，表达氨基酸序列是序列表中序列1所示的NEST1蛋白。
实施例4、转基因水稻的获得
1、将上述pCRISPR-NEST1和pUN1301-NEST1质粒用化学法转化农杆菌EHA105，经含卡那霉素和利福平霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的工程菌，分别是含有pCRISPR-NEST1的重组农杆菌和含有pUN1301-NEST1的重组农杆菌。
2、取步骤1得到的pCRISPR-NEST1重组农杆菌的菌液，对粳稻日本晴(NIP)、和籼稻广陆矮4号(GLA4)的愈伤组织进行浸染；取pUN1301-NEST1重组农杆菌的菌液对粳稻中花10(ZH10)和籼稻广陆矮4号(GLA4)的愈伤组织进行浸染；然后用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤侵染后的愈伤组织4～5遍，无菌滤纸吸干多余水分，然后转移至N6D2S1培养基上，培养2周。
3、完成步骤2后，取愈伤组织，转移到N6D2S2培养基上培养2周，然后转移到新的N6D2S2培养基上培养2周。
4、完成步骤3后，取生长旺盛的愈伤组织，转移到分化培养基A上培养7d，然后转移到分化培养基B上培养至长出再生苗。培养条件：12小时光照/12小时黑暗；光照强度为8000lux；光照时温度为28℃，黑暗时温度为25℃。
5、完成步骤4后，将再生苗转移到生根壮苗培养基上进行培养，待小苗长至10cm左右时，打开容器封口膜，炼苗2～3d，然后将小苗移入人工气候室栽培。得到T0代NEST1超表达转基因水稻(由pUN1301-NEST1的重组农杆菌介导得到的转化植株)、T0代NEST1基因敲除日本晴水稻(由pCRISPR-NEST1的重组农杆菌介导得到的转化日本晴植株)、T0代NEST1基因敲除广陆矮4号水稻(由pCRISPR-NEST1的重组农杆菌介导得到的转化广陆矮4号植株)。
将T0代NEST1超表达转基因水稻和T0代NEST1基因敲除水稻分别进行培养收获种子，为T1代。将T1代种子在人工气候室培养收获T1代单株，各T1代单株收获的种子分别播种，并进行分子鉴定，鉴定到纯合单株后继续培养，收获纯合T2代种子。随机选取2个T2代NEST1基因敲除日本晴水稻纯系，分别命名为KO-5和KO-6；随机选取2个T2代NEST1基因敲除广陆矮4号水稻纯系，分别命名为KO-4和KO-8。
随机选取2个T2代NEST1超表达转基因ZH10水稻纯系，分别命名为OE6和OE7。随机选取3个GLA4中超表达NEST1基因的GLA4水稻纯系OE1-7、OE5-6和OE6-3。
实施例5、转基因水稻的鉴定
5.1、CRISPR敲除植株测序鉴定
将获得的NIP背景下的敲除植株T2代中编号为KO-5和KO-6的植株提取叶片的基因组DNA为模板，采用如下两对引物“F1+R1”和“F2+R2”进行PCR扩增靶点并测序鉴定。
F1：5’-CCATTCAACACCCAAACGCC-3’；
R1：5’-GATATGTGCAACTGCCAAGC-3’；
F2：5’-ATATCCTTTAACCAGTGCTC-3’；
R2：5’-CCTTCTACCAAAAGGGACAC-3’；
测序结果发现和日本晴水稻相比，KO-5在靶点1和靶点2分别缺失2-bp和1-bp，KO-6在靶点1和靶点2分别缺失2-bp和3-bp(图2中A)。
相比于日本晴野生型，KO-5植株的区别如下：对于NEST1基因，KO-5植株中两条同源染色体中的NEST1基因突变形式是序列表中序列3的第172位、第173位和第1938位核苷酸缺失，其编码序列是将序列表中序列2的第42位、第43位和第244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除。
相比于日本晴野生型，KO-6植株的区别如下：对于NEST1基因，KO-6植株中两条同源染色体中的NEST1基因突变形式是序列表中序列3的第172位、第173位和第1936～1938位核苷酸缺失，其编码序列是将序列表中序列2的第42位、第43位和第222～244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除。
同样鉴定在GLA4背景下敲除株系KO-4在靶点1和靶点2都缺失1-bp，KO-8在靶点1和靶点2分别缺失3-bp和4-bp(图2中B)。
相比于GLA4野生型，KO-4植株的区别如下：对于NEST1基因，KO-4植株中两条同源染色体中的NEST1基因突变形式是序列表中序列3的第173位和第1938位核苷酸缺失，其编码序列是将序列表中序列2的第43位和第244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除。
相比于GLA4野生型，KO-8植株的区别如下：对于NEST1基因，KO-8植株中两条同源染色体中的NEST1基因突变形式是序列表中序列3的第172～174位和第1934～1938位核苷酸缺失，其编码序列是将序列表中序列2的第42～44位和第240～244位核苷酸缺失，该突变导致NEST1编码基因的翻译产生移码突变，从而实现NEST1基因敲除。
5.2、定量PCR鉴定
ZH10背景下超表达转基因株系OE6和OE7的T2代的幼苗中提取总RNA并反转录合成cDNA，将反转录产物稀释50～100倍，取5μl做模板按照实施例2中2.4所示的方法进行定量PCR鉴定。
其中qRT-PCR引物序列‘(5’–3’)如下：
qNEST1-F：5’-ATACTTGATCTTTTCTTCGT-3’；
qNEST1-F：5’-CGTTCAATTTCATATTATTA-3’；
qUBIQUITIN-F：5’-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3’；
qUBIQUITIN-R：5’-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3’。
结果如图3中A所示，OE6和OE7中NEST1的相对表达量分别是ZH10的230倍和269倍，说明NEST1在转录水平已经成功超表达。
采用同样的方法鉴定到在GLA4超表达NEST1基因获得3个T2代NEST1转基因水稻纯系OE1-7、OE5-6和OE6-3中NEST1相对表达量分别是GLA4的169倍、29倍和209倍(图3中B)，说明在上述株系中NEST1在转录水平已经成功超表达。
实施例6、转基因水稻的盐处理
光暗交替培养的参数如下：光照强度为120μmol·m-2·s-1，温度为28℃/25℃(白天/黑暗)，光周期10h光照/14h黑暗。
待测水稻种子为NEST1各转基因株系及其背景材料，共分为四组：分别如下：
第一组：敲除株系KO-5和敲除株系KO-6，NIP野生型(NIP)；
第二组：敲除株系KO-4和敲除株系KO-8，GLA4野生型(GLA4)；
第三组：超表达株系OE6和超表达株系OE7，中花10号野生型(ZH10)；
第四组：超表达株系OE1-7、超表达株系OE5-6和超表达株系OE6-3，GLA4野生型(GLA4)；
实验重复3次取平均值，每次重复的步骤如下：
1、分别取待测水稻种子各24粒，分装种子于牛皮纸袋中，放于28℃～30℃水中浸种48h。
2、完成步骤1后，将种子在28℃～30℃条件下催芽24h(催芽过程中需保持种子湿润)，获得已催芽的种子。
3、完成步骤2后，取96孔板，每孔剪去部分下缘，然后每孔放入1粒已催芽的种子(胚芽向上、胚根向下)。
4、完成步骤3后，将所述96孔板(其上有已催芽的种子)置于盛有木村B培养液的塑料盒上并使已催芽的种子浸于木村B培养液，光暗交替培养3周，得到生长至三叶期阶段的水稻幼苗。光暗交替培养期间，每隔7d需更换木村B培养液。
5、完成步骤4后，将所述96孔板(其上有生长至三叶期阶段的水稻幼苗)置于盛有含200mM NaCl的木村B培养液(向木村B培养液中添加NaCl至NaCl的含量为200mM得到的培养液)的塑料盒上并使根部完全浸于含200mM NaCl的木村B培养液，在光暗交替培养下进行高盐胁迫(高盐胁迫期间，每隔3d更换一次含200mM NaCl的木村B培养液)，高盐胁迫培养的时间根据水稻不同而有差异：其中第一组高盐胁迫条件下培养10天、第二组高盐胁迫条件下培养8天、第三组高盐胁迫条件下培养6天、第四组高盐胁迫条件下培养4天。
6、完成步骤5后，将所述96孔板(其上有水稻幼苗)置于盛有木村B培养液的塑料盒上并使根部完全浸于木村B培养液，光暗交替培养下恢复15d。
完成步骤6的第二天观察水稻幼苗的生长状态并统计存活率。存活率＝存活的水稻幼苗数/24×100％。
结果表明，200mM NaCl盐溶液处理10d后，NIP的存活率为10.1％，NIP背景下NEST1敲除株系KO-5的存活率为41.8％，KO-6的存活率为42.4％(图4中A)；200mM NaCl盐溶液处理8d后，GLA4的存活率为10.7％，GLA4背景下NEST1敲除株系KO-4的存活率为38.8％，KO-8的存活率为39.4％(图4中B)。表明在籼粳稻背景下敲除NEST1株系的耐盐性得到了显著的提高。
200mM NaCl盐溶液处理6d后，ZH10的存活率为37.7％，ZH10背景下NEST1超表达株系OE6和OE7的存活率均为0(图4中C)；200mM NaCl盐溶液处理4d后，GLA4的存活率为42％，GLA4背景下NEST1超表达株系OE1-7的存活率为3.4％，OE5-6的存活率为0，OE6-3的存活率为5.1％(图4中D)。以上结果表明在籼粳稻背景下超表达NEST1株系的耐盐性显著降低。
以上结果可以看出，在籼粳稻背景下敲除NEST1可以提高水稻耐盐性，超表达NEST1降低水稻耐盐性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
A1)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；
A2)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；
A3)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育耐盐植物中的应用；
A4)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
A5)、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)、氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
D2)、序列表中序列1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗逆性相关的蛋白质；
D3)、在D1)或D2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)、编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)、抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)、含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的DNA分子：
b1)、编码链的编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
b2)、编码链的核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b3)、与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
B8)所述核酸分子为表达靶向权利要求1中所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向权利要求1中所述蛋白编码基因的gRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述gRNA的靶标序列为T1)和/或T2)：
T1)、核苷酸序列是序列表中序列3第157～176位的DNA分子；
T2)、核苷酸序列是序列表中序列3第1922～1941位的DNA分子。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：
P1)、单子叶植物，
P2)、禾本目植物，
P3)、禾本科植物，
P4)、稻属植物，
P5)、水稻。
6.权利要求1所述应用中的所述蛋白质或权利要求2～4中任一项所述应用中的所述生物材料。
7.一种调控植物抗逆性的方法，其特征在于：所述方法包括：通过调控受体植物中权利要求1-5中所述应用中所述蛋白编码基因的表达或调控所述蛋白的活性或含量，来调控受体植物的抗逆性。
8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法包括：
F1)向受体植物中导入权利要求2～4中任一项应用中B8)所述的核酸分子，抑制或降低受体植物中权利要求1所述蛋白编码基因的表达或权利要求1所述蛋白的活性或含量，得到抗逆性高于受体植物的目的植物；
F2)向受体植物中导入权利要求2或3所述应用中B1)所述的核酸分子，促进或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白编码基因的表达或权利要求1中所述蛋白活性或含量，得到抗逆性低于所述受体植物的目的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低受体植物中权利要求1所述蛋白编码基因的表达或权利要求1所述蛋白的活性或含量为将受体植物中核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子进行M1)～M4)中的任意一项突变：
M1)、将序列3的第172位、第173位和第1938位核苷酸缺失。
M2)、将序列3的第172位、第173位和第1936～1938位核苷酸缺失；
M3)、将序列表中序列3的第173位和第1938位核苷酸缺失；
M4)、将序列表中序列3的第172～174位和第1934～1938位核苷酸缺失；
所述植物为水稻。
10.一种培育耐盐性植物的方法，包括下调或抑制受体植物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达量，得到耐盐性植物，所述耐盐性植物的耐盐性高于所述受体植物。
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