CN103103166B - 植物耐逆性相关蛋白TaNCED1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaNCED1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白TaNCED1来源于小麦，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成，其编码基因是序列表中序列1所示的DNA分子。实验证明，将含有序列表序列1所示DNA分子的重组表达载体pCAMBIA1301-TaNCED1转化烟草得到的T₂代纯合转基因植株，其耐旱性和耐盐性明显高于相同条件下的野生型烟草植株。本发明在提高植物耐逆性方面具有重要意义。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaNCED1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaNCED1及其编码基因与应用。

背景技术

植物的生长发育受内部信号和外部环境条件的双重调节，其中脱落酸（ABA）在植物对环境的响应中起重要的调节作用，ABA参入细胞的许多生理过程，包括种子的发育、休眠、营养生长以及环境胁迫反应。如此多的生理功能使得ABA的产生、降解、信号感应和传导变得非常复杂。有关ABA合成途径的研究早在上世纪60年代被发现以后就开始了，通过遗传和生化研究，目前，ABA在高等植物中的合成途径已经清楚。ABA的生物合成一般有两条途径：C15直接途径和C40间接途径，前者经C15法呢焦磷酸（FPP）直接形成ABA，后者经由类胡萝卜素的氧化裂解间接形成ABA，是高等植物ABA合成的主要途径，9-顺式环氧类胡萝卜素氧化裂解为黄质醛，然后黄质醛被氧化形成一种酮，该过程需要NAD为辅助因子，酮再转换为ABA-醛，ABA-醛氧化最终形成ABA，该途径中玉米黄质环氧化酶（ZEP）、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）和醛氧化酶（AO）可能起重要作用。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是ABA合成的关键酶，目前编码NCED的基因在玉米、水稻、大麦等重要的粮食作物中已经得到克隆，而作为三大粮食作物之一的小麦其ABA合成过程的关键基因研究较少，至今未见有关NCED基因在小麦中得到克隆的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaNCED1及其编码基因与应用。

本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白质，来源于小麦，名称为TaNCED1，该蛋白质为如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由（a）衍生的蛋白质。

序列表序列2所示的氨基酸序列由615个氨基酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。

所述蛋白质的编码基因为如下1）或2）或3）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列1由1848个脱氧核苷酸组成，是小麦蛋白TaNCED1的编码序列。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

本发明保护含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

所述重组载体具体可为在载体pCAMBIA1301的XbaI和KpnI位点间插入所述基因得到的重组载体。

本发明所提供的所述蛋白质及所述基因可用于调控目的植物的抗逆性。

本发明的另一个目的是提供一种培育高抗逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：在所述目的植物中导入所述基因，得到抗逆性高于所述目的植物的转基因植物。

本发明还提供一种提高目的植物抗逆性的方法，包括在所述目的植物中导入所述基因的步骤。

在上述方法或应用中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在上述方法或应用中，所述双子叶植物具体可为烟草（Nicotiana tobacum）。

上述抗逆性可为抗旱性和/或抗盐性。所述抗旱性具体可为耐PEG胁迫，所述抗盐性中的NaCl浓度具体可为50—200mM/L。

实验证明，将含有序列表序列1所示DNA分子的重组表达载体pCAMBIA1301-TaNCED1转化烟草得到的T2代纯合转基因植株，其耐旱性和抗盐性明显高于相同条件下的野生型烟草植株。本发明在提高植物抗逆性的育种和研究中具有重要意义。

附图说明

图1为第一轮PCR扩增的电泳图。其中，泳道1为用引物对NCED-1F和NCED-2R进行PCR扩增得到的片段；泳道2为用引物对NCED-2F和NCED-1R进行PCR扩增得到的片段；泳道3为DNA Marker DL2000。

图2为第二轮PCR扩增的电泳图。其中，泳道1和2为用引物NCED-1F和NCED-1R进行PCR扩增得到的片段；泳道3为DNA Marker DL2000。

图3为重组载体pCAMBIA1301-TaNCED1的结构示意图。

图4为T₀代转基因烟草植株的PCR鉴定电泳图。其中，泳道M为Marker，从上至下的条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道1—8、10—17分别为不同的转基因烟草植株。

图5为T₀代转空载体烟草植株的PCR鉴定电泳图。其中，泳道M为Marker，从上至下的条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道1—6、分别为不同的转空载体烟草植株。

图6为半定量RT-PCR检测转基因烟草植株中TaNCED1基因的表达情况。

图7为不同PEG浓度下T₂代转基因烟草种子萌发率的统计结果。

图8为转基因烟草幼苗叶片在离体后不同时间点的失水率。

图9为转基因烟草（TL）和野生型烟草（WT）经干旱胁迫7天后的表型。

图10为转基因烟草植株经干旱胁迫0—7天后叶片的相对含水量。

图11为转基因烟草植株经干旱胁迫0—7天后叶片的脱落酸含量。

图12为转基因烟草植株经干旱胁迫0—7天后叶片的可溶性糖总量。

图13为不同NaCl浓度下T₂代转基因烟草种子发芽率的统计结果。

图14为不同NaCl浓度下转基因烟草植株丙二醛含量测定结果。

图15为转基因烟草植株经高盐胁迫0—6天后叶片的脱落酸含量。

图16为转基因烟草植株经高盐胁迫0—6天后叶片的脯氨酸含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验例1.小麦TaNCED1基因的克隆

1、小麦基因组DNA的提取

以小麦（Triticum aestivum L.)禾尚头的叶片为材料提取基因组DNA，具体方法如下：

1）取1-2g新鲜小麦叶片，液氮冷冻研成细粉，转入盛有15mL65℃预热的2×CTAB[50mmol/L Tri s-Cl（pH8.0），0.7mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，2%（W/V）CTAB]溶液的50mL离心管中，加入150μLβ-巯基乙醇（终浓度为2%），65℃温育60-90min，期间混匀几次，并开盖放气。

2）冷却至室温后，加入等体积（15mL）的氯仿:异戊醇（24:1）抽提10min，10,000rpm室温离心10min，取上清，重复抽提一次。

3）取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，挑出DNA絮状沉淀，放入70%乙醇清洗两次。

4）用2mLTE溶液（含20μg/mL RNAase A）溶解，37℃保温30min消化RNA。

5）溶解的DNA降至室温后先后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、氯仿:异戊醇（24:1）各抽提一次。

6)吸取上清液至7mL离心管中，加入1/10体积的NaAc（3M，pH5.2），2倍体积的无水乙醇，混匀后，-20℃沉淀过夜。

7）挑出DNA絮状沉淀，用70%乙醇清洗沉淀两次，弃乙醇溶液，待残留乙醇挥发干净后，溶解沉淀于适量TE(1mol/L Tris,0.5mol/L EDTA,pH8.0)中，4℃备用。

8）以未酶切的λDNA作为对照，电泳检测植物DNA质量，合格DNA大小在50kb左右，基本无拖尾现象。

2、引物设计

设计如下4条引物：

NCED-1F:5'-atgcagactctgtcggcgcagcc-3'；

NCED-1R:5'-ttagtgctgggcgtcgaggtcg-3'；

NCED-2F:5'-gcatcccgcccttcatcaac-3'；

NCED-2R:5'-cgtccacccacatcatctcc-3'。

3、PCR扩增

1）第一轮PCR扩增

首先，用引物对NCED-1F与NCED-2R和引物对NCED-1R与NCED-2F分别对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，分别得到1.5kb左右的目的条带，结果如图1所示。

PCR扩增体系为：5×PCR反应缓冲液10μL，dNTP（2.5mM each）5μL，引物(10μM)各2μL，Fastpfu高保真DNA聚合酶（北京全式金，2.5U/μL）1μL，5μL步骤1获得的小麦基因组DNA，无菌双蒸水25μL，共计50μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性2分钟；95℃变性20秒，62℃退火20秒，72℃延伸1分钟30秒，循环32次；过度延伸5分钟。

2）第二轮PCR扩增

回收步骤1）两个PCR反应得到的1.5kb左右的目的条带，以1:1摩尔比混合，稀释10倍作为模板，以NCED-1F和NCED-1R为引物二次扩增，得到1.8kb左右的目的条带，结果如图2所示。

PCR扩增体系为：2×PCR GC buffer I：25μL，dNTP（2.5mM each）8μL，引物(10μM)各1.5μL，LA Taq（TAKARA，2.5U/μL）1μL，DNA模板5μL，无菌双蒸水8μL，共计50μL；

PCR扩增体系为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，67℃退火30秒，72℃延伸2分钟，每个循环减1℃，返回到第二步循环11次；94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸2分钟，返回到第5步循环26次，72℃过度延伸10分钟。

4、PCR产物的回收，克隆和测序

采用Axygen的DNA片段回收试剂盒回收步骤3中的2）得到的1.8kb左右的目的条带。将回收片段定量后，使用pGEM-T Easy Vector SystemsKit（Promega，USA）对PCR片段进行克隆。连接体系为：2×Ligation buffer5μL；DNA fragment XμL；T-easy Vector1μL；T4DNAligase1μL；ddH₂O补足到10μL。混匀反应物，4℃连接过夜。连接混合物转化E.coliDH5α感受态细胞。转化菌经LB固体平板（含50μg/mLAmp；80μg/mL X-gal；0.5mM IPTG）培养，挑取白色单菌落，提取质粒DNA，送交上海生工公司进行测序。该1.8kb左右的目的条带的核苷酸序列如序列表序列1所示，长1848bp，编码序列表序列2所示由615个氨基酸组成的蛋白质，将序列表序列1的基因命名为TaNCED1，将序列表序列2的蛋白质命名为TaNCED1。

实验例2、重组植物表达载体的构建

以实施例1获得的基因TaNCED1为模板，经过PCR扩增，获得在序列表序列1的5’端和3’端分别添加XbaI和KpnI酶切识别序列的DNA片段，用XbaI和KpnI双酶切后回收，与经XbaI和KpnI双酶切的pCAMBIA1301（GenBank号：AF234297.1）的载体骨架片段相连，获得重组载体pCAMBIA1301-TaNCED1，经测序证实，重组载体pCAMBIA1301-TaNCED1是在载体pCAMBIA1301的XbaI和KpnI位点间插入了序列表序列1所示的DNA片段（图3）。TaNCED1基因表达由35S启动子启动。

实施例3、重组根癌农杆菌的获得

将实施例2获得的重组载体pCAMBIA1301-TaNCED1冻融法转化根癌农杆菌LBA4404（北京天恩泽生物技术有限公司），获得含有重组载体pCAMBIA1301-TaNCED1的根癌农杆菌LBA4404，将该重组农杆菌命名为LBA4404/pCAMBIA1301-TaNCED1；

将空载体pCAMBIA1301冻融法转化根癌农杆菌LBA4404，获得含有重组载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌LBA4404；将该重组农杆菌命名为LBA4404/pCAMBIA1301。

实施例4、转基因植物的获得

1、用重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1301-TaNCED1叶盘法转化烟草Wisconsin38（Nicotiana tobacum）（文献：宋洪元等.利用Cre/lox重组系统获得烟草TA29-Barnase基因工程雄性不育恢复系.农业生物技术学报.2010年3期:468-475页,公众可从山东省农业科学院作物研究所获得），经PCR检测共获得含TaNCED1基因的阳性T₀代转基因烟草植株17株，PCR检测结果如图4所示。

本实施例步骤1所述转化烟草的方法具体如下：

（1）挑取重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1301-TANCED1单菌落，接种到含有50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃振荡培养至对数生长期（OD600=0.6）。

（2）4℃，5000rpm离心10min，菌体用A2液体培养基（在B5培养基中添加250mg/L NH₄NO₃、3%蔗糖、0.5g/L2-(N-吗啉)-乙基磺酸（MES），pH5.5）重悬，获得侵染液。

（3）将烟草无菌苗叶片切割成0.5cm²的叶盘，浸入步骤（2）得到的侵染液中，浸染5-10min。取出叶盘后，无菌纸吸干菌液，置于A2固体培养基（在A2液体培养基中添加0.7%的琼脂）上，于26℃黑暗共培养2天。

（4）将共培养过的叶盘转移到加有半致死浓度选择剂(20mg/L潮霉素B)和400mg/L头孢霉素的A3选择培养基（B5培养基中添加250mg/L NH₄NO₃，2%蔗糖，0.5g/LMES，0.7%琼脂，1mg/L6-BA，0.1mg/L IAA，pH5.7）上。连续筛选三代后，叶盘边缘长出小芽。

（5）将小芽切下转移至加有半致死浓度的选择剂(20mg/L潮霉素B)和200mg/L头孢霉素的A4培养基（不含IAA的A3选择培养基）上诱导小苗继续生长。约一周后，小苗长到2—3cm高，转到生根培养基上壮苗。待小苗长到5—6cm高时移栽到花盆中培养。

本实施例步骤1所述PCR的方法具体如下：

用引物F1（5’-CATCCCGCCCTTCATCA-3’）和R1（5’-CTCCTCCCACGAGTTCC-3’）PCR扩增TaNEDD1基因，目的片段大小为826bp；

反应体系为：10×PCR Buffer2.5μl，Mg²⁺（25mM）2μl，引物(12.5μM)各1μl，dNTP（10mM each）0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.125μl，DNA模板100ng左右，无菌双蒸水补足25μl；

反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环32次；72℃过度延伸7min。

2、按照步骤1的方法同时用重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1301叶盘法转化烟草Wisconsin38（Nicotiana tobacum），经PCR检测共获得阳性T₀代转基因空载体对照植株6株，PCR检测结果如图5所示。

本实施例步骤2所述PCR的方法具体如下：

用引物HF1（5’-ATCGTTATGTTTATCGGCACT-3’）和HR1（5’-TGGCGACCTCGTATTGG-3’）PCR扩增筛选标记基因hpt基因，目的片段大小为513bp；反应体系和反应程序与步骤1相同。

T₀代表示转化当代获得的再生植株；T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株。

3、半定量RT-PCR检测转基因烟草

取经步骤1的PCR方法鉴定为阳性纯合转TaNCED1的转基因烟草T₂代株系植株、经步骤2的PCR方法鉴定为阳性纯合转空载体对照烟草T₂代株系植株和未转基因的野生型烟草Wisconsin38（WT）植株，Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA，以该DNA为模板，用引物5'-tcatcgccgtccaccagg-3'和5’-gggccgctccaggacatt-3’PCR扩增TaNCED1基因；以烟草actin基因为内参，引物为5’-ctattctccgctttggacttggca-3’和5’-aggacctcaggacaacggaaacg-3’。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，其中，泳道1,8,15为未转基因的野生型烟草Wisconsin38（WT）；泳道9为转空载体对照烟草植株；泳道2—7、10—14和16—21为转TaNCED1的转基因烟草植株。

结果表明，WT和转空载体对照植株中均未检测到TaNCED1基因的表达，转TaNCED1的转基因烟草植株中TaNCED1基因均有表达。

实施例5、转基因烟草植株的耐旱性分析

1、种子萌发实验

取经实施例4步骤1的PCR方法鉴定为阳性纯合转TaNCED1的转基因烟草T₂代株系（L1、L2、L3）种子、经实施例4步骤2的PCR方法鉴定为阳性纯合转空载体对照烟草T₂代株系（CK）种子和未转基因的野生型烟草Wisconsin38（WT）种子，表面灭菌后，置于PEG6000浓度分别为0g/L、50g/L、100g/L和200g/L的水溶液浸润的无菌滤纸上，25℃萌发，5天后统计种子萌发率（种子萌发的标准是胚根和子叶完全突破种皮），每个浓度每种烟草设三次重复，每个重复100粒种子，结果取平均值。结果如表2和图7所示。

表2、转基因烟草种子在不同PEG浓度下的萌发率（%）统计结果

PEG浓度	0g/L	50g/L	100g/L	200g/L
					WT	100	63±3.2	45±3.0	37±3.6
L1	100	74±3.5**	62±3.2**	50±4.5**
					L2	100	77±5.4**	62±4.8**	64±2.6**
L3	100	77±4.5**	64±3.3**	57±4.1**

注：*表示同一浓度下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一浓度下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表2和图7的结果表明，在PEG6000浓度为50g/L—200g/L条件下，转基因烟草的萌发率明显高于野生型，转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

2、盆栽烟草的干旱胁迫处理

取经实施例4步骤1的PCR方法鉴定为阳性纯合转TaNCED1的转基因烟草T₂代株系（L1、L2、L3）种子、经实施例4步骤2的PCR方法鉴定为阳性纯合转空载体对照烟草T₂代株系（CK）种子和未转基因的野生型烟草Wisconsin38（WT）种子，消毒后，分别置于MS固体培养基上萌发得到烟草小苗，再移栽到装有土壤质地均匀且大小一致的花盆中，培养至6叶期后，对烟草植株进行干旱胁迫，即控制每天浇水量使土壤相对含水量保持在12%，实验期为1周。每种烟草株系胁迫处理3株。干旱胁迫期间，进行如下步骤2）—5）的测定：

1）烟草幼苗叶片失水率测定

将MS固体培养基上萌发得到烟草无菌苗分别取位置、叶龄和大小基本相同的叶片，置于室温，每隔10分钟称重，计算失水率（%），即此时的叶片鲜重降低量占原叶片鲜重的百分比。每个株系测3个单株，每个单株取1片叶子，结果取平均值。结果如表3和图8所示。

表3、转基因烟草植株叶片的离体后失水率（%）测定结果

离体时间

0min

10min

20min

30min

40min

50min

WT

0

5.4±0.3

6.8±0.2

9.1±0.5

14±0.2

13±0.1

L1

0

4.8±0.1

5.3±0.1*

6.0±0.2*

6.8±0.3**

7.4±0.4**

L2

0

4.7±0.2*

5.1±0.3*

5.8±0.2**

6.4±0.3**

7.7±0.2**

L3

0

4.7±0.5*

5.1±0.1*

6.5±0.1*

6.9±0.1**

7.9±0.3*

注：*表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表3和图7的结果表明，转基因烟草株系（L1、L2和L3）植株叶片的离体失水率明显低于WT，这种差别在叶片离体10min后表现出来，在叶片离体15—30min之间更加明显。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

2）正常生长条件下，转基因烟草植株与对照烟草植株没有显著的表型差异。在干旱胁迫7天后，转基因烟草植株（TL）保持水分的能力明显优于野生型植株（WT），表现为叶片伸展、萎蔫较轻（图9）。

3）烟草叶片相对含水量测定

在干旱胁迫开始至7天后，测定各株系植株位置、叶龄和大小基本相同的叶片的相对含水量，每个单株取0.2g左右的叶片，结果取平均值。结果如表4和图10所示。

上述叶片相对含水量的测定方法具体如下：

从植株上取下叶片快速称鲜重（FW）后，将其浸入去离子水中，4小时后用滤纸吸取叶片表面水分，称重为饱和鲜重（TW）。最后将叶片在烘箱中80℃烘干至恒重，称重为干重（DW）。相对含水量（Relative water content,RWC）计算公式为RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%。

表4、转基因烟草植株叶片相对含水量（%）测定结果

胁迫时间	0天	1天	3天	5天	7天
						WT	87±2.4	84±4.1	76±3.5	69±2.3	58±3.2
L1	88±3.0	85±4.8	80±3.2	73±3.6*	61±2.5
						L2	86±3.5	84±2.5	81±2.3*	72±4.1	63±2.6*
L3	87±3.8	84±2.1	78±3.1	73±3.1*	64±3.3*

注：*表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著。

干旱胁迫直接影响植物叶片水分状态，通过测定叶片相对含水量可了解植株受干旱胁迫的程度。表4和图10的结果表明，随着干旱胁迫时间延长，烟草各株系叶片相对含水量均降低，转基因烟草株系（L1、L2和L3）植株的相对含水量比WT植株的相对含水量降低较慢。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

4）叶片脱落酸（ABA）含量测定

在干旱胁迫开始至7天后，测定各株系植株位置、叶龄和大小基本相同的叶片的ABA含量，每个株系测3个单株，结果取平均值。结果如表5和图11所示。

上述ABA含量的测定方法具体如下：

称取烟草叶片5g，剪碎，加入80%甲醇低温研磨，4℃静置过夜。4层纱布过滤，残渣用80%甲醇再次提取。合并所得滤液，35—40℃下真空旋转蒸发至只剩下水相，放入-20℃数小时使水相冻结。取出后室温下溶解，10000g离心15min，取上清液，调pH至3.0，按1:1加入乙酸乙酯萃取三次，提取液在滤液真空旋转蒸干，用2mL甲醇溶解残渣，即得到ABA提取液。使用植物激素脱落酸（ABA）Elisa试剂盒（上海时代生物科技有限公司）ELISA法定量测定ABA提取液中ABA含量，再转化为每克叶片鲜重中的ABA含量。

表5、转基因烟草植株叶片ABA含量（ng/g叶片鲜重）测定结果

胁迫时间	0天	1天	3天	5天	7天
						WT	0.4±0.02	1.1±0.01	1.9±0.06	2.9±0.02	3.5±0.02

L1	0.7±0.01	1.6±0.01	2.8±0.01*	3.9±0.02*	5.1±0.02**
						L2	0.9±0.05*	1.8±0.02*	2.7±0.01*	4.1±0.01*	5.5±0.01**
L3	0.8±0.03	1.9±0.04*	2.9±0.02*	4.5±0.01**	5.7±0.03**

注：*表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表5和图11的结果表明，随着干旱胁迫时间延长，烟草各株系叶片ABA含量均增高，转基因烟草株系（L1、L2和L3）植株的ABA含量的增加趋势明显高于WT植株。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

5）烟草叶片可溶性总糖含量测定

在干旱胁迫开始至7天后，测定各株系植株位置、叶龄和大小基本相同的叶片的可溶性总糖含量，每个株系测3个单株，结果取平均值。结果如表6和图12所示。

上述可溶性总糖含量的测定方法具体如下：

以葡萄糖梯度溶液制作标准曲线，采用蒽酮－浓硫酸法测定糖浓度，在630nm波长下测定溶液光密度值。绘制标准曲线，并求出标准线性方程。取不同处理时期的烟草叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.15g放入试管中，加入10mL蒸馏水，用塑料薄膜封口，于沸水中提取30分钟（提取2次）。提取液过滤至25mL容量瓶中，并反复冲洗试管及残渣，定容25mL获得样品提取液。设3次重复。吸取适量样品提取液于试管中，加水补至2mL稀释，在冰浴条件下加入5mL蒽酮－浓硫酸溶液，测定样品的光密度。根据标准线性方程求得的糖量，再根据提取液稀释倍数和叶片鲜重，得到每克鲜重叶片中的可溶性总糖含量（mg/g FW）。

表6、转基因烟草植株叶片可溶性总糖含量（mg/g FW）测定结果

胁迫时间	0天	1天	3天	5天	7天
						WT	2.3±0.03	2.7±0.02	3.4±0.03	4.0±0.01	4.6±0.02
L1	2.7±0.02	3.7±0.01	4.9±0.01	6.6±0.03*	7.6±0.03**
						L2	2.4±0.03	3.8±0.01*	5.5±0.03*	7.0±0.04*	7.6±0.04**
L3	2.2±0.01	3.7±0.02	5.8±0.05**	7.5±0.06**	7.9±0.03**

注：*表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

植物受到渗透胁迫时，通常在细胞内积累渗透保护物质（可溶性糖、脯氨酸等）以降低细胞的渗透势，这些物质即使是在高浓度下通常也不会干扰细胞内正常的生理生化反应，因此又被称为相容性溶质。它们为小分子，呈电中性，起渗透调节作用，维持细胞膨压，以利于水分吸收，在保护和稳定蛋白和细胞膜结构和功能及清除自由基方面起重要作用。表6和图12的结果表明，随着干旱胁迫时间延长，烟草各株系叶片可溶性总糖含量均增高，转基因烟草株系（L1、L2和L3）植株的可溶性总糖含量的增加趋势明显高于WT植株。说明在干旱胁迫处理期间，目的基因TaNCED1表达量增强，细胞内可溶性糖含量较多，叶片光合作用较强，渗透保护物质增多，提高了植株抗旱性。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

实施例5的结果表明，小麦TaNCED1蛋白及其编码基因具有调控目的植物抗旱性的功能。

实施例6、转TaNCED1基因烟草植株的抗盐性分析

1、烟草种子萌发实验

取经实施例4步骤1的PCR方法鉴定为阳性纯合转TaNCED1的转基因烟草T₂代株系（L1、L2、L3）种子、经实施例4步骤2的PCR方法鉴定为阳性纯合转空载体对照烟草T₂代株系（CK）种子和未转基因的野生型烟草Wisconsin38（WT）种子，表面灭菌后，分别置于培养皿中，每皿含NaCl浓度分别为0、50、100或200mM的MS培养基，每个培养皿接种50粒种子，每个处理重复3皿，12天后测定发芽率，结果取平均值。结果如表7和图13所示。

表7、转基因烟草种子在不同NaCl浓度下的发芽率（%）统计结果

NaCl浓度	0mM	50mM	100mM	200mM
					WT	100	79±4.3	58±2.1	30±2.2
L1	100	84±3.2	72±2.3**	39±3.2*
					L2	100	85±3.3	80±3.3**	41±1.9**
L3	100	85±2.1	79±3.1**	43±3.2**

注：*表示同一浓度下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一浓度下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表7和图13的结果表明，在NaCl浓度为50—200mM条件下，转基因烟草株系（L1、L2和L3）的发芽率明显高于WT，转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

2、转基因烟草植株抗盐性测定

取经实施例4步骤1的PCR方法鉴定为阳性纯合转TaNCED1的转基因烟草T₂代株系（L1、L2、L3）种子、经实施例4步骤2的PCR方法鉴定为阳性纯合转空载体对照烟草T₂代株系（CK）种子和未转基因的野生型烟草Wisconsin38（WT）种子，表面灭菌后，分别置于含MS培养基的培养皿中培养，当幼苗长至3—4叶期时，将其移栽至花盆中，蛭石做基质，用Hogland营养液培养，当植株发育至8-10叶期时，分别用另外添加NaCl浓度依次为0、50、100和200mM的Hogland营养液浇灌培养，每日浇1次，每个处理重复3次。

Hogland营养液配方：硝酸钙945mg/L，硝酸钾506mg/L,硝酸铵80mg/L，磷酸二氢钾136mg/L,硫酸镁493mg/L，铁盐溶液2.5mL，微量元素液5mL（pH6.0）；

铁盐溶液配方：硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠3.73g，蒸馏水500mL，pH5.5；

微量元素液配方：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L。

1）膜损伤——丙二醛（MDA）含量测定

高盐胁迫会引起植物细胞膜氧化受损，高盐胁迫下细胞膜的完整性会由于脂质过氧化受损。脂质过氧化的程度可以通过测定MDA含量来确定。在不同NaCl浓度胁迫6天后，测定各株系植株叶片的MDA含量，每个株系测3个单株，结果取平均值。结果如表8和图14所示。

上述丙二醛（MDA）含量的测定方法具体如下：

取叶片0.2g，加5ml提取液（10%的三氯乙酸）研磨离心，取上清液2ml，加入0.6%硫代巴比妥酸2ml，摇匀,于沸水浴中煮沸10min，立即冷却，3000rpm离心15min，上清液于532nm、450nm和600nm波长下比色得到OD₅₃₂、OD₄₅₀和OD₆₀₀的值，根据公式C(μmol/L)=6.45×(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56×OD₄₅₀计算得到MDA浓度，再转换为每克叶片鲜重中的MDA含量，用μmol/g FW表示。

表8、转基因烟草株系经不同NaCl浓度处理后叶片MDA含量（μmol/g FW）的统

计结果

NaCl浓度	0mM	50mM	100mM	200mM
					WT	4.8±0.08	6.2±0.03	7.8±0.04	8.4±0.03
L1	5.3±0.06	5.8±0.04	6.6±0.02	7.7±0.04
					L2	5.1±0.09	5.8±0.03	6.4±0.01*	7.9±0.02
L3	4.9±0.05	5.7±0.03	6.4±0.03*	7.5±0.07*

注：*表示同一浓度下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一浓度下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表8和图14的结果表明，高盐胁迫处理后，所有株系的MDA含量均上升，但是转基因株系L1、L2和L3的MDA含量显著低于WT，即转基因植株的细胞膜损伤小于WT。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

2）叶片脱落酸（ABA）含量测定

在200mM NaCl胁迫开始至6天后，测定各株系植株位置、叶龄和大小基本相同的叶片的ABA含量，每个株系测3个单株，结果取平均值。结果如表9和图15所示。

上述ABA含量的测定方法与实施例5中步骤2的4）相同。

表9、转基因烟草植株经200mM/LNaCl胁迫后叶片ABA含量测定结果

胁迫时间	0天	6天
			WT	0.5±0.01	3.1±0.03
L1	0.8±0.01	5.8±0.05**
			L2	1.2±0.02*	6.8±0.02**
L3	0.8±0.01	7.1±0.06**

注：*表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表9和图15的结果表明，随着高盐胁迫时间延长，烟草各株系叶片ABA含量均增高，转基因烟草株系（L1、L2和L3）植株的ABA含量的增加趋势明显高于WT植株。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

3）脯氨酸含量测定

在200mM NaCl高盐胁迫开始至6天后，测定各株系植株位置、叶龄和大小基本相同的叶片的脯氨酸含量，每个株系测3个单株，结果取平均值。结果如表10和图16所示。

上述脯氨酸含量的测定方法具体如下：

取不同盐胁迫处理时间的植株叶片0.1g，剪碎后置于大试管中，加入5ml3%的磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提20min，然后吸取上清液1-2ml，加入2ml冰乙酸和3ml茚三酮显色液，再于沸水浴中加热40min。冷却至室温后向各管中加入5ml甲苯充分振荡混匀，萃取出红色物质，静置，待分层后吸取上层溶液在520nm下比色，读取OD值。利用脯氨酸标准溶液绘制出标准曲线，求出线性回归方程。利用线性回归方程计算出样品测定液中的脯氨酸含量，然后按照下列公式计算出样品中的脯氨酸含量：

y=（C·V）·（a·W）^-1

公式中C为提取液中脯氨酸的含量（μg）；V为提取液的总体积（ml）；a是测定时所吸取的提取液体积（ml）；W是所测样品的质量（g）；y是样品中的脯氨酸含量（μg/g）。

表10、转基因烟草植株经200mM NaCl胁迫后叶片脯氨酸含量（μg/g鲜重）测定

结果

胁迫时间	0天	6天
			WT	150±3.2	248±2.5
L1	168±4.6	362±4.5**

L2	160±5.2	341±6.0**
			L3	166±4.6	354±5.4**

注：*表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.05下差异显著；**表示同一时间下与WT结果相比在P﹤0.01下差异极显著。

表10和图16的结果表明，随着高盐胁迫时间延长，烟草各株系叶片脯氨酸含量均增高，转基因烟草株系（L1、L2和L3）植株的脯氨酸含量的增加趋势明显高于WT植株。说明转基因株系积累了更多的渗透物质来维持细胞膨压，从而保证细胞的吸水。转空载体对照烟草的结果与WT无显著差异。

实施例6的结果表明，小麦TaNCED1蛋白及其编码基因具有调控目的植物抗盐性的功能。

Claims (15)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在载体pCAMBIA1301的XbaI和KpnI位点间插入了权利要求2或3所述编码基因。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

9.含有权利要求2或3所述编码基因的重组病毒。

10.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述编码基因在调控目的植物的抗逆性中的应用。

11.一种培育高抗逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：在目的植物中导入权利要求2或3所述编码基因，得到抗逆性高于目的植物的转基因植物。

12.一种提高目的植物抗逆性的方法，包括在所述目的植物中导入权利要求2或3所述编码基因的步骤。

13.根据权利要求10-12中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性和/或抗盐性。

14.根据权利要求10-12中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

15.根据权利要求14所述的应用或方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草(Nicotianatobacum)。