CN110684860B - TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记与应用 - Google Patents

TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记与应用 Download PDF

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CN110684860B CN201911209427.1A CN201911209427A CN110684860B CN 110684860 B CN110684860 B CN 110684860B CN 201911209427 A CN201911209427 A CN 201911209427A CN 110684860 B CN110684860 B CN 110684860B
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Abstract

本发明公开了TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记与应用。NCED基因是ABA生物合成过程中的关键限速酶。在植物的抗旱过程中发挥着重要的调控作用，在TaNCED1基因B基因组441bp处发现T/G等位变异，开发了KASP标记，并对364份来自不同地区的小麦品种进行了检测，其中抗旱品种74个，占总数的20.33%；水地种植的品种290个，占总数的79.67%。分析发现，有234个品种是T类型，占总数的64.3%，其中具有抗旱性小麦品种29个，占该类型的12.39%；112个品种是G类型，占总数的30.8%，其中具有抗旱性小麦品种41个，占该类型的36.61%；另外有18个品种属于未知类型。在G类型中，如耐盐品种3D232、农大399和德抗961，抗旱品种和尚头、鲁麦11和临旱2号多属于此类，该位点可以作为筛选抗旱和耐盐材料的标记。

Description

TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记与应用
技术领域
本发明属于小麦遗传学领域，具体涉及TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记与应用。
背景技术
在ABA的生物合成途径中，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是关键的限速酶，能够调控ABA的合成速度。2012年本课题组成功克隆了小麦NCED1基因的全长，并将其命名为TaNCED1，GenBank登录号为JQ772528.1，该基因为单拷贝，长度为1 848 bp，无内含子。研究表明，在小麦中TaNCED1基因对脱水、盐、冷和ABA胁迫均产生不同程度的响应；过表达TaNCED1的转基因烟草抗旱性显著提高。
为了研究小麦中TaNCED1基因表达和ABA积累的关系，我们分析了8个抗旱性不同的小麦品种在干旱胁迫和复水过程中TaNCED1基因表达和ABA积累的动态变化过程，结果表明品种间TaNCED1的表达水平存在明显差异，且TaNCED1对ABA影响程度存在较明显的差异。
发明内容
为明确不同材料中TaNCED1基因对ABA影响不同的原因，本专利研究进一步分析了17个抗旱性不同材料的TaNCED1基因序列的差异，发现在B基因组存在T/G变异位点。为了研究这个变异位点在小麦种质中的分布情况，探讨TaNCED1不同的变异类型与小麦品种的抗旱性关系，针对这个变异位点，本专利开发了KASP标记，并对小麦品种进行检测，以期为小麦分子辅助育种提供宝贵资源和有效的分子标记。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一个TaNCED1基因B基因组SNP标记，在TaNCED1基因B基因组441bp处具有等位变异T/G 。
所述SNP标记的两条正向特异性引物和一条反向通用引物DNA序列如SEQ IDNo.1-3所示。
所述SNP标记具有G变异的小麦品种抗旱性强。
所述SNP标记具有G变异的小麦品种水分胁迫耐受性强或耐盐性强。
该标记可以在筛选抗旱耐盐材料中应用。
本发明的有益效果是：
1、TaNCED1基因是ABA合成的限速酶，其表达水平调控着植物体内ABA含量，不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平存在显著差异。本专利分析了TaNCED1基因T/G等位变异在小麦品种中分布，在G类型中，如耐盐品种3D232、农大399和德抗961，抗旱品种和尚头、鲁麦11和临旱2号多属于此类，该位点可以作为筛选小麦抗旱耐盐材料的标记。
2、随着小麦基因组学的迅速发展，利用优异基因的等位变异，开发分子标记应用到小麦育种中，本发明提供的标记会成为提高小麦育种效率的有效手段。
附图说明
图 1是小麦品种的DNA电泳图。
图2是TaNCED1基因B基因组T/G 位点KASP标记检测图。
具体实施方式
实施例1 TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记开发及验证
1 材料和方法
1.1 植物材料
供试材料为364份小麦品种（见表1）。
表1 试验小麦品种及对应的SNP统计表
大田抗性 来源地区 小麦品种名称 TaNCED1-4-B-d2（T/G）
耐旱 山西 晋麦61
耐旱 河南 周麦12
耐旱、耐渍 河南 周麦19
耐渍 河南 郑9023
水地种植 山东 济宁16
水地种植 山东 LS3283
水地种植 罗马尼亚 F498U1-1021/BOEMA
水地种植 罗马尼亚 F98047G14-2INC
水地种植 法国 LASEN
水地种植 北京 京冬22
水地种植 山东 济麦20
水地种植 安徽 皖麦19
水地种植 安徽 淮麦20
水地种植 山东 临麦2号
水地种植 罗马尼亚 98039G5-103
水地种植 挪威 RE714
水地种植 匈牙利 MV05-08
水地种植 山东 菏麦0662
旱地 陕西 小偃6 G:G
旱地 北京 中麦175 G:G
旱地 安徽 皖23094 G:G
旱地 法国 BRUTA G:G
节水耐高温 河南 中育9307 G:G
节水栽培 北京 农大212 G:G
节水栽培 北京 农大211 G:G
节水栽培 北京 京411 G:G
节水栽培 北京 京9428 G:G
抗旱 河南 周麦13 G:G
抗旱 陕西 陕512 G:G
抗旱 河南 中麦871 G:G
抗旱 山东 烟农173 G:G
抗旱 山西 临抗12 G:G
抗旱 北京 北京841 G:G
抗旱 山西 临旱2号 G:G
抗旱节水 河北 观35 G:G
抗旱节水 河北 衡观35 G:G
抗旱耐高温 河南 中育9302 G:G
抗旱耐盐 北京 3D232 G:G
抗旱耐盐 甘肃 和尚头 G:G
抗旱耐盐 北京 农大399 G:G
抗旱性好 陕西 西农88 G:G
耐肥水 山东 鲁麦5号 G:G
耐旱 陕西 秦农142 G:G
耐旱 日本 Kanto 107 G:G
耐旱 河南 豫麦21 G:G
耐旱 法国 Fr03717 G:G
耐旱 地方种 洋小麦 G:G
耐旱 河南 内乡188 G:G
耐旱 陕西 陕229 G:G
耐旱 山东 泰山1号 G:G
耐旱 河北 衡观33 G:G
耐旱 陕西 小偃81 G:G
耐旱 新疆 新麦37 G:G
耐旱 俄罗斯 SELYANKA G:G
耐旱 俄罗斯 KNIISH 46 G:G
耐旱 美国 Mason/Jagger G:G
耐旱抗干热风 陕西 金麦1号 G:G
耐土壤干旱 山东 鲁麦11 G:G
耐盐 山东 德抗961 G:G
水地种植 河南 周麦23 G:G
水地种植 河南 周麦30 G:G
水地种植 河南 周麦28 G:G
水地种植 陕西 陕715 G:G
水地种植 河北 冀师02-1 G:G
水地种植 河南 周麦16 G:G
水地种植 山东 菏麦20 G:G
水地种植 陕西 小偃22 G:G
水地种植 河南 郑麦04H43 G:G
水地种植 北京 CA0958 G:G
水地种植 美国 E G:G
水地种植 法国 Festin G:G
水地种植 河北 冀麦12 G:G
水地种植 河北 石优20 G:G
水地种植 江苏 K03566 G:G
水地种植 山东 临麦8号 G:G
水地种植 陕西 陕253 G:G
水地种植 陕西 陕农78-59 G:G
水地种植 河北 石4185 G:G
水地种植 安徽 皖麦33 G:G
水地种植 意大利 Genio G:G
水地种植 河南 周麦11 G:G
水地种植 日本 Norin 61 G:G
水地种植 河北 石家庄15 G:G
水地种植 阿根廷 Klein Flecha G:G
水地种植 北京 CA1119 G:G
水地种植 俄罗斯 DONSKI-93 G:G
水地种植 陕西 秦农731 G:G
水地种植 北京 中优206 G:G
水地种植 俄罗斯 BATJKO G:G
水地种植 法国 Thesee G:G
水地种植 山西 晋麦67 G:G
水地种植 美国 D G:G
水地种植 法国 Fr3713 G:G
水地种植 土耳其 HK1/ G:G
水地种植 山东 PH82-2 G:G
水地种植 陕西 西农291 G:G
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水地种植 山东 淄选2号 G:G
水地种植 意大利 Sagittario G:G
水地种植 河南 兰考24 G:G
水地种植 河南 兰考2号 G:G
水地种植 阿根廷 Nidera Baguette 20 G:G
水地种植 山东 鲁麦9号 G:G
水地种植 北京 京双16 G:G
水地种植 罗马尼亚 Lovrin13 G:G
水地种植 北京 北京0045 G:G
水地种植 法国 Salmone G:G
水地种植 北京 京冬8号 G:G
水地种植 法国 Fr03725 G:G
水地种植 法国 Mesofold G:G
水地种植 北京 中优335 G:G
水地种植 北京 中麦415 G:G
水地种植 宁夏 宁冬10 G:G
水地种植 山东 汶农6号 G:G
水地种植 江苏 徐5034 G:G
水地种植 陕西 西农979 G:G
水地种植 山西 临远6521 G:G
水地种植 山东 济麦0850262（9.74%） G:G
水地种植 河北 河农5480 G:G
水地种植 河北 石u10-4152 G:G
水地种植 河北 冀麦325 G:G
水地种植 山东 山农670 G:G
水地种植 河北 邯05-5092 G:G
水地种植 河北 石u10-4125 G:G
水地种植 山东 泰农1014 G:G
水地种植 山东 临优145 G:G
水地种植 山西 临优359 G:G
水地种植 北京 铭贤169 G:G
水地种植 北京 京双16 G:G
水地种植 河南 豫麦35 G:G
旱地 山东 山农25 T:T
旱地 山东 济麦262 T:T
较耐旱 河南 中育5号 T:T
抗冻耐旱 河南 矮抗58 T:T
抗旱 河北 衡7228 T:T
抗旱 山东 烟农19 T:T
抗旱 山东 烟农18 T:T
抗旱 陕西 长武134 T:T
抗旱 法国 Fr03733 T:T
抗旱 山东 泰山21 T:T
抗旱，抗寒 山东 鲁麦14 T:T
抗旱节水 山东 青麦6号 T:T
抗旱耐渍 河南 众麦1号 T:T
耐肥 意大利 阿勃 T:T
耐旱 法国 Manital T:T
耐旱 河南 洛麦21 T:T
耐旱 山东 济南13 T:T
耐旱 陕西 陕150 T:T
耐旱 陕西 陕农981 T:T
耐旱 山东 鲁麦21 T:T
耐旱 河南 豫麦57 T:T
耐旱 山东 鲁麦6号 T:T
耐旱 山东 青麦7号 T:T
耐旱 北京 JN331 T:T
耐涝 山东 鲁麦8号 T:T
耐湿 江苏 扬麦15 T:T
耐湿又耐旱,耐高温 河南 百农64 T:T
耐盐 山东 山融3号 T:T
耐渍，耐旱性中等 安徽 淮麦18 T:T
水地种植 北京 丰抗2号 T:T
水地种植 法国 NSA09-3645 T:T
水地种植 河南 周麦26 T:T
水地种植 陕西 西农1376 T:T
水地种植 陕西 武农148 T:T
水地种植 河北 石优17 T:T
水地种植 江苏 徐9169 T:T
水地种植 山东 JS2001（6.72%） T:T
水地种植 北京 BFB20 T:T
水地种植 美国 TX03A0148 T:T
水地种植 江苏 烟农15 T:T
水地种植 河南 周8425B T:T
水地种植 河南 豫麦50 T:T
水地种植 河南 偃展4110 T:T
水地种植 陕西 西农2000-7 T:T
水地种植 河北 石新828 T:T
水地种植 山东 汶农5号 T:T
水地种植 安徽 皖麦29 T:T
水地种植 河南 新麦19 T:T
水地种植 山东 鲁麦7号 T:T
水地种植 河南 新麦9号 T:T
水地种植 日本 Norin 67 T:T
水地种植 河南 周麦25 T:T
水地种植 意大利 Dorico T:T
水地种植 日本 Kitanokaori T:T
水地种植 河南 豫麦2号 T:T
水地种植 山东 泰山5号 T:T
水地种植 意大利 Mantol T:T
水地种植 河南 85中33 T:T
水地种植 山东 济麦21 T:T
水地种植 河南 周麦32 T:T
水地种植 河南 豫麦47 T:T
水地种植 陕西 陕354 T:T
水地种植 河北 邯6172 T:T
水地种植 阿根廷 Aca 801 T:T
水地种植 安徽 淮麦21 T:T
水地种植 河南 中育9号 T:T
水地种植 河南 周麦22 T:T
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水地种植 阿根廷 ProINTA Colibr 1 T:T
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水地种植 北京 CA0548 T:T
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水地种植 法国 Azulon T:T
水地种植 河北 藁城8901 T:T
水地种植 澳大利亚 Sunstate T:T
水地种植 河南 中892 T:T
水地种植 河北 科衡6654 T:T
水地种植 山东 山农20 T:T
水地种植 山东 济麦23 T:T
水地种植 山东 LS6109 T:T
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水地种植 山东 JM23 T:T
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水地种植 山东 泰7087 T:T
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水地种植 山东 泰山23 T:T
水地种植 山东 泰山22 T:T
水地种植 山东 汶农19 T:T
水地种植 山东 山农29 T:T
水地种植 山东 4510(泰农18/烟农19) T:T
水地种植 山东 3768（烟农19/良星66） T:T
水地种植 山东 LS4695 T:T
水地种植 山东 山农24 T:T
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水地种植 河北 中信麦99 T:T
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水地种植 山东 汶农28 T:T
水地种植 河北 冀麦181 T:T
水地种植 河北 众信6285 T:T
水地种植 山东 圣麦102 T:T
水地种植 河北 藁优2018 T:T
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水地种植 山东 烟1212 T:T
水地种植 山东 烟农999 T:T
水地种植 山东 登海206 T:T
水地种植 山东 齐麦2号-1 T:T
水地种植 山东 鑫麦296 T:T
水地种植 山东 菏麦0643 T:T
水地种植 山东 菏麦0746-2 T:T
水地种植 山东 菏麦0839 T:T
水地种植 山东 儒麦1号 T:T
水地种植 陕西 秦农151 T:T
水地种植 河北 邯05-5093 T:T
水地种植 河南 郑麦366 T:T
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
取小麦叶片，使用快捷型植物基因组DNA提取系统（非离心柱型目录号：DP321，天根）进行小麦叶片DNA的提取。
引物设计及引物序列
根据KASP标记的工作原理，针对SNP/Indel 位点设计3条引物，两条正向特异性引物和一条反向通用引物，两条正向引物对应两种荧光信号，经过PCR反应，最终检测两种荧光的荧光值大小来判断样本分型情况。
表2 TaNCED1基因B基因组KASP引物
Figure 242413DEST_PATH_IMAGE001
1.2.3 反应体系和反应程序
通过Replikator仪器将样本从96孔板中转移到384孔板，最终再转移至1536孔板中。将装有DNA的1536孔板置于烘箱中烘干。干燥后的1536孔板通过Meridian仪器进行PCR体系构建，每个反应仅需1ul反应体系：
表3 PCR反应体系
Plate format 1536-well plate
2*KASP Master mix 0.5 ul
72*Assay mix 0.014 ul
H2O 0.486 ul
Total 1 ul
将加好反应体系的孔板进行封膜，并快速进行低速离心。离心后进行水浴PCR反应，反应程序如下：
表4 PCR反应程序
Figure 690712DEST_PATH_IMAGE002
将完成反应的孔板，擦干水降温后，在酶标仪Pherastar上进行读板。若没有出现清晰的分型结果，可适当增加额外的PCR反应进一步扩增。
表5 PCR反应进一步扩增程序
步骤 温度 时间 循环次数
1 94℃ 20s 3
2 57℃ 60s
2 结果分析
2.1 DNA的提取质量检测
利用Nanodrop 2000/2000C 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的质量和完整性，结果发现，364份小麦品种的DNA提取质量较好，Nanodrop 2000/2000C 分光光度计检测的结果260/280的比值大于1.8，260/230的比值大于2.0；琼脂糖电泳结果显示DNA没有降解，完整性很好（见图1）。
检测结果分析
利用KASP引物共检测了4个96孔板，96孔板的编号分别为NCED-1、NCED-2、NCED-3和NCED-4。每个96孔板放置92个DNA，剩余最后4孔用于放置阳性对照，在第4个96孔板中放置了4个阳性对照材料，故共参加分析的小麦品种364个。4个96孔板中KASP的分型结果统计如表6。TaNCED1基因B基因组T/G 位点KASP标记检测图见图2。
表6 KASP分型结果统计表
Figure 126241DEST_PATH_IMAGE004
2.3 T/G变异类型分布
T/G变异位点位于TaNCED1基因441bp处，在检测的364个小麦品种中，234个品种是T类型，占总数的64.3%；112个品种是G类型，占总数的30.8%；其中18个品种属于未知类型。
根据小麦品种审定及文章中报道的品种抗旱性，对364个小麦品种进行了抗旱性分类，分为水地种植、抗旱、耐旱、节水、耐渍、耐盐等类型，在统计过程中除水地种植外，其余材料均认为耐水分胁迫，属于抗旱类型。在参试的364个品种中，其中抗旱的品种74个，占总数的20.33%；水地种植的品种290个，占总数的79.67%。分析小麦品种的抗旱性及对应的SNP类型发现，在含有T SNP 的234个品种中，具有抗旱性小麦品种有29个，占该类型的12.39%；而在含有G SNP的112个小麦品种中，具有抗旱性小麦品种41个，占该类型的36.61%。在G类型中，如耐盐品种3D232、农大399和德抗961，抗旱品种和尚头、鲁麦11和临旱2号多属于此类（见表1），该位点可以作为筛选抗旱耐盐材料的标记。
TaNCED1基因是ABA合成的限速酶，其表达水平调控着植物体内ABA含量，研究发现不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平存在显著差异。不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平的差异，是否是导致不同品种抗旱性不同的原因，因此分析了TaNCED1基因T/C等位变异在小麦品种中分布，结果发现如耐盐品种3D232、农大399和德抗961，抗旱品种和尚头、鲁麦11和临旱2号多属于G类型，该位点可以作为筛选小麦抗旱耐盐材料的标记。
目前在小麦上分别研究了TaPK7、TaDREB1和TaFer-A等基因的等位变异与抗旱性的关系，并开发与抗旱性相关的分子标记。随着小麦基因组学的迅速发展，利用优异基因的等位变异，开发分子标记应用到小麦育种中，成为提高小麦育种效率的有效手段。
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
序列表
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> TaNCED1基因B基因组T/G SNP标记与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcccccgt cggcgat 17
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcccccgtc ggcgag 16
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtgcgtaga cgccgttgat gaa 23

Claims (3)

1.一个与小麦品种抗旱性有关的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：在TaNCED1基因B基因组441bp处具有等位变异T/G，具有G变异的小麦品种抗旱性强。
2.根据权利要求1所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的两条正向特异性引物和一条反向通用引物DNA序列如SEQ ID No.1-3所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述标记在筛选抗旱耐盐小麦品种中的应用。
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