CN110229812B - TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记与应用 - Google Patents

TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记与应用 Download PDF

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CN110229812B CN201910494487.6A CN201910494487A CN110229812B CN 110229812 B CN110229812 B CN 110229812B CN 201910494487 A CN201910494487 A CN 201910494487A CN 110229812 B CN110229812 B CN 110229812B
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Abstract

TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记与应用。NCED基因是ABA生物合成过程中的关键限速酶。在植物的抗逆过程中发挥着重要的调控作用，在TaNCED1基因B基因组353bp处发现T/C等位变异，开发了KASP标记，并对364份来自不同地区的小麦品种进行了检测，其中抗旱品种74个，占总数的20.33%；水地种植的品种290个，占总数的79.67%。分析发现，有338个品种是T类型，占总数的92.9%，其中具有抗旱性小麦品种58个，占该类型的17.16%；23个品种是C类型，占总数的6.3%，其中具有抗旱性小麦品种14个，占该类型的60.87%。还有3个品种属于未知类型。根据分析结果发现，耐盐品种3D232和德抗961，抗旱品种和尚头和鲁麦11等多属于C类型，该位点可以作为筛选抗旱耐盐材料的标记。

Description

TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记与应用
技术领域
本发明属于小麦遗传学领域，具体涉及TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记与应用。
背景技术
在ABA的生物合成途径中，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是关键的限速酶，能够调控ABA的合成速度。2012年本课题组成功克隆了小麦NCED1基因的全长，并将其命名为TaNCED1，GenBank登录号为JQ772528.1，该基因为单拷贝，长度为1 848 bp，无内含子。研究表明，在小麦中TaNCED1基因对脱水、盐、冷和ABA胁迫均产生不同程度的响应；过表达TaNCED1的转基因烟草抗旱性显著提高。
为了研究小麦中TaNCED1基因表达和ABA积累的关系，我们分析了8个抗旱性不同的小麦品种在干旱胁迫和复水过程中TaNCED1基因表达和ABA积累的动态变化过程，结果表明品种间TaNCED1的表达水平存在明显差异，且TaNCED1对ABA影响程度存在较明显的差异。
发明内容
为明确不同材料中TaNCED1基因对ABA影响不同的原因，本专利研究进一步分析了17个抗旱性不同材料的TaNCED1基因序列的差异，发现在B基因组存在T/C变异位点。为了研究这个变异位点在小麦种质中的分布情况，探讨TaNCED1不同的变异类型与小麦品种的抗旱性关系，针对这个变异位点，本专利开发了KASP标记，并对小麦品种进行检测，以期为小麦分子辅助育种提供宝贵资源和有效的分子标记。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一个TaNCED1基因B基因组SNP标记，在TaNCED1基因B基因组353bp处具有等位变异T/C 。
所述SNP标记的两条正向特异性引物和一条反向通用引物DNA序列如SEQ IDNo.1-3所示。
所述SNP标记具有C变异的小麦品种抗旱性强。
所述SNP标记具有C变异的小麦品种水分胁迫耐受性强或耐盐性强。
该标记可以在筛选抗旱耐盐材料中应用。
本发明的有益效果是：
1、TaNCED1基因是ABA合成的限速酶，其表达水平调控着植物体内ABA含量，不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平存在显著差异。本专利分析了TaNCED1基因T/C等位变异在小麦品种中分布，耐盐品种3D232和德抗961，抗旱品种和尚头和鲁麦11等多属于C类型，该位点可以作为筛选小麦抗旱耐盐材料的标记。
2、随着小麦基因组学的迅速发展，利用优异基因的等位变异，开发分子标记应用到小麦育种中，本发明提供的标记会成为提高小麦育种效率的有效手段。
附图说明
图 1是小麦品种的DNA电泳图。
图2是TaNCED1基因B基因组T/C 位点KASP标记检测图。
具体实施方式
实施例1 TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记开发及验证
1 材料和方法
1.1 植物材料
供试材料为364份小麦品种（见表1）。
表1 试验小麦品种及对应的SNP统计表
大田抗性 来源地区 小麦品种名称 TaNCED1-3-B-1（T/C）
耐旱 山西 晋麦61 ?
耐渍 河南 郑9023 ?
水地种植 北京 丰抗2号 ?
节水耐高温 河南 中育9307 C:C
抗旱 河南 周麦13 C:C
抗旱 陕西 陕512 C:C
抗旱 河南 中麦871 C:C
抗旱耐高温 河南 中育9302 C:C
抗旱耐盐 北京 3D232 C:C
抗旱耐盐 甘肃 和尚头 C:C
耐肥水 山东 鲁麦5号 C:C
耐旱 河南 周麦12 C:C
耐旱 陕西 秦农142 C:C
耐旱 日本 Kanto 107 C:C
耐旱抗干热风 陕西 金麦1号 C:C
耐土壤干旱 山东 鲁麦11 C:C
耐盐 山东 德抗961 C:C
水地种植 河南 周麦23 C:C
水地种植 河南 周麦30 C:C
水地种植 河南 周麦28 C:C
水地种植 陕西 陕715 C:C
水地种植 河北 冀师02-1 C:C
水地种植 河南 周麦16 C:C
水地种植 山东 菏麦20 C:C
水地种植 陕西 小偃22 C:C
水地种植 河南 郑麦04H43 C:C
旱地 陕西 小偃6 T:T
旱地 北京 中麦175 T:T
旱地 安徽 皖23094 T:T
旱地 法国 BRUTA T:T
旱地 山东 山农25 T:T
旱地 山东 济麦262 T:T
较耐旱 河南 中育5号 T:T
节水栽培 北京 农大212 T:T
节水栽培 北京 农大211 T:T
节水栽培 北京 京411 T:T
节水栽培 北京 京9428 T:T
抗冻耐旱 河南 矮抗58 T:T
抗旱 山东 烟农173 T:T
抗旱 山西 临抗12 T:T
抗旱 北京 北京841 T:T
抗旱 山西 临旱2号 T:T
抗旱 河北 衡7228 T:T
抗旱 山东 烟农19 T:T
抗旱 山东 烟农18 T:T
抗旱 陕西 长武134 T:T
抗旱 法国 Fr03733 T:T
抗旱 山东 泰山21 T:T
抗旱，抗寒 山东 鲁麦14 T:T
抗旱节水 河北 观35 T:T
抗旱节水 河北 衡观35 T:T
抗旱节水 山东 青麦6号 T:T
抗旱耐盐 北京 农大399 T:T
抗旱耐渍 河南 众麦1号 T:T
抗旱性好 陕西 西农88 T:T
耐肥 意大利 阿勃 T:T
耐旱 法国 Manital T:T
耐旱 河南 豫麦21 T:T
耐旱 法国 Fr03717 T:T
耐旱 地方种 洋小麦 T:T
耐旱 河南 内乡188 T:T
耐旱 陕西 陕229 T:T
耐旱 山东 泰山1号 T:T
耐旱 河北 衡观33 T:T
耐旱 陕西 小偃81 T:T
耐旱 新疆 新麦37 T:T
耐旱 俄罗斯 SELYANKA T:T
耐旱 俄罗斯 KNIISH 46 T:T
耐旱 美国 Mason/Jagger T:T
耐旱 河南 洛麦21 T:T
耐旱 山东 济南13 T:T
耐旱 陕西 陕150 T:T
耐旱 陕西 陕农981 T:T
耐旱 山东 鲁麦21 T:T
耐旱 河南 豫麦57 T:T
耐旱 山东 鲁麦6号 T:T
耐旱 山东 青麦7号 T:T
耐旱 北京 JN331 T:T
耐旱、耐渍 河南 周麦19 T:T
耐涝 山东 鲁麦8号 T:T
耐湿 江苏 扬麦15 T:T
耐湿又耐旱,耐高温 河南 百农64 T:T
耐盐 山东 山融3号 T:T
耐渍，耐旱性中等 安徽 淮麦18 T:T
水地种植 法国 NSA09-3645 T:T
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水地种植 河南 85中33 T:T
水地种植 山东 济麦21 T:T
水地种植 河南 周麦32 T:T
水地种植 河南 豫麦47 T:T
水地种植 陕西 陕354 T:T
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水地种植 河北 藁城8901 T:T
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水地种植 河南 中892 T:T
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水地种植 山东 山农23 T:T
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水地种植 安徽 宿553 T:T
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水地种植 河北 河农583 T:T
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水地种植 安徽 齐麦5号 T:T
水地种植 河北 邢麦13号 T:T
水地种植 山东 YX11-57 T:T
水地种植 山东 山农0911 T:T
水地种植 山东 齐麦2号 T:T
水地种植 河南 兰考381 T:T
水地种植 山东 JM23 T:T
水地种植 山东 齐都7号 T:T
水地种植 河南 濮兴5号 T:T
水地种植 山东 泰7087 T:T
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水地种植 河北 藁优5218 T:T
水地种植 山东 临选5186 T:T
水地种植 山东 泰麦18 T:T
水地种植 山东 泰山23 T:T
水地种植 山东 泰山22 T:T
水地种植 山东 汶农19 T:T
水地种植 山东 山农29 T:T
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水地种植 山东 LS4695 T:T
水地种植 山东 山农24 T:T
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水地种植 河北 中信麦99 T:T
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水地种植 山东 汶农28 T:T
水地种植 河北 冀麦181 T:T
水地种植 河北 众信6285 T:T
水地种植 山东 圣麦102 T:T
水地种植 河北 藁优2018 T:T
水地种植 河北 藁优5766 T:T
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水地种植 山东 齐麦2号-1 T:T
水地种植 山东 鑫麦296 T:T
水地种植 山东 菏麦0643 T:T
水地种植 山东 菏麦0662 T:T
水地种植 山东 菏麦0746-2 T:T
水地种植 山东 菏麦0839 T:T
水地种植 山东 儒麦1号 T:T
水地种植 陕西 秦农151 T:T
水地种植 河北 邯05-5093 T:T
水地种植 河南 郑麦366 T:T
水地种植 河南 豫麦35 T:T
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
取小麦叶片，使用快捷型植物基因组DNA提取系统（非离心柱型目录号：DP321，天根）进行小麦叶片DNA的提取。
引物设计及引物序列
根据KASP标记的工作原理，针对SNP/Indel 位点设计3条引物，两条正向特异性引物和一条反向通用引物，两条正向引物对应两种荧光信号，经过PCR反应，最终检测两种荧光的荧光值大小来判断样本分型情况。
表2 TaNCED1基因B基因组KASP引物
Figure 104733DEST_PATH_IMAGE001
1.2.3 反应体系和反应程序
通过Replikator仪器将样本从96孔板中转移到384孔板，最终再转移至1536孔板中。将装有DNA的1536孔板置于烘箱中烘干。干燥后的1536孔板通过Meridian仪器进行PCR体系构建，每个反应仅需1ul反应体系：
表3 PCR反应体系
Plate format 1536-well plate
2*KASP Master mix 0.5 ul
72*Assay mix 0.014 ul
H2O 0.486 ul
Total 1 ul
将加好反应体系的孔板进行封膜，并快速进行低速离心。离心后进行水浴PCR反应，反应程序如下：
表4 PCR反应程序
Figure 428398DEST_PATH_IMAGE002
将完成反应的孔板，擦干水降温后，在酶标仪Pherastar上进行读板。若没有出现清晰的分型结果，可适当增加额外的PCR反应进一步扩增。
表5 PCR反应进一步扩增程序
步骤 温度 时间 循环次数
1 94℃ 20s 3
2 57℃ 60s
2 结果分析
2.1 DNA的提取质量检测
利用Nanodrop 2000/2000C 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的质量和完整性，结果发现，364份小麦品种的DNA提取质量较好，Nanodrop 2000/2000C 分光光度计检测的结果260/280的比值大于1.8，260/230的比值大于2.0；琼脂糖电泳结果显示DNA没有降解，完整性很好（见图1）。
检测结果分析
利用KASP引物共检测了4个96孔板，96孔板的编号分别为NCED-1、NCED-2、NCED-3和NCED-4。每个96孔板放置92个DNA，剩余最后4孔用于放置阳性对照，在第4个96孔板中放置了4个阳性对照材料，故共参加分析的小麦品种364个。4个96孔板中KASP的分型结果统计如表6。TaNCED1基因B基因组T/C 位点KASP标记检测图见图2。
表6 KASP分型结果统计表
Figure 286763DEST_PATH_IMAGE003
2.3 T/C变异类型分布
T/C变异类型位点位于TaNCED1基因353bp处，在检测的364个小麦品种中，有338个品种是T类型，占总数的92.9%；23个品种是C类型，占总数的6.3%；还有3个品种属于未知类型。
根据小麦品种审定及文章中报道的品种抗旱性，对364个小麦品种进行了抗旱性分类，分为水地种植、抗旱、耐旱、节水、耐渍、耐盐等类型，在统计过程中除水地种植外，其余材料均认为耐水分胁迫，属于抗旱类型。在参试的364个品种中，其中抗旱的品种74个，占总数的20.33%；水地种植的品种290个，占总数的79.67%。分析小麦品种的抗旱性及对应的SNP类型发现，在含有T SNP 的338个品种中，具有抗旱性小麦品种58个，占该类型的17.16%；而在含有C SNP的23个小麦品种中，具有抗旱性小麦品种14个，占该类型的60.87%。根据分析结果发现，耐盐品种3D232和德抗961，抗旱品种和尚头和鲁麦11等多属于C类型（见表1），该位点可以作为筛选耐盐抗旱材料的标记。
TaNCED1基因是ABA合成的限速酶，其表达水平调控着植物体内ABA含量，研究发现不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平存在显著差异。不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平的差异，是否是导致不同品种抗旱性不同的原因，因此分析了TaNCED1基因T/C等位变异在小麦品种中分布，耐盐品种3D232和德抗961，抗旱品种和尚头和鲁麦11等多属于C类型，该位点可以作为筛选小麦抗旱耐盐材料的标记。
目前在小麦上分别研究了TaPK7、TaDREB1和TaFer-A等基因的等位变异与抗旱性的关系，并开发与抗旱性相关的分子标记。随着小麦基因组学的迅速发展，利用优异基因的等位变异，开发分子标记应用到小麦育种中，成为提高小麦育种效率的有效手段。
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
序列表
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> TaNCED1基因B基因组T/C SNP标记与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgctccag gacattgtgg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctccagg acattgtggg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttccagcgcg cggcggcg 18

Claims (3)

1.一个与小麦品种抗旱性有关的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：在TaNCED1基因B基因组353bp处具有等位变异T/C，具有C变异的小麦品种抗旱性强 。
2.根据权利要求1所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的两条正向特异性引物和一条反向通用引物DNA序列如SEQ ID No.1-3所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述标记在筛选抗旱耐盐小麦品种中的应用。
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