CN108913702B - 用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒，属于基因工程领域，提出了一种通过转基因技术提高烟草对黑胫病抗性的方法。该技术方案包括通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性。本发明利用转基因技术得到稳定遗传的抗性接种植株，提高了烟草体内防御酶的活性，增强了烟草对黑胫病的抗性，该方法不影响烟草的生长，并且提高了烟草的抗旱性和耐盐性，大大降低了农药的使用量，减少了对环境的污染。

Description

用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒。

背景技术

烟草黑胫病是危害烟草生产的重要病害之一，在世界各产烟区普遍发生，也是危害我国烟叶生产的最主要病害。烟草黑胫病是土传性的真菌病害，由于其发病率高、传播快、难控制等特性，易对烟草生产造成严重经济损失，因此，各产烟区对该病的防治高度重视。化学防治仍是烟草黑胫病的主要防治手段。但是，化学防治会造成农药残留、污染环境、影响健康等危害。因此，非常有必要培育出对环境友好的抗烟草黑胫病的优良抗性品种，以促进我国烟草产业的可持续发展。

目前，随着分子生物学的发展，通过转基因技术提高植物自身的抗病性已成为行之有效的手段，为烟草抗黑胫病的分子育种提供新的思路。众多研究发现，油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)在植物的生长发育和调控植物抵抗非生物胁迫方面发挥着重要的作用。CYP85A1基因编码的酶是内源BRs合成的关键限速酶之一，作用于内源BRs生物合成中的C-20羟基化过程，过量表达该基因可以有效地调控内源BRs的生物合成量。然而，在烟草抗病分子研究过程中，关于内源BRs合成途径的关键酶基因参与烟草抵抗黑胫病的研究尚未开展，有待于进一步研究。

发明内容

本发明提出一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒，该方法可在不影响烟草生长并且提高抗逆性的前提下，增强烟草对黑胫病的抗性。

为了达到上述目的，本发明提出了一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法，通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性。

作为优选，所述过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系由以下方法得到：

根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物，利用所述特异性引物扩增得到PCR产物，将所述PCR产物连接至植物表达载体pB7WG2D,1中，获得含有目的基因的重组载体，将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后采用农杆菌介导的烟草叶盘方法将SoCYP85A1基因转入烟草中，筛选再生植株，获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系。

作为优选，所述根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

作为优选，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株具体包括：

将过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草植株的T₀代植株进行继代培养，每一代均进行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR检测和GFP蛋白检测，并保留阳性植株进行继代培养，其中，T3代植株的PCR检测和GFP蛋白检测均呈阳性，可以进行稳定遗传，因此，将T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株。

作为优选，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性具体包括：

所述抗性接种植株在接种烟草黑胫病原菌后，抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量提高，生成由SoCYP85A1基因编码的内源油菜素甾醇合成的关键限速酶，利用关键限速酶调控油菜素甾醇的生物合成量，通过提高烟草体内防御酶的活性来提高烟草对黑胫病的抗性。

作为优选，所述抗性接种植株接种烟草黑胫病原菌包括以下步骤：

对培养至7叶期的野生型烟草和抗性接种植株的茎基部注射接种烟草黑胫病原菌，光照培养箱中培养，观察记录发病情况。

作为优选，所述抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量通过以下方法测得：

取所述接种烟草黑胫病原菌前和接种4d后的抗性接种植株的叶片，提取RNA，以烟草Actin为内参基因，反转录合成cDNA模板，对多重PCR扩增反应的反应产物进行荧光检测，采用2^–ΔΔCT法分析实验结果，得到接种前后抗性接种植株的SoCYP85A1基因的表达量。

本发明还提出了一种用于提高烟草黑胫病抗性的特异性引物，具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

本发明还提出了一种包含上述技术方案所述的用于提高烟草黑胫病抗性的特异性引物的试剂盒。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明利用转基因技术得到稳定遗传的抗性接种植株，提高了烟草内源油菜素甾醇的含量，增强了烟草对黑胫病的抗性，该方法在不影响烟草生长的前提下，提高了烟草的抗旱性和耐盐性，大大降低了农药的使用量，减少了对环境的污染。

附图说明

图1为本发明实施例2所提供的野生型和抗性接种植株的发病率示意图；

图2为本发明实施例2所提供的野生型和抗性接种植株的病情指数示意图；

图3为本发明实施例3所提供的接种前后抗性接种植株SoCYP85A1基因表达量示意图；

图4为本发明实施例4所提供的接种前后野生型和抗性接种植株油菜素甾醇含量示意图；

图5为本发明实施例5所提供的接种前后野生型和抗性接种植株防御酶活性示意图；

图6为本发明实施例6所提供的接种前后野生型和抗性接种植株防御酶基因相对表达量示意图；

其中，附图1-6中的小写字母a、b、c、d、cd均表示在P<0.05水平上的差异显著。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法，通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性。

在上述实施例中，采用SoCYP85A1基因作为目的基因的原因在于：CYP85A1基因编码的酶是内源BRs合成的关键限速酶之一，作用于内源BRs生物合成中的C-20羟基化过程，过量表达该基因可以有效地调控内源BRs的生物合成量。本实施例利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高了烟草对黑胫病的抗性，同时验证了施加内源BRs可以提高植物的抗病性，为内源BRs在植物抗病性的研究开辟了新的思路。

在一可选实施例中，所述过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系由以下方法得到：

根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物，利用所述特异性引物扩增得到PCR产物，将所述PCR产物连接至植物表达载体pB7WG2D,1中，获得含有目的基因的重组载体，将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后采用农杆菌介导的烟草叶盘方法将SoCYP85A1基因转入烟草中，筛选再生植株，获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系。

在上述实施例中，选用pB7WG2D,1作为植物表达载体主要是考虑到该载体具有增强型的GFP检测基因，为后续的转基因检测提供便利。

在一优选实施例中，所述根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

在上述实施例中，进一步设计了特异性上下游引物的具体序列，采用该引物的优势在于，该引物可以特异性扩增菠菜中的CYP85A1基因的ORF区。

在一优选实施例中，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株具体包括：

将过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草植株的T₀代植株进行继代培养，每一代均进行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR检测和GFP蛋白检测，并保留阳性植株进行继代培养，其中，T3代植株的PCR检测和GFP蛋白检测均呈阳性，可以进行稳定遗传，因此，将T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株。

可以理解的是，在上述实施例中选用稳定遗传的T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株，其优势在于稳定遗传的植株在遗传时不会出现性状分离，能够稳定遗传亲本的性状，保证后代具有抗黑胫病的功能。

在一优选实施例中，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性具体包括：

所述抗性接种植株在接种烟草黑胫病原菌后，抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量提高，生成由SoCYP85A1基因编码的内源油菜素甾醇合成的关键限速酶，利用关键限速酶调控油菜素甾醇的生物合成量，通过提高烟草体内防御酶的活性来提高烟草对黑胫病的抗性。

在上述实施例中，接种病原菌后，抗性接种植株的SoCYP85A1基因参与植株抵抗病原物的响应，基因表达量提高，生成由SoCYP85A1基因编码的内源油菜素甾醇合成的关键限速酶，促进了内源油菜素甾醇的合成，内源油菜素甾醇通过转录调控烟草防御酶基因的表达量，提高烟草体内防御酶的活性，从而提高烟草对黑胫病的抗性。

在一优选实施例中，所述抗性接种植株接种烟草黑胫病原菌包括以下步骤：

对培养至7叶期的野生型烟草和抗性接种植株的茎基部注射接种烟草黑胫病原菌，光照培养箱中培养，观察记录发病情况。

在上述实施例中，具体限定了接种植株为7叶期的植株，原因在于，若在种子发芽期或较弱小的幼苗期就进行病原菌的胁迫处理，此时因为植株生长脆弱而自身的生理特性没有得以充分发挥，从而难以展示植株抗性的真实表现，干扰鉴定结果；若在烟草苗床时期接种病原菌，由于苗床湿度大，黑斑很快沿茎向上扩展，造成全株腐烂，并迅速传染给附近烟苗，造成成片死亡；7叶期这个时期的幼苗健壮，生长旺盛，因而能准确、客观地反映鉴定材料本身的遗传特性和对黑胫病的抗性反应。

其中，接种植株的发病情况按照GB/T 23222-2008对该病害的严重等级程度进行分级，采用以下公式进行病情指数计算：

病情指数＝[Σ(各级病株数×该病级值)/(调查总株数)]。

在一优选实施例中，所述抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量通过以下方法测得：

取所述接种烟草黑胫病原菌前和接种4d后的抗性接种植株的叶片，提取RNA，以烟草Actin为内参基因，反转录合成cDNA模板，对多重PCR扩增反应的反应产物进行荧光检测，采用2^–ΔΔCT法分析实验结果，得到接种前后抗性接种植株的SoCYP85A1基因的表达量。

在上述实施例中，检测接种前后抗性接种植株的SoCYP85A1基因的表达量，对比接种前后抗性接种植株的SoCYP85A1基因的表达量的变化情况，可以反映SoCYP85A1基因是否参与抗性接种植株对黑胫病的抗性，同时有利于推进对内源BRs合成途径的关键酶基因参与烟草抵抗黑胫病的研究。

该实施例具体限定了接种4d后的抗性接种植株的叶片，原因在于，抗性接种植株在接种4d后才开始出现萎蔫现象，以该时期的叶片作为试验对象能够更加准确的反应植株接种后的SoCYP85A1基因的表达量。

本发明实施例还提供了一种用于提高烟草黑胫病抗性的特异性引物，具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

本发明实施例还提供了一种包含如上述实施例所述的用于提高烟草黑胫病抗性的特异性引物的试剂盒。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

抗性接种材料的获得：

根据SoCYP90B1基因序列(Genbank登录号：KT900949)，设计包含ORF区的特异引物，如下所示：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

按照RNA提取试剂盒(Intron Biotech,韩国)说明书从菠菜叶片中提取RNA，采用MaximeTM RT PreMix Kit(Intron biotech,韩国)试剂盒反转录合成cDNA。以上述cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：0.5μL Ex Taq(2×)、2.5μL Buffer、2μLdNTPs、2μL上下游引物(10μmol/L)、2μL cDNA和14.5μL ddH₂O。PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 90s，共35个循环；72℃ 5min。

将上述扩增得到的PCR产物胶回收，按照Gateway^TMLR reaction kit(Invitrogen，美国)说明书将回收产物连接至植物表达载体pB7WG2D,1中，获得含有目的基因的重组载体pB7WG2D,1-SoCYP85A1，采用热激法将其转入农杆菌感受态细胞中。利用农杆菌介导的烟草叶盘方法，将SoCYP85A1基因转入烟草中，采用草甘膦结合GFP荧光筛选再生植株，获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因植株。通过GFP荧光检测转基因株系，将GFP阳性植株进一步提取基因组DNA，利用SoCYP85A1基因的ORF区特异引物进行PCR鉴定。

结果表明，10株再生植株的GFP荧光检测均呈阳性，DNA水平的PCR鉴定亦为阳性，表明该基因成功整合进烟草基因组中。将10个过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系的T₀代植株进行继代培养，每一代均进行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR检测和GFP蛋白检测，并保留阳性植株进行继代培养，其中，T3代植株的PCR检测和GFP蛋白检测均呈阳性，可以进行稳定遗传，因此，将T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株。

实施例2

抗性接种植株抗烟草黑胫病的接种鉴定：

参照“烟草根际土壤浸出液刺激烟草疫霉产孢和接种研究”(杨军等，中国烟草学报，2011,17(2):71-74)活化烟草黑胫病原菌以及土壤浸出液刺激产孢法，待大量产孢后，将其配置成106个/mL的孢子悬浮液；对培养至7叶期的野生型烟草和抗性接种植株进行茎基部注射接种，每株注射1mL上述孢子悬浮液，每次注射处理10株野生型烟草、10株抗性接种植株L₃和10株抗性接种植株L₅，并以等体积无菌水注射处理作为空白对照；在温度为30℃，16h光照/8h黑暗，湿度为90％的光照培养箱中培养，观察记录发病情况。重复3次试验。

按照GB/T 23222-2008对该病害的严重等级程度进行分级，采用以下公式进行病情指数计算：

病情指数＝[Σ(各级病株数×该病级值)/(调查总株数)]

在接菌2d后，野生型株系接种部位陆续出现黑斑，3d后已经有野生株系烟草发生叶片萎蔫现象；抗性接种植株出现零星病斑，未出现萎蔫现象。接菌4d后，抗性接种植株才开始出现萎蔫现象。因此，在接种烟草黑胫病菌4d后，统计抗性接种植株和野生型烟草的发病率和病情指数。

结果表明，注射无菌水的烟草植株发病率为0；野生型烟草的发病率为66.67％，抗性接种植株L₃和L₅的发病率分别为36.67％和33.33％，如图1所示；野生型烟草的病情指数为5.13，抗性接种植株L₃和L₅的病情指数分别为1.9和1.73，如图2所示。

抗性接种植株的发病率和病情指数均明显低于野生型烟草的发病率和病情指数，说明过量表达SoCYP85A1基因增强了烟草植株对黑胫病的抗性。

实施例3

接菌前后转基因烟草植株SoCYP85A1基因的表达变化：

取接菌4d前后的烟草叶片，液氮冷冻后迅速研磨成粉末，根据RNA提取试剂盒(OMEGA，美国)的操作步骤从烟草叶片中提取RNA，基因特异性引物由Primer 5.0设计和NCBI验证完成，特异性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：AATCAAGCTCAACTGCCCAAC

下游引物(5’-3’)：CAGGGAGGTCAATAGGGAGAGA

以烟草Actin为内参基因，设计上下游引物：

上游引物(5’-3’)：CAAGGAAATCACCGCTTTGG，

下游引物(5’-3’)：AAGGGATGCGAGGATGGA

反转录合成cDNA，所用试剂PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)。反应条件见表1、表2。

表1去除gDNA反应试剂及体积

反应温度42℃，2min。

表2第一链cDNA合成反应试剂及体积

反应温度42℃，15min；85℃，5s。

使用TaKaRa SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，在德国耶拿的qTOWER实时定量PCR系统中进行荧光检测，定量检测PCR。其中，PCR体系含5μL SYBRPremix Ex Taq II(2×)、1μL上下游引物(10μmol/L)、1μL cDNA(100ng/μL)和2μL ddH₂O。

PCR反应参数设置为：95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s，循环35次。每个样品重复检测3次，采用2^–ΔΔCT法分析实验结果。

结果表明，接菌4d前后，转基因烟草体内的SoCYP85A1基因的表达倍数显著增加，增加9倍，如图3所示。

实施例4

接菌前后野生型和转基因烟草植株油菜素甾醇含量测定：

为了明确T₃代转基因株系抗病性提高是否是由于内源油菜素甾醇含量变化所导致的，对培养至7叶期的野生型烟草和转基因烟草进行茎基部注射接种黑胫病菌，接种4d后，取3个株系相同部位的叶片，采用液相色谱法检测内源油菜素甾醇类物质的种类和含量。

结果显示，在接菌后，转基因株系的油菜素甾酮(castasterone,CS)含量显著增加，如图4所示。

实施例5

接菌前后野生型和转基因烟草植株防御酶和防御酶活性大小的测定：

植物的抗病反应涉及植物体内一系列复杂的生理生化变化，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)是植物体内较重要的防御酶，大量研究表明，寄主植物和病原物相互作过程中，这些酶与植物的抗病性密切相关。因此，研究接种烟草黑胫病后烟草叶片防御酶活性的变化，可以更好地说明过量表达SoCYP85A1基因的烟草对烟草黑胫病的抗性作用，明确T₃代转基因株系抗病性提高的机理。

由此检测了抗性植株的防御酶的活性，具体如下：

对培养至7叶期的野生型烟草和转基因烟草进行茎基部注射接种黑胫病菌，以注射无菌水的烟草作为对照，接种4d后，取3个株系相同部位的叶片，以及注射无菌水作对照的烟草的相同部位的叶片。采用南京建成生物科技有限公司的酶活检测试剂盒分别测定SOD(货号：A001-4)、POD(货号：A084-3)、PPO(货号：A136)和PAL(货号：A137)的活性。

结果显示，在接菌后，转基因株系的SOD、POD、PPO和PAL活性显著高于野生型，如图5所示。因此，过量表达SoCYP85A1基因通过调控防御酶的活性来增强烟草植株对黑胫病的抗性。

实施例6

接菌前后野生型和转基因烟草植株防御酶基因相对表达量的检测：

为进一步从分子水平明确过量表达SoCYP85A1基因提高烟草植株对黑胫病抗性的机理，采用荧光定量PCR对实施例5中的防御酶对应的基因进行了相对表达量的检测，荧光定量PCR方法同实施例3，取样方法同实施例5，基因特异性引物如表3：

表3基因特异性引物序列

结果显示，在接菌后，转基因株系的NtSOD、NtAPX、NtPPO和NtPAL的表达量显著高于野生型，如图6所示。因此，过量表达SoCYP85A1基因通过显著上调防御酶基因的表达量来增强烟草植株对黑胫病的抗性。

由实施例1-6所示的实验结果可以发现，通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株对烟草黑胫病具有很好的抗性，其接种烟草黑胫病菌后的发病率小于37％。通过对接种前后抗性接种植株进行SoCYP85A1基因表达量分析、油菜素甾醇含量检测、防御酶活性检测及相关防御酶的基因表达量的测定，验证了施加内源BRs可以通过转录调控防御酶基因的表达量来提高烟草体内防御酶的活性，进而增强烟草的抗病性，为内源BRs在植物抗病性的研究开辟了新的思路。

Claims (6)

1.一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法，其特征在于，通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性；

所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性具体包括：

所述抗性接种植株在接种烟草黑胫病原菌后，抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量提高，生成由SoCYP85A1基因编码的内源油菜素甾醇合成的关键限速酶，利用关键限速酶调控油菜素甾醇的生物合成量，通过提高烟草体内防御酶的活性来提高烟草对黑胫病的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系由以下方法得到：

根据SoCYP85A1基因序列设计特异性引物，利用所述特异性引物扩增得到PCR产物，将所述PCR产物连接至植物表达载体pB7WG2D,1中，获得含有目的基因的重组载体，将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后采用农杆菌介导的烟草叶盘方法将SoCYP85A1基因转入烟草中，筛选再生植株，获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株具体包括：

将过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草植株的T₀代植株进行继代培养，每一代均进行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR检测和GFP蛋白检测，并保留阳性植株进行继代培养，其中，T3代植株的PCR检测和GFP蛋白检测均呈阳性，可以进行稳定遗传，因此，将T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性接种植株接种烟草黑胫病原菌包括以下步骤：

对培养至7叶期的野生型烟草和抗性接种植株的茎基部注射接种烟草黑胫病原菌，光照培养箱中培养，观察记录发病情况。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量通过以下方法测得：

取所述接种烟草黑胫病原菌前和接种4d后的抗性接种植株的叶片，提取RNA，以烟草Actin为内参基因，反转录合成cDNA模板，对多重PCR扩增反应的反应产物进行荧光检测，采用2^–ΔΔCT法分析实验结果，得到接种前后抗性接种植株的SoCYP85A1基因的表达量。

Images