CN113046362B

CN113046362B - 提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫dna损伤的基因及其用途

Info

Publication number: CN113046362B
Application number: CN202110284370.2A
Authority: CN
Inventors: 刘明英
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2021-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2041-03-17
Also published as: CN113046362A

Abstract

本发明公开了一种提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因及其用途，通过构建东南景天cDNA文库，借助模式植物拟南芥，首次从东南景天cDNA文库中发现了具有提高镉抗性及镉含量、降低转基因拟南芥镉胁迫下基因组DNA损伤程度的基因SaCRRP。本发明发现SaCRRP(Cd resistance related protein)基因能提高酵母镉抗性；将其转入拟南芥中，转基因拟南芥的镉抗性及镉含量均得到提升；转基因拟南芥的基因组DNA在镉胁迫条件下损伤程度低于野生型。SaCRRP为培育植物高抗镉新种质用于重金属污染土壤植物生物修复提供基因资源。

Description

提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因及其用途。

背景技术

随着我国工业化建设的迅猛发展，土壤中重金属污染问题日益严峻，如何修复重金属污染的土壤已经成为环境保护工作的热点。传统的治理重金属污染土壤的方法主要涉及物理修复、化学修复以及生物学修复等方面的技术。但是这些传统的土壤重金属修复技术存在处理时间长、处理费用高、工作量大、应用范围小等弊端，且不能从根本上移除土壤中的重金属。而植物修复技术是利用绿色植物来固定、吸收、转移、转化、降解污染物，使之变为对环境无害的物质，并将污染物加以回收利用的一项新兴的环境治理技术，其具有绿色、环保、可持续的特质。作为重金属污染土壤修复应用核心的重金属超积累植物多为草本，存在生物量小、清除速率低等局限性，严重制约了植物修复技术的应用。因此，通过分子生物学手段解析超积累植物中的重金属抗性分子机制，鉴定重金属胁迫应答关键基因，用于培育高生物量的重金属抗性新品种具有至关重要的意义。

超积累型东南景天在地上部分可以积累9,000μg g^-1Cd和29,000μg g^-1Zn而不呈现任何毒性症状，极具研究价值。近年来，关于HE型景天中涉及Cd的离子转运，螯合，氧化还原修复等进程相关的基因已经被研究报道。然而该植物如何在高浓度Cd的存在下减轻Cd的细胞毒性，维持基因组的稳定性的相关机制目前仍未开展研究。研究维持镉胁迫下基因组稳定的相关基因，对于提高转基因植物镉胁迫下的存活率具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因及其用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因，从超积累型东南景天中获得，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种上述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因所编码的蛋白，从超积累型东南景天中获得，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，含有锌指结构。

一种上述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于产生转基因拟南芥。

一种上述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于提高植物的镉抗性。

一种上述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于提高植物的镉含量。

一种上述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于减轻植物在镉胁迫下的DNA损伤。

一种上述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于减少土壤镉含量。

进一步地，所述植物为拟南芥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明基因SaCRRP目前尚未见相关的报道研究，该基因源自于东南景天cDNA文库拟南芥异源表达后的镉胁迫筛选；通过构建SaCRRP的酵母表达载体，利用酵母点板实验可验证本发明所述基因能提高酵母镉抗性，流式细胞检测技术证实镉处理后Δycf1_SaCRRP酵母中的活细胞比例高达71.4％，而在Δycf1_EV中酵母活细胞比例仅为41.8％。

(2)本发明将SaCRRP基因在拟南芥中异源表达，发现该基因可以显著提高转基因拟南芥幼苗及成苗的镉抗性及镉含量，与普通拟南芥相比，镉胁迫后幼苗的生物量提高了25-32％，幼苗根长提高了30-65％，成苗的镉含量提高了144-223％。

(3)本发明所述的SaCRRP基因为培育具有高镉抗性植物新种质提供基因资源，可应用于镉污染地区的土壤监测与治理中，在研究植物生物修复技术、改善土壤重金属污染状况等方面起着重要作用。

附图说明：

图1为本发明中SaCRRP基因的转基因拟南芥幼苗在含镉MS培养基的筛选图片；

图2为本发明中SaCRRP基因的转基因拟南芥PCR扩增电泳图；

图3为本发明中T easy-SaCRRP基因在大肠杆菌中的PCR扩增电泳图；

图4为本发明中SaCRRP基因转化入酵母突变体ycf1后在含30μM·L^-1CdCl₂的SG-U培养基上菌落的生长情况示意图；其中，control为不含镉的培养基，作为对照；30μM CdCl₂代表培养基内含有30μM·L^-1CdCl₂；SaCRRP为转基因酵母；EV(empty vector)为转空载体酵母；OD₆₀₀为测定含酵母细胞的液体培养基在600nm时的吸光度；1、0.1、0.01、0.001分别为依次稀释10倍的酵母；

图5为本发明中SaCRRP基因转化入酵母突变体ycf1后在含30μM·L^-1CdCl₂的液体SG-U培养中的存活率鉴定示意图；其中，Cd EV-4为镉胁迫下转化空载体的酵母转化子流式检测图；Cd SaCRRP-1为镉胁迫下转化SaCRRP基因的酵母转化子流式检测图；

图6为SaCRRP转基因拟南芥T3代种子和野生型拟南芥种子在1/2MS固体培养基上培育十天后的根长和平均鲜重对比图；其中，Control代表不含镉的1/2MS固体培养基；100μM Cd代表培养基内含有100μM·L^-1CdCl₂；WT为野生型拟南芥对照；OE1，OE2，OE3为SaCRRP基因转基因拟南芥阳性株系；

图7为SaCRRP转基因拟南芥T3代种子和野生型拟南芥成苗镉胁迫后镉含量测定示意图；其中，WT为野生型拟南芥对照图，OE1，OE2，OE3为SaCRRP基因转基因拟南芥阳性株系。

图8为SaCRRP转基因拟南芥和野生型拟南芥成苗镉胁迫后叶原生质体基因组DNA的单细胞凝胶电泳实验结果示意图；其中，(A)和(B)是SaCRRP转基因拟南芥镉胁迫前后的叶原生质体基因组DNA的单细胞凝胶结果；(C)和(D)是野生型拟南芥镉胁迫前后的叶原生质体基因组DNA的单细胞凝胶结果；

图9为SaCRRP转基因拟南芥和野生型拟南芥成苗镉胁迫后叶原生质体基因组DNA的单细胞凝胶电泳结果的CASP软件分析结果示意图；其中，选取了损伤程度为1％、10％和40％的细胞DNA进行统计分析。

具体实施方式

本发明一种提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因及其用途，通过构建东南景天cDNA文库，借助模式植物拟南芥，首次从东南景天cDNA文库中发现了具有提高镉抗性及镉含量、降低转基因拟南芥镉胁迫下DNA损伤程度的基因，并将其命名为Sedumalfredii Cd resistance related protein(SaCRRP)；所述基因SaCRRP从东南景天的cDNA文库中所分离获得，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。

将所述SaCRRP基因转入镉敏感型酵母突变体菌株(ycf1)中，通过酵母点板实验发现在含镉的培养基上转基因酵母的生长状况明显优于对照组。将所述SaCRRP基因在拟南芥中异源表达，发现在拟南芥中异源表达SaCRRP基因后可以显著提高转基因拟南芥的镉抗性及镉含量，且转基因拟南芥的基因组在镉胁迫条件下损伤程度低于野生型。SaCRRP为培育高生物量的抗镉新种质和重金属污染土壤植物生物修复提供基因资源，在研究植物生物修复技术、改善土壤重金属污染状况等方面起着重要作用。

本发明的目的之一是提供一种提高镉抗性、镉含量，减轻镉胁迫下基因组DNA损伤的基因SaCRRP。

本发明的目的之二是提供一种上述提高镉抗性、镉含量，减轻镉胁迫下基因组DNA损伤的基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.2所示。

本发明的目的之二是提供一种含有上述提高镉抗性、镉含量，减轻镉胁迫下基因组DNA损伤的基因的转基因拟南芥植株。

本发明的目的之三是提供一种上述提高镉抗性、镉含量，减轻镉胁迫下基因组DNA损伤的基因在提高植物的镉抗性、镉含量、保护镉胁迫下基因组DNA方面的应用。

本发明的目的之四是提供一种上述提高镉抗性、镉含量，减轻镉胁迫下基因组DNA损伤的基因在治理土壤镉污染方面的应用。

下面结合附图和实施例，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

(1)菌株与载体：大肠杆菌/酵母穿梭载体pYES2.0G、大肠杆菌/酵母穿梭表达载体pYES2-DEST、植物表达载体pBI121、农杆菌EHA105均购自Invitrogen公司。大肠杆菌DH5α购自康为世纪生物科技有限公司。T-easy载体购自Promega公司。镉敏感型酵母突变体菌株(ycf1)购自Euroscarf公司。植物表达载体pBI121进行了载体改造，增加了sfiI的酶切位点。

(2)酶与试剂盒：Total RNA Purification Kit植物组织总RNA提取试剂盒购自Norgen公司。SMART^TM cDNA文库构建试剂盒购自Clontech公司。DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒均购自Axygen生物技术公司。限制性内切酶sfi I购自New EnglandBiolabs公司。

(3)反应引物：SMART^TM IV Oligonucleotide、CDS III/3'PCR Primer、5'PCRPrimer均购自Clontech公司。

实施例1：

镉超积累矿山型东南景天cDNA文库的构建

(1)以筛选出的镉超积累矿山型东南景天(采自浙江省衢州市一个古老的铅锌矿区，后移栽至本实验室)水培苗为材料，经400μM·L^-1的氯化镉(CdCl₂)胁迫处理后用植物组织总RNA提取试剂盒(Total RNA Purification Kit)提取镉胁迫下的东南景天总RNA，经过寡(dT)-纤维柱过滤得到纯化mRNA；

(2)全长cDNA的获得

cDNA链的合成使用SMART^TM cDNA文库构建试剂盒完成；

cDNA第一链的合成：以上述步骤(1)中得到的纯化mRNA为模板，SMART^TM IVOligonucleotide(10μM)(序列如SEQ.ID.No.3所示：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’)和CDS III/3'PCR Primer(10μM),序列如SEQ.ID.No.4所示：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3’(N＝A,G,C,or T；N_-1＝A,G,or C)作为引物，按照试剂盒说明书加样合成cDNA第一链；

cDNA第二链的合成：以cDNA第一链为模板，CDS III/3'PCR Primer(序列如SEQ.ID.No.4所示)和5'PCR Primer(序列如SEQ.ID.No.5所示：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)作为引物，按照试剂盒说明书依次加入缓冲液(Buffer)、dNTP Mix、Polymerase Mix和双蒸水，在PCR仪上合成得到全长cDNA。

PCR反应程序：95℃→1min；(95℃→15sec；68℃→6min)×20个循环。

(3)构建cDNA文库

用sfi I酶分别对改造后的植物表达载体pBI121和上述步骤(2)得到的全长cDNA进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物并用DNA凝胶回收试剂盒回收大于300bp的条带；

将植物表达载体pBI121酶切回收产物与大于300bp的全长cDNA酶切产物于16℃过夜连接；将连接产物通过电激转化法转入大肠杆菌DH5α中，电激转化产物涂于含有氨苄青霉素抗性的LB培养基上37℃过夜倒置培养，随机挑选长出的单克隆分别以35-F(序列如SEQ.ID.No.6所示：5’-CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAG-3’)，NOS-R(序列如SEQ.ID.No.7所示：5’-GATAACATCGCAAGACCGGCAACAGG-3’)引物检测进行PCR鉴定。

实施例2：

抗镉转基因拟南芥的筛选及鉴定

(1)提取实施例1中得到的镉超积累矿山型东南景天cDNA文库的混合质粒，电激转化农杆菌EHA105：

使用质粒DNA提取试剂盒提取cDNA文库混合质粒，将提取的混合质粒电激转化至EHA105菌株中，电激转化所用电压2.5V；转化产物于5mL LB液体培养3h后转入100mL液体LB(含利福平50mg·L^-1+Kan 20mg·L^-1)28℃培养3天，获得农杆菌工程细胞系。

(2)东南景天cDNA文库在拟南芥中的异源表达

采用花絮侵染法进行拟南芥转化，待拟南芥成熟后收取种子并干燥。将干燥后的T0代种子在1/2MS(含CdCl₂ 100μM+Kan 20mg·L^-1)固体培养基上；4℃环境下暗培养2天，随后将培养皿转移至拟南芥室中培养，培养一周左右；如图1所示，能够在含有镉的MS上生长的拟南芥幼苗呈绿色(箭头指示处)，根系旺盛，叶片萌出，而无法生长的幼苗则发黄萎缩。随后将可以在镉MS平板上生根生长并具有Kan抗性的拟南芥植株转移至营养土中，在拟南芥室中培养。

(3)进行TA克隆并测序获得插入片段序列信息：

待拟南芥植株生长至4-6叶幼苗后，提取植株叶片DNA，借助35S-F/NOS-R进行PCR检测，检测阳性植株作为转基因植株株系，逐代培养直至收获T3代纯合体种子并于-4℃保存，用于后面的生物学功能分析。

分别对实施例2中步骤(2)得到的转基因拟南芥植株进行PCR鉴定，用琼脂糖凝胶电泳分离并观察SaCRRP基因目的片段条带，PCR所用引物为35S-F(如SEQ.ID.No.6所示)和NOS-R(如SEQ.ID.No.7所示)，为所采用的植物表达载体pBI121的通用引物。如图2所示，图中M为DNA分子量标准；SaCRRP代表以35S-F/NOS-R为引物检测SaCRRP基因的转基因拟南芥DNA的PCR产物；CK^-代表以35S-F/NOS-R为引物检测野生型拟南芥DNA的PCR产物。从图2中可以看出转基因拟南芥中有750bp左右的扩增片段，而阴性对照野生型拟南芥则未有扩增片段，说明该转基因拟南芥中存在外源基因的插入表达，且该基因长度在500bp左右，根据后续的测序结果，我们知道该外源DNA片段编码SaCRRP基因。

使用DNA凝胶回收试剂盒回收SaCRRP基因转基因拟南芥DNA的PCR条带。通过TA克隆技术连接PCR回收产物与T-easy载体，经过热激法转入大肠杆菌DH5α，并涂板至含氨苄青霉素抗性的LB培养基上于37℃倒置过夜培养。挑取单克隆进行T-easy-SaCRRP在大肠杆菌中PCR检测，电泳结果如图3所示，图中M为DNA分子量标准，1-6分别代表M13F/M13R为引物检测T-easy-SaCRRP在大肠杆菌中的PCR产物。从图3菌落PCR结果中可以看出M13F/M13R为引物获得700bp左右的PCR扩增条带，证明SaCRRP基因转基因拟南芥DNA的PCR回收产物与T-easy载体重组成功，可用于下一步的测序。

将菌液送去上海生工生物工程有限公司测序，获得序列表中的序列SEQ.ID.No.1。根据测序得到的SaCRRP基因的开放阅读框(ORF)，推算出基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ.ID.No.2。PCR及测序引物为T-easy载体通用引物M13-F(如SEQ.ID.No.8所示：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)和M13-R(如SEQ.ID.No.9所示：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)。

实施例3：

(1)酵母表达载体的构建

以筛选出的镉超积累矿山型东南景天(采自浙江省衢州市一个古老的铅锌矿区，后移栽至本实验室)水培苗为材料，用Total RNA Prification Kit植物组织总RNA提取试剂盒(Norgen公司)提取镉胁迫下的东南景天总RNA，反转录后获得cDNA，以其为模板，根据SaCRRP的ORF设计上下游特异性引物SaCRRP-F1(如SEQ.ID.No.10所示：ATGGAGCATGTTAATTCAG)和SaCRRP-R1(如SEQ.ID.No.11所示：TTAGATTTTATCAGAGAG)借助PCR获得SaCRRP的ORF，并将其构建至酵母表达载体pYES2-SaCRRP测序正确后获得阳性重组质粒。

(2)酵母转化子镉胁迫下抗性鉴定

pYES2-SaCRRP酵母表达载体质粒与pYES2-DEST空载体质粒分别电激转化至镉敏感型酵母突变体ycf1菌株中，将获得的酵母转化子及空载体于SD-U平板划线培养3天。

挑选单菌落，振荡培养至OD₆₀₀为1.0时依次稀释10倍并分别在不含镉、含30μM·L^- ¹CdCl₂的SG-U平板上进行点板实验，验证镉抗性功能。如图4所示，结果发现，在不加镉的培养基上，酵母的菌落大小和数量基本一致，说明含有空表达载体和SaCRRP基因表达载体的酵母长势基本一致，其生长状况也较为一致；在30μM·L^-1镉处理时，两种酵母的生长均受到一定程度的抑制，但空载酵母转化子比表达SaCRRP基因的酵母转化子受抑制情况严重。结果表明，在镉处理条件下，SaCRRP基因可以显著提高镉敏感型酵母突变体ycf1的镉抗性，证实SaCRRP基因的异源表达可以发挥其提高镉抗性的作用。

(3)酵母转化子镉胁迫下存活率鉴定

以转化空载体(pYES2)的酵母Δycf1_EV作为对照研究含有SaCRRP基因的酵母转化子Δycf1_SaCRRP的Cd抗性。同时挑取已划线活化后的Δycf1_EV和Δycf1_SaCRRP酵母单菌落于5mL SD-U液体培养基中28℃，180rpm过夜培养，测定600nm处的吸光值，并通过计算调整Δycf1_EV和Δycf1_SaCRRP菌液体积使得两种酵母菌总量一致，随后5000g离心5min，尽量吸净上清液，换相同体积的SG-U液体培养基于28℃，180rpm震荡培养5-6h，再次测定OD值，待两种类型酵母OD₆₀₀值约为0.4且相差不大时第二次调整菌体浓度，并用相同体积的SG-U重悬菌体。两种类型酵母各挑取3个单克隆，每个Cd抗性实验均设置3次重复。

吸取上述已准备的200μL PBS重悬的酵母菌液，加入4μL PI染料避光染色20min后，利用流式细胞仪检测细胞数目，设置记录细胞数目上限为20 000个，得到数据后圈出门进行分析。如图5所示，在镉处理后测定相同酵母细胞数目的情况下，Δycf1_SaCRRP酵母中的活细胞比例为71.4％，而在Δycf1_EV中酵母活细胞比例仅为41.8％。综合以上酵母镉抗性实验结果表明，SaCRRP基因在酵母中的异源表达显著提高了酵母对镉胁迫的耐受性。

实施例4：

(1)转基因拟南芥纯合子的筛选：

转基因拟南芥经PCR和qRT-PCR检测之后，选取表达量高的阳性植株作为转基因植株株系，逐代培养直至收获T3代纯合体种子并于-4℃保存，用于后面的生物学功能分析。

(2)转基因拟南芥镉抗性的测定：

将获得的转基因拟南芥T3代种子(OE1、OE2和OE3)和野生型拟南芥种子(WT)用灭菌牙签播种在含有100μM CdCl₂的1/2MS固体培养基上，同时正常生长在1/2MS固体培养基的种子作为对照，10天后进行观察，测量根长并称量鲜重。结果如图6所示，未胁迫条件下野生型拟南芥和转基因拟南芥均正常生长，未有明显差异，根长约在4.5cm左右。镉胁迫后，野生型拟南芥的生长明显受到抑制，其根长约0.5cm左右，而超表达SaCRRP的转基因拟南芥的根长尽管生长也受到抑制，但是其根长长度显著长于野生型拟南芥，约为1.5cm左右。通过生物量的测量也表明超表达SaCRRP的转基因拟南芥的鲜重显著高于野生型株系。幼苗胁迫实验表明转基因拟南芥的幼苗对镉胁迫的耐受性高于野生型，SaCRRP的超表达在一定程度上可以提高转基因拟南芥的镉抗性。

(3)转基因拟南芥镉胁迫后镉含量测定：

按照上述方法培养野生型拟南芥和SaCRRP转基因拟南芥株系OE1、OE2和OE3，移栽后30天左右，选取生长状态一致的野生型和转基因拟南芥开始用含0.5mM CdCl₂的水溶液浇透拟南芥，待土壤干燥后用同样的溶液进行浇透，处理时间为2周，以未处理的拟南芥作为对照。分离并获取不同处理时间的野生型和转基因拟南芥植株的地上部位，用双蒸水清洗三遍。将所有样品放至105℃烘箱中干燥30min后80℃直至样品彻底烘干至恒重。高含量的镉元素采用火焰原子吸收光度法测定，而低含量的镉元素采用石墨炉原子吸收光度法测定。通过上机浓度、称样量和定容体积计算植物组织中的镉含量。结果如图7所示，WT和OE1，OE2，OE3三个转基因株系中的镉离子含量分别为28.3μg.g^-1FW，62.56μg.g^-1FW，51.96μg.g^- ¹FW和40.3μg.g^-1FW，经过统计学分析表明转基因株系中的Cd含量显著高于WT。

(4)转基因拟南芥镉胁迫基因组DNA损伤程度检测：

选择在营养土中生长3周左右未开花的WT和转基因拟南芥第6、7片真叶进行叶片原生质体的分离。将分离出的拟南芥原生质体加入100μM CdCl₂处理30min，并进行单细胞凝胶电泳实验，对Cd处理后各株系拟南芥叶片DNA损伤程度进行检测，并利用CASP软件分析原生质体的DNA损伤程度。结果如图8所示，在对照组中，WT和转基因拟南芥原生质体损伤程度较轻，而在Cd胁迫后，单细胞凝胶电泳结果显示在各株系拟南芥原生质体均有彗星拖尾现象，而在WT株系中拖尾更明显。CASP软件分析结果如图9显示，SaCRRP转基因拟南芥损伤程度为40％的细胞比例为48.9％，而野生型拟南芥损伤程度为40％的细胞则高达83.3％，SaCRRP转基因拟南芥损伤程度为10％的细胞比例为37.4％，而野生型拟南芥损伤程度为10％的细胞则高达11.5％，SaCRRP转基因拟南芥损伤程度为1％的细胞比例为14.4％，而野生型拟南芥损伤程度为1％的细胞则高达5.7％。上述实验表明，SaCRRP基因能够减轻镉对基因组DNA的损伤，推测该基因有可能通过保护转基因拟南芥的基因组DNA来提高转基因植物的镉抗性。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因及其用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> Sedum acre

<400> 1

atggagcatg ttaattcaga ttgccaggct cctccggatg cacctcagct ctgtgcaaac 60

aactgtggat ttttcggaag tgctgcagca aataatatgt gctccaagtg tttcaaggaa 120

atggtgtcga accaacaaca agcacaaatt gctgtatctt ccttcgtcag ttgcagctct 180

tccaacacga ctgctgaggt tatccagaaa gtcactacaa cggttgaatc tgattcatgc 240

aagtctgtcg ttttgactaa tgagtcagcc tctgctctac ctccaaatga caacagcaac 300

gagaagccaa aacagggccc aacccgttgc catacttgcc gtaagcgtgt aggattgact 360

ggtttcaact gccgctgcgg gagcaccttc tgttccttac acaggtactc agacaaacac 420

gagtgcctgt tcgactacaa aaacgctggt cgtgatgcaa ttgcagaagc aaacccagtt 480

atcaaggctg acaagctctc tgataaaatc taa 513

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> Sedum acre

<400> 2

Met Glu His Val Asn Ser Asp Cys Gln Ala Pro Pro Asp Ala Pro Gln

1 5 10 15

Leu Cys Ala Asn Asn Cys Gly Phe Phe Gly Ser Ala Ala Ala Asn Asn

20 25 30

Met Cys Ser Lys Cys Phe Lys Glu Met Val Ser Asn Gln Gln Gln Ala

35 40 45

Gln Ile Ala Val Ser Ser Phe Val Ser Cys Ser Ser Ser Asn Thr Thr

50 55 60

Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Thr Thr Thr Val Glu Ser Asp Ser Cys

65 70 75 80

Lys Ser Val Val Leu Thr Asn Glu Ser Ala Ser Ala Leu Pro Pro Asn

85 90 95

Asp Asn Ser Asn Glu Lys Pro Lys Gln Gly Pro Thr Arg Cys His Thr

100 105 110

Cys Arg Lys Arg Val Gly Leu Thr Gly Phe Asn Cys Arg Cys Gly Ser

115 120 125

Thr Phe Cys Ser Leu His Arg Tyr Ser Asp Lys His Glu Cys Leu Phe

130 135 140

Asp Tyr Lys Asn Ala Gly Arg Asp Ala Ile Ala Glu Ala Asn Pro Val

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asp Lys Leu Ser Asp Lys Ile

165 170

Claims

1.一种提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因，从超积累型东南景天中获得，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因所编码的蛋白，从超积累型东南景天中获得，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；含有锌指结构。

3.一种超表达如权利要求1所述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因在产生转基因拟南芥中的应用。

4.一种如权利要求1所述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因在提高植物的镉抗性中的应用，其中，所述植物为拟南芥。

5.一种如权利要求1所述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于提高植物的镉含量中的应用，其中，所述植物为拟南芥。

6.一种如权利要求1所述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于减轻植物在镉胁迫下的DNA损伤中的应用，其中，所述植物为拟南芥。

7.一种超表达如权利要求1所述提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫DNA损伤的基因用于减少土壤镉含量的应用。