CN101550420A - 烟草受体类似蛋白激酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及烟草受体类似蛋白激酶基因的克隆，属于植物基因工程领域。克隆了一个烟草受体类似蛋白激酶(NrRLK)基因cDNA的全长序列。以此设计出一对NrRLK基因特异引物用半定量PCR(RT－PCR)方法，检测其在接菌黑胫病菌后的抗性野生烟草N.rependa不同时期根中的表达情况，结果显示该基因只在黑胫病侵染后9天表达。对该基因编码的理论氨基酸序列进行分析表明，该蛋白可能参与了植物的防卫反应，故该基因可能与黑胫病抗性有直接的关系。以此基因为靶基因，通过基因工程的方法改良目前烟草黑胫病的抗性，培育高抗黑胫病的烟草品种，应用于烟叶生产。

Description

烟草受体类似蛋白激酶基因及其应用

技术领域：

本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及烟草受体类似蛋白激酶基因，其获取方法以及在抗黑胫病病菌转基因烟草植株中的应用。

技术背景：

烟草是我国重要的经济作物之一。由于烟草以烟叶为收获对象，病害对烟草产量和品质的影响更为严重。烟草黑胫病由Van Breda de Haan于1896年发现于印度尼西亚的爪哇，它是世界烟草生产中危害最严重的病害之一。它是由烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica f.nicotianae)引起的一种烟草毁灭性土传真菌病害，主要侵染烟草根部及茎基部，是烟草的主要病害之一[孔凡玉，朱贤朝，石金开，等.我国烟草侵染性病害发生趋势及防治对策.中国烟草，1995(1)：31-34.]。该病广泛地分布于世界烟草种植区，在我国除黑龙江省尚无发现之外，其余各植烟省区均有发生，平均发病率为5％～12％，严重田块高达75％，甚至造成绝收[陈瑞泰，朱贤朝，王智发，等.全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调研报告，中国烟草科学，1997(4)：1-7.和苏德成.烟草病虫害.北京：中国财经出版社，1992：87-92.]。

烟草黑胫病属于高温高湿型病害，其发生主要与气温和降雨量有关。南方烟区黑胫病发生与平均气温关系密切，一般高于22℃易发生。对于烟草黑胫病的防治措施主要有种植抗病品种，合理轮作，适时早栽及使用化学农药等[蔡红艳，段宏伟.烟草黑胫病的发生规律及防治技术研究初报.中国烟草，1993，(3)：20-21.]

种植抗病品种是最经济，有效的防治病害的方法。目前，对烟草黑胫病抗病品种的选育，多采用常规育种，效率底，成效甚微，尚未培育出优质高抗烟草品种。将生物工程与传统育种相结合可以加快育种进程，快速改良作物抗病性。

本专利所克隆的受体类似蛋白激酶(NrRLK)基因，是蛋白质激酶中的一种。蛋白激酶在信号传导过程中起着重要作用，而受体蛋白激酶是蛋白激酶中的重要一类，也是信号分子的重要受体。受体激酶包含有多个基因家族。在识别与转导膜外信号方面发挥着重要的作用。蛋白激酶主要是通过催化受体蛋白的可逆磷酸化来传递各类信号的。植物受体激酶具有酪氨酸的拓扑结构，但含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的序列特征。受体蛋白激酶参与了植物许多由激素和胞外环境信号引起的生理生化过程，如，自交不亲和、调节胚乳和花粉的发育、花的脱落、油菜素类固醇信号反应、环境胁迫及植物抗病等。在已克隆的抗病基因中水稻的Xa21、拟南芥的PBS1、大麦的RPG1、番茄的PTO都含有受体蛋白激酶保守结构域。

植物受体类似蛋白激酶依其结构特点可分为三类：第一类含有受体类似激酶区与一个N端胞外S区；第二类除了受体类似激酶区外还有一个富含亮氨酸重复；第三类只含有激酶区，没有明显的配基结合区，但其功能的发挥也需要一段保守氨基酸序列。已克隆的番茄PTO、大麦的RPG1基因属于第三类激酶基因，PTO所编码的129～224位氨基酸参与了病原物的识别及与无毒基因AvrPto的相互作用。RPG1基因编码两个激酶区，具体作用机理还不清楚。分析克隆的烟草受体类似蛋白激酶基因编码的氨基酸，它只含有一个保守的蛋白激酶区，与番茄的PTO结构非常相似，烟草受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)与PTO的功能区(129～224氨基酸)非常保守，可能它们在与病原物的相互作用中有相似的作用机理。

烟草中克隆的抗病基因只有抗烟草花叶病的N基因[Dinesh-Kumar，S.P.，Tham，W.H.and Baker，B.J.Structure-function analysis of the tobacco mosaic virusresistance gene N.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97(26)：14789-14794.]。黑胫病抗性基因的克隆还未见报道。

发明内容

技术问题：本发明的目的是克隆一个烟草受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)cDNA的全长序列，以此设计出一对NrRLK的特异性引物利用RT-PCR方法，检测该基因在接菌黑胫病病菌后的抗性野生烟草N.rependa不同时期根中的表达情况。

技术方案：

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

烟草受体类似蛋白激酶基因，简称NrRLK基因，它具有附图1所述的碱基序列。

烟草受体类似蛋白激酶基因，由下述方法获取：利用其它作物中已克隆的激酶类抗病基因保守域设计引物，从野生烟草N.rependa中进行PCR扩增，回收预期大小的片段，将回收的片段连入pGEM-T easy Vector(Promega)，测序；测序结果经手工去除载体序列后，在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析；将BLASTx分析结果与激酶类有关的6条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现3条具有连续的ORF；用具有连续ORF的3条序列设计特异引物，分析其在接菌黑胫病病菌后的野生烟草N.rependa根组织中不同时期的表达情况，利用受黑胫病病菌诱导表达序列设计两条5′RACE引物与两条3′RACE引物，以接菌黑胫病病菌后9d的N.rependa根组织为材料，获得其全长cDNA。

该基因的RT-PCR引物为：

F：5′-AAGACAGGGCTTTTGCTTGA-3′

R：5′-GCCCACAAGATTGGGATCTA-3′

5′RACE所用引物：

GSP1：5′-AGATGCGGATGGTGGAACTG-3′

GSP2：5′-AAGACCTTGTCGGGACTCAG-3′

3′RACE所用引物：

GSP1：5′-GTTTACTCGTTCGGTGTTGT-3′

GSP2：5′-GAATGGGCAATGAAGAAGAC-3′

烟草受体类似蛋白激酶基因用作为靶基因。

抗黑胫病病菌转基因烟草，是由烟草受体类似蛋白激酶基因通过农杆菌介导的方法将该基因导入烟草，在黑胫病病菌诱导后特异过量表达，获得的转基因植株。

烟草受体类似蛋白激酶基因在制备抗黑胫病病菌转基因烟草中的应用。

烟草受体类似蛋白激酶基因(见附图1)，长度为1467bp，序列为SEQ ID NO.1，如下：

 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGAAGCTTTTAGGGGTAATGAGAGGGAGAGACGCACAATAACTATCCAAAGTCCCCCTGCACAGTATGACTTATCACTCTCTCATCTTCTCCAATCTCTAATCTCCAATGTTCTGGAAATAGCCGGGAGCAGCTTTCCCCAGTCAAAAGATATATGGATTCCTTTATCTGGTAACGGTGGCACTCCACTCCATACACCATGGGAAGCAAGCATTCAAAGGGAACAACT TCCATAAGTGATGCTTCAAACTCGAATTATCGTGTTCCTATTGAGAATTATCGA GTTCCTTTTGCAGATTTGCAGGAAGCAACTAACGACTTTGACGAGAGTTTGG TCATTGGAAAAGGTGGCTTTGGAAATGTTTACAGGGGTGTTATGTGTGATGG CTCAAAGGTGGCCCTGAAAAGGCTTAATTCTGAGTCCCGACAAGGTCTTAG AGAGTTCCGAACAGAAATTGAGATGCTCTCTCAGTTCCACCATCCGCATCTG GTTTCATTGATTGGGTATTGTGATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTTTTGA GTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCC AGTATGGGCTGGGAGCAGAGGCTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGT CTGCTCTACCTTCATACTGGCTATGCCAATGCAGTTATACACCGCGATGTCAA GTCCGCAAACATATTGCTTGATGAGAACTTTGTGGCAAAGGTTGCTGATTTTG GAGTATCCAAGACAGGGCTTTTGCTTGATCAAACCCATATGAGCACAAGGGT GGTTGGAACTCTTGGCTACATTGATCCTGAATATTTTAGAAACGGACGGCTTT CAAAAAAATCTGATGTTTACTCGTTCGGTGTTGTTTTATTAGAAGTTCTTTGT GCTAGGCCTACAGTAGGCAACTTAGTTGAATGGGCAATGAAGAAGACAGGA CAACTAGAACAAATCATAGATCCCAATCTTGTGGGCAAAATAAAACCAGATT CCCTCAGGAAGTTTCGAGAAACAGCAGAGAAATGTGTAGCTATTTATGGTGA AGATAGGCCATCAATGGGTGATGTGCTGTGGAGTCTGGAGTATGCACTTCATC TCCAAGAGTCTGTCATTCATGATAATCCTGAAGAAAACAGTACTATCCCTATT GGCGAGCTGTCTCCGCAAGTCAATGATTTCAGTCATATTAATGCCAGTGCTTC TACTTCTCATATCTGGATGATCTCATCAAATTCGGGTGATCTCTCTGATGATAA GTCCTACTCCTATGGTAGATAACTAAGTGAAGACGGTACAGACTGTCCTTAGGTGTTTGTTAATTCCATTTTTTTTCATGGATCATCATCATATGAAGATTGATTATTTTGTTTTCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCTATAGTGAA。其中划线部分为推测的最大开放读码框。

NrRLK基因的RT-PCR引物为：

F：5′-AAGACAGGGCTTTTGCTTGA-3′

R：5′-GCCCACAAGATTGGGATCTA-3′

5′RACE所用引物：

GSP1：5′-AGATGCGGATGGTGGAACTG-3′

GSP2：5′-AAGACCTTGTCGGGACTCAG-3′

3′RACE所用引物：

GSP1：5′-GTTTACTCGTTCGGTGTTGT-3′

GSP2：5′-GAATGGGCAATGAAGAAGAC-3′

本发明克隆受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)的技术路线是：

1.利用其它作物中已克隆的激酶类抗病基因保守域设计引物，从野生烟草N.rependa中进行PCR扩增。回收预期大小的片段，将回收的片段连入pGEM-T easyVector(Promega)。挑取10个阳性克隆测序。

2.测序结果经手工去除载体序列后，在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析。

3.将BLASTx分析结果与激酶类有关的6条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现3条具有连续的ORF。

4.用具有连续ORF的3条序列设计特异引物。分析其在接菌黑胫病病菌后的野生烟草N.rependa根组织中不同时期的表达情况。其中有一条受黑胫病病菌诱导表达(图1)。

5.利用该序列设计两条5′RACE引物与两条3′RACE引物，以接菌黑胫病病菌后9d的N.rependa根组织为材料，获得其全长cDNA。

6.对NrRLK基因进行了初步的生物信息学分析。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明烟草受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)是从接菌黑胫病病菌后的的烟草根组织中经侯选基因与RACE技术方法得到的。因其仅在黑胫病病菌处理后9d表达，且该基因编码产物与植物防卫反应过程中的蛋白高度同源，因此以该基因为靶基因对烟草进行转化，在一定程度上可有效的提高烟草的黑胫病抗性，因而具有一定的经济及社会效益。以此基因为靶基因，通过基因工程的方法改良目前烟草黑胫病的抗性，为烟草的抗病育种提供基因资源，尽快培育高抗黑胫病的烟草品种，并应用于烟叶生产。

本发明的优点表现在：

(1)利用已克隆的同类基因的保守域克隆与目的基因的相关片段，通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术，克隆其全长cDNA。在克隆全长cDNA的众多方法中，该方法费用少、快速而且高效。

(2)本发明所克隆的基因编码受体类似蛋白激酶，从现有的资料可知，受体类似蛋白激酶基因是一类基因家族，它们不仅在植物正常的生理过程中发挥着重要的功能，而且是植物识别病原菌引发抗病信号传导的主要基因之一。因此本发明所克隆的基因与烟草的抗病性有着直接的关系。

(3)以此基因作为靶基因对烟草进行转化，理论上可直接有效地提高其黑胫病抗性，获得高抗黑胫病的烟草品种，极大地减少因黑胫病病害引起的烟叶生产的损失，带来可观的经济效益。

(4)目前转基因的外源基因大部分来源于微生物，这类转基因作物对安全性评价要求严格。本发明的基因来源于烟草，再导入烟草不存在安全性评价问题。与烟草抗病相关的基因目前国内外申请的专利很少，本发明可提高中国烟草科研水平在国际同行中的地位。

(5)通过该基因的功能预测，表明该基因是一个在黑胫病病菌诱导后特异表达的基因，通过农杆菌介导的方法将该基因导入烟草，使其过量表达，获得的转基因植株将在黑胫病病菌侵染烟草时大量表达，有望达到大大提高烟草抗黑胫病的目的。

附图说明：

下面结合附图，用本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

图1  烟草受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)序列表；

图2  RT-PCR检测受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)在接菌黑胫病病菌菌后N.rependa根组织中不同时期表达特点，0d，3d，6d，9d，12d分别表示接菌黑胫病病菌后的时间。图1中EF1α为组成性表达基因，作为内标，证明RNA模板的一致性；NrRLK表示目的基因；

图3  受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)预测的氨基酸序列与已克隆的其他作物中的激酶类基因或序列的进化树。AAB47421为番茄PTO基因；AAT70497为桃树S位点类似受体蛋白激酶基因；BAD37843为水稻S受体激酶PK3类似前体；AAD44031为大麦受体类似蛋白激酶基因；AAK20741为小麦TAK33；AAB82755为水稻Xa21基因；AAM81980为大麦RPG1基因。

具体实施方式：

实施例1：烟草受体类似蛋白激酶基因(NrRLK)的获取及表达：

1、利用其它作物中已克隆的激酶类抗病基因保守序列

(ATGGGAAGCAAGTATTCCAAGGCAACAAATTCCATAAATGATGCTTCTAACTTGAGTTATGGCATTCCTTTTGAAAATTATCGAGTTCCTTTTGTAGATTTGGAGGAAGCAACTAACAACTTTGATGACAAGTTTTTCATTGGAGAGGGTGGATTTGGGAAGGTTTACAGGGGTGTTTTGCGTGATGGAACAAAGGTCGCCCTGAAAAAGCATAAACGTGAGTCCTCACAAGGTATTGAAGAGTTCGAAACAGAAATTGAGATTCTCTCATTTTGCAGCCATCCGCATCTGGTTTCATTGATAGGATTCTGTGATGAAAGAAATGAGATGATTCTAATTTATGACTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGCCATTTGTATGGCTCAGATCTACCCACTATGAGCATGAGCTGGGAGCAGAGGCTGGAGATATGCATAGGGGCGGCCAGAGGTCTTCACTACCTTCATACTAACGGAGTTATACATCGTGATGTCAAGTGTACAAACATATTGCTTGATGAGAATTTTGTGCCAAAAATTACTGATTTTGGAATATCTAAGACAATGCCCGAGCTTGATCAAACCCATCTTAGCACAATAGTGAGAGGAAATATAGGCTACATTGCCCCTGAATATGCTTTGTGGGGACAGCTGACAGAAAAATCTGATGTTTATTCTTTCGGTGTTGTTTTATTCGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTGCCCTATATCTTTCAGAGATGATGAGTTCTGATGATGAGACGCAGAAGATGGGACAGTTGGAACAAATTGTAGATCCCGCTATTGCGGCCAAAATAAGACCAGAGTCCCTCAGGATGTTTGGAGAAACAGCGATGAAATGCTTAGCTCCGTCTAGTAAAAATAGGCCATCAATGGGTGATGTGCTGTGGAAACTGGAGT，引物用下划线标出)，设计引物，从烟草N.rependa中进行PCR扩增。回收910bp片段，将回收的片段连入pGEM-Teasy Vector(Promega)。挑取10个阳性克隆送宝生物工程有限公司测序。

2、测序结果经手工去除载体序列后，在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析。

3、将BLASTx分析结果与激酶类有关的6条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现3条具有连续的ORF

(＞1

ATGGGAAGCAAGTATTCCAACGGAACAACCATAAGTGCTGCTTCAAACTTGAGTTATCGCGTTCCGTTTCCAGCTTTGCTGGAAGCAACTAGCAACTTCGACGAGAGTTTGGTCATTGGAATAGGTGGCTTTGGGAAGGTATACAGGGGTGTTTTGTGTGATGGCACTAAGGTGGCCGTGAAAAGGGGTAATCCCAAGTCCCAACAAGGTCTTGCAGAGTTCCGAACGGAAATTGAGATGCTTTCACAGTTCCGCCATCGGCATCTGGTTTCATTGATGGGATACTGTGATGAAAAAAATGAGATGATTCTAGTTTATGAGTACATGGAGAATGGGACCCTCAAGAGCCATTTGTATGGTTCAGATCTCCCGAGTATGAGCTGGAAGCAAAGGCTGGAGATATGCATCGGGTCAGCCAGAGGTCTGCACTACCTTCATACTGGTTACGCTAAAGCCGTTATACATCGCGATGCCAAGTCTGCAAACATATTGCTCGACGAGAGTTTTATGGCAAAAGTTGCTGATTTTGGTCTATCGAAGACAGGGCCTGAGCTTGATCAAACCCATGTTAGCACGGCCGTAAAAGGAAGCTTTGGCTACCTAGATCCTGAATATTTTAGAAGACAACAGCTCACAGAAAAATCTGATGTTTATTCTTTTGGTGTTGTTTTATTTGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTGTCATAGATCCATCTCTTCCGAGGGAGATGGTCAACTTAGCTGAATGGGCTATGAAGTGGCAGAAGAAAGGACAATTGGAACAAATCATAGATCCCAATCTTAAAGGCAAGATAAGACCAGATTCCCTTAGGAAGTTTGGAGAAACGGCGGAGAAATGTTTAGCTGATTTTGGTGTTGACAGACCATCAATGGGTGATGTGCTGTGGAAACT

＞2

ATGGGAAGCAAGTATTCCAAGGGAACAACTTCCATAAGTGATGCTCCAAACTCGAATTATCGCGTTCCTATTGAGAATTATCGAGTTCCTTTTGCAGCTTTGCAGGAAGCAACTAACGACTTTGATGAGAGTTTGGTCATTGGAAAAGGTGGCTTTGGAAATGTTTACAGGGGTGTTTTGTGTGACGGCACAAAGGTGGCCCTGAAAAGGCTTAATGCTGCATCCCGACAAGGTCTTGCAGAGTTCCGAACAGAAATTGAGATGCTCTCTCAGTTCCGTCATCCGCATCTGGTTTCATTGATTGGATACTGTGATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTTTTGAGTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCCAGTATGGGCTGGGAGCAGAGGCTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGTCTGCACTACCTTCATACTGGCTATGTCAATGCAGCTATACATCGTGATGTCAAGTCTGCAAACATATTGCTTGATGAGAATTTTGTTGCAAAAGTTACTGATTTTGGGCTATCCAAGATAGGGCTTGAGCTTGATCAAACCCATATTAGCACAACTACAAGGGTGGTTGGAACTTTTGGCTACATTGATCCTGAATATTATAGAAACGGACGGCTTTCAGAAAAATCTGATGTTTACTCTTTCGGTGTTGTTTTATTAGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTACAGTAGTCAGCTTAACTGAATGGGGAAATAAGAAGAAGGGACAACTGGAACAAATCATAGATCCCAATCTTGTGGGCAAAATAAGACCAGATTCCCTCCGGAAGTTTGGAGAAATAGCAGAGAAATGCATAGCTATTTATGGTGAAGATAGGCCATCAATGGGTGATGTGCTGTGGAAAT

＞3

TGGGAAGCAAGTATTCCAAGGGAACAACTTCCATAAGTGATGCTTCAAACTCGAATTATCGTGTTCCTATTGAGAATTATCGAGTTCCTTTTGCAGATTTGCAGGAAGCAACTAACGACTTTGACGAGAGTTTGGTCATTGGAAAAGGTGGCTTTGGAAATGTTTACAGGGGTGTTATGTGTGATGGCTCAAAGGTGGCCCTGAAAAGGCTTAATTCTGAGTCCCGACAAGGTCTTAGAGAGTTCCGAACAGAAATTGAGATGCTCTCTCAGTTCCACCATCCGCATCTGGTTTCATTGATTGGGTATTGTGATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTTTTGAGTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCCAGTATGGGCTGGGAGCAGAGGCTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGTCTGCTCTACCTTCATACTGGCTATGCCAATGCAGTTATACACCGCGATGTCAAGTCCGCAAACATATTGCTTGATGAGAACTTTGTGGCAAAGGTTGCTGATTTTGGAGTATCCAAGACAGGGCTTTTGCTTGATCAAACCCATATGAGCACAAGGGTGGTTGGAACTCTTGGCTACATTGATCCTGAATATTTTAGAAACGGACGGCTTTCAAAAAAATCTGATGTTTACTCGTTCGGTGTTGTTTTATTAGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTACAGTAGGCAACTTAGTTGAATGGGCAATGAAGAAGACAGGACAACTAGAACAAATCATAGATCCCAATCTTGTGGGCAAAATAAAACCAGATTCCCTCAGGAAGTTTCGAGAAACAGCAGAGAAATGTGTAGCTATTTATGGTGAAGATAGGCCATCAATGGTGATGTGCTGTGGAAACTA)。

4、用具有连续ORF的3条序列设计特异引物。分析其在接菌黑胫病病菌后的野生烟草N.rependa根组织中不同时期的表达情况。其中有一条

＞3

TGGGAAGCAAGTATTCCAAGGGAACAACTTCCATAAGTGATGCTTCAAACTCGAATTATCGTGTTCCTATTGAGAATTATCGAGTTCCTTTTGCAGATTTGCAGGAAGCAACTAACGACTTTGACGAGAGTTTGGTCATTGGAAAAGGTGGCTTTGGAAATGTTTACAGGGGTGTTATGTGTGATGGCTCAAAGGTGGCCCTGAAAAGGCTTAATTCTGAGTCCCGACAAGGTCTTAGAGAGTTCCGAACAGAAATTGAGATGCTCTCTCAGTTCCACCATCCGCATCTGGTTTCATTGATTGGGTATTGTGATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTTTTGAGTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCCAGTATGGGCTGGGAGCAGAGGCTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGTCTGCTCTACCTTCATACTGGCTATGCCAATGCAGTTATACACCGCGATGTCAAGTCCGCAAACATATTGCTTGATGAGAACTTTGTGGCAAAGGTTGCTGATTTTGGAGTATCCAAGACAGGGCTTTTGCTTGATCAAACCCATATGAGCACAAGGGTGGTTGGAACTCTTGGCTACATTGATCCTGAATATTTTAGAAACGGACGGCTTTCAAAAAAATCTGATGTTTACTCGTTCGGTGTTGTTTTATTAGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTACAGTAGGCAACTTAGTTGAATGGGCAATGAAGAAGACAGGACAACTAGAACAAATCATAGATCCCAATCTTGTGGGCAAAATAAAACCAGATTCCCTCAGGAAGTTTCGAGAAACAGCAGAGAAATGTGTAGCTATTTATGGTGAAGATAGGCCATCAATGGTGATGTGCTGTGGAAACTA)受黑胫病病菌诱导表达(图2)。

5、利用该序列设计两条5′RACE引物与两条3′RACE引物，以接菌黑胫病病菌后9d的N.rependa根组织为材料，获得其全长cDNA(附图1所示的序列表)。

6、对NrRLK基因进行了初步的生物信息学分析。

6.1以此基因的最大ORF推断的氨基酸序列经BLAST。

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)功能比较，该基因与番茄PTO蛋白具有68％的一致性，78％的相似性(E值：4e-119)。

6.2用Expasy pI/Mw程序

(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html)对NrRLK预测的氨基酸序列进行了一级结构的预测，该基因理论上的等电点pI＝5.49，分子量Mw＝40.83Da。

6.3 ProtComp Version 6(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？)和WoLFPSORT(http://wolfpsort.org/)预测NrRLK定位于细胞质，TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测它含有一段跨膜区(138～162位氨基酸)。

6.4利用ScanProsite(http://www.expasy.org/tools/scanprosite/)程序搜索NrRLK预测的氨基酸序列的保守基元，发现其41～304位为蛋白质激酶区。

6.5同源关系树分析(MEGA4软件)(图2)，NrRLK与番茄的PTO遗传距离最近，PTO与NrRLK相似，只含有一个激酶区。

7、通过该基因的功能预测，表明该基因是一个在黑胫病病菌诱导后特异表达的基因，通过农杆菌介导的方法将该基因导入烟草，使其过量表达，获得的转基因植株将在黑胫病病菌侵染烟草时大量表达，有望达到大大提高烟草抗黑胫病的目的。

序列表

<110>云南省烟草科学研究所

<120>烟草受体类似蛋白激酶基因及其应用

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>SEQ ID NO.1

<211>1467

<212>DNA

<213>Nicotiana rependa

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1467)

<223>

<400>1

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gaagctttta ggggtaatga gagggagaga    60

cgcacaataa ctatccaaag tccccctgca cagtatgact tatcactctc tcatcttctc    120

caatctctaa tctccaatgt tctggaaata gccgggagca gctttcccca gtcaaaagat    180

atatggattc ctttatctgg taacggtggc actccactcc atacaccatg ggaagcaagc    240

attcaaaggg aacaacttcc ataagtgatg cttcaaactc gaattatcgt gttcctattg    300

agaattatcg agttcctttt gcagatttgc aggaagcaac taacgacttt gacgagagtt    360

tggtcattgg aaaaggtggc tttggaaatg tttacagggg tgttatgtgt gatggctcaa    420

aggtggccct gaaaaggctt aattctgagt cccgacaagg tcttagagag ttccgaacag    480

aaattgagat gctctctcag ttccaccatc cgcatctggt ttcattgatt gggtattgtg    540

atgaaaacaa cgagatgatt ctagtttttg agtacatgga gaatgggaac ctcaagagtc    600

atttgtatgg gtcagatcta cccagtatgg gctgggagca gaggctggag atatgcatcg    660

gggcagccag aggtctgctc taccttcata ctggctatgc caatgcagtt atacaccgcg    720

atgtcaagtc cgcaaacata ttgcttgatg agaactttgt ggcaaaggtt gctgattttg    780

gagtatccaa gacagggctt ttgcttgatc aaacccatat gagcacaagg gtggttggaa    840

ctcttggcta cattgatcct gaatatttta gaaacggacg gctttcaaaa aaatctgatg    900

tttactcgtt cggtgttgtt ttattagaag ttctttgtgc taggcctaca gtaggcaact    960

tagttgaatg ggcaatgaag aagacaggac aactagaaca aatcatagat cccaatcttg    1020

tgggcaaaat aaaaccagat tccctcagga agtttcgaga aacagcagag aaatgtgtag    1080

ctatttatgg tgaagatagg ccatcaatgg gtgatgtgct gtggagtctg gagtatgcac    1140

ttcatctcca agagtctgtc attcatgata atcctgaaga aaacagtact atccctattg    1200

gcgagctgtc tccgcaagtc aatgatttca gtcatattaa tgccagtgct tctacttctc    1260

atatctggat gatctcatca aattcgggtg atctctctga tgataagtcc tactcctatg    1320

gtagataact aagtgaagac ggtacagact gtccttaggt gtttgttaat tccatttttt    1380

ttcatggatc atcatcatat gaagattgat tattttgttt tcgcaaaaaa aaaaaaaaaa    1440

aaaaaaaaaa aaaaaaccta tagtgaa                                        1467

Claims (6)

1、烟草受体类似蛋白激酶基因，简称NrRLK基因，它具有附图1所述的碱基序列。

2、烟草受体类似蛋白激酶基因，由下述方法获取：利用其它作物中已克隆的激酶类抗病基因保守域设计引物，从野生烟草N.rependa中进行PCR扩增，回收预期大小的片段，将回收的片段连入pGEM-T easy Vector(Promega)，测序；测序结果经手工去除载体序列后，在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析；将BLASTx分析结果与激酶类有关的6条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现3条具有连续的ORF，用具有连续ORF的3条序列设计特异引物，分析其在接菌黑胫病病菌后的野生烟草N.rependa根组织中不同时期的表达情况，利用受黑胫病病菌诱导表达序列设计两条5′RACE引物与两条3′RACE引物，以接菌黑胫病病菌后9d的N.rependa根组织为材料，获得其全长cDNA。

3、根据权利要求1或2所述的烟草受体类似蛋白激酶基因，其特征在于：该基因的RT-PCR引物为：

F：5′-AAGACAGGGCTTTTGCTTGA-3′

R：5′-GCCCACAAGATTGGGATCTA-3′

5′RACE所用引物：

GSP1：5′-AGATGCGGATGGTGGAACTG-3′

GSP2：5′-AAGACCTTGTCGGGACTCAG-3′

3′RACE所用引物：

GSP1：5′-GTTTACTCGTTCGGTGTTGT-3′

GSP2：5′-GAATGGGCAATGAAGAAGAC-3′。

4、权利要求1或2或3所述烟草受体类似蛋白激酶基因用作为靶基因。

5、抗黑胫病病菌转基因烟草，是由权利要求1所述烟草受体类似蛋白激酶基因通过农杆菌介导的方法将该基因导入烟草，在黑胫病病菌诱导后特异过量表达，获得的转基因植株。

6、权利要求1或2或3所述烟草受体类似蛋白激酶基因在制备抗黑胫病病菌转基因烟草中的应用。

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