CN116555279B

CN116555279B - 一种增强辣椒抗倒伏性能的基因片段及其编码蛋白、检测试剂盒、快速检测方法和应用

Info

Publication number: CN116555279B
Application number: CN202310090191.4A
Authority: CN
Inventors: 欧立军; 李青; 傅灿芳; 刘周斌; 杨博智; 戴雄泽; 索欢; 邹学校
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2023-02-09
Filing date: 2023-02-09
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2043-02-09
Also published as: CN116555279A

Abstract

本发明提供一种辣椒抗倒伏基因、其特异性序列及其编码蛋白在增强辣椒抗倒伏性能中的应用，对野生型辣椒6421进行化学诱变发现茎秆匍匐突变体sp1，分析后得到一个显著差异表达的基因，将该基因命名为CaMYB61，同时提供了该基因的核苷酸序列和氨基酸序列。本发明中的CaMYB61基因为辣椒抗倒伏新品种的选育提供了参考，对辣椒抗倒伏育种具有积极作用。

Description

一种增强辣椒抗倒伏性能的基因片段及其编码蛋白、检测试剂盒、快速检测方法和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，尤其涉及一种增强辣椒抗倒伏性能的基因片段及其编码蛋白、检测试剂盒、快速检测方法和应用。

背景技术

倒伏在小麦、水稻、玉米和大豆等重要农作物的生长发育过程中普遍存在，严重影响其生产的产量和质量。作物发生倒伏后，无法保持向上直立生长，使得光照供应不足，叶片不能有效地进行光合作用，阻碍了营养物质的积累和转运，同时秆中输导组织受到损伤，光合产物的运输和贮藏受阻，作物正常生长所需要的物质供应不畅，致使产量明显下降；且倒伏后作物匍匐在地上容易诱发真菌的感染和病虫的危害，影响农产的品质。随着机械化水平的进一步提高，倒伏后的作物不利于机械化收获，甚至无法进行机械化收获，从而降低工作效率，增加收获成本，也使作物收获损失加重。

抗倒伏是农作物重要的农艺性状。倒伏主要分为根倒伏和茎秆倒伏，但主要以茎秆倒伏为主。茎秆的形态特征和生理特性与抗倒伏性有着密切的联系，一般来说，株高较矮、基部节间较短、茎粗大、茎壁较厚的品种其抗倒伏能力强。茎秆化学组成指的是茎秆的细胞壁组分，主要包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等。茎秆成分对植物活力和抵抗包括倒伏在内的生物和非生物胁迫至关重要。在维管束中，木质素含量高可以增强细胞壁的强度，提高植物茎秆的物理强度。木质素和纤维素含量在机械组织层中较高，其中维管束周围的细胞富含木质素和纤维素，抗倒伏性更强。目前已有研究确定一些转录因子参与木质素、纤维素和半纤维素的合成。NAC和MYB转录因子是次生细胞壁生物合成的主开关。OSPEX1基因介导了水稻木质素的合成或积累，Osmyb108基因敲除的水稻突变体通过促进木质素在茎细胞壁中的沉积，显著提高了木质素生物合成基因的表达水平。研究发现水稻和玉米的NACs转录因子SWNs与MYB46是次级壁生物合成程序的主转录激活因子直接激活的靶基因，导致纤维素、木聚糖和木质素的异位沉积，增加茎秆机械强度。

辣椒在我国占据中重要地位，产业发展十分迅速，已是中国种植面积最大的蔬菜和消费量最大的辛辣调味品，其营养成分丰富，但是在辣椒的生产过程中，常常出现植株倒伏的问题，倒伏后容易落花落果，匍匐在地上容易受真菌的感染和病虫的危害，严重影响了辣椒的产量和品质，增加劳动成本，倒伏已经成为限制辣椒产量的一个重要的因素之一。选育和推广抗倒伏辣椒新品种是解决这一问题最高效的手段，而挖掘抗倒伏基因资源是决定抗倒伏辣椒新品种选育工作进程的最关键因素，对辣椒抗倒伏育种具有积极作用。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种增强辣椒抗倒伏性能的基因片段及其编码蛋白、检测试剂盒、快速检测方法和应用，增强了辣椒的抗倒伏性能，对辣椒抗倒伏育种具有积极作用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

本发明第一方面提供一种增强辣椒抗倒伏性能的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明中通过EMS诱变辣椒骨干亲本6421，获得茎秆匍匐突变体sp1(stemprostrate1)。对6421和突变体sp1转录组分析后得到一个显著差异表达的基因，将其命名为CaMYB61(transcription factor MYB61)。

作为一种可选的实施方式，本发明提供的基因片段中，所述基因片段通过如下引物对扩增得到：

F：5′-ATGGGGAGGCATTCTTGTTGC-3′。

R：5′-CTAAGAGAATTGACCGAAGACGG-3′。

作为一种可选的实施方式，本发明提供的基因片段中，所述基因片段中的特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

作为一个总的技术构思，本发明第二方面提供一种可增强辣椒抗倒伏性能的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

作为一个总的技术构思，本发明第三方面提供一种用于扩增上述的基因片段的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物对：

F：5′-ATGGGGAGGCATTCTTGTTGC-3′。

R：5′-CTAAGAGAATTGACCGAAGACGG-3′。

作为一种可选的实施方式，本发明提供的检测试剂盒中，所述检测试剂盒还包括2×ApexHF FS PCR Master Mix和ddH₂O。

作为一个总的技术构思，本发明第四方面提供一种上述的检测试剂盒对辣椒植株中增强辣椒抗倒伏性能的基因片段的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)提取辣椒植株RNA，进行反转录，以反转录得到的cDNA为模板，利用所述检测试剂盒进行扩增反应，得到扩增产物。

(2)通过凝胶电泳鉴定所述扩增产物，若含有一个1263bp的条带，则该辣椒植株中含有强辣椒抗倒伏性能的基因片段。

作为一种可选的实施方式，本发明提供的快速检测方法中，步骤(1)中扩增反应的条件为：94℃1min，98℃10s，60℃15s，72℃8s，35个循环，4℃5min。

作为一个总的技术构思，本发明第五方面提供上述的基因片段或蛋白在增强辣椒抗倒伏性能中的应用。

作为一种可选的实施方式，本发明提供的应用中，所述应用包括以下应用中的至少一种：

(1)在增加辣椒植株中木质素、纤维素和半纤维素含量中的应用。

(2)在增加辣椒茎秆强度中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种具有增强辣椒抗倒伏性能的基因，将其命名为CaMYB61，具体表现为含有CaMYB61基因的辣椒植株表现为抗倒伏性能，将CaMYB61植株中的特异性序列沉默后，辣椒植株表现出匍匐性状。本发明中的CaMYB61基因为辣椒抗倒伏新品种的选育提供了参考，对辣椒抗倒伏育种具有积极作用。

附图说明

图1为CaMYB61基因克隆后的PCR结果图，M为2000Marker；1为CaMYB61基因；2为阴性对照CK；

图2为CaMYB61蛋白疏水性分析结果；

图3为CaMYB61蛋白二级结构预测与分析结果；

图4为CaMYB61蛋白信号肽预测结果；

图5为CaMYB61蛋白跨膜结构域预测结果；

图6为CaMYB61蛋白三级结构预测结果；

图7为CaMYB61蛋白的系统进化树；

图8为CaMYB61基因在不同部位的相对表达量结果；

图9为CaMYB61辣椒沉默植株表型图；

图10为CaMYB61辣椒沉默植株qRT-PCR表达结果；

图11为CaMYB61辣椒沉默植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量检测结果；

图12为CaMYB61辣椒沉默植株茎秆强度结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

通过EMS诱变辣椒骨干亲本6421，获得茎秆匍匐突变体sp1(stemprostrate1)。对6421和突变体sp1全基因组重测序分析后得到一个显著差异表达的基因，具体为辣椒骨干亲本6421中包含该基因，突变体sp1中缺失该基因，将该基因命名为CaMYB61(transcription factor MYB61)，基因序列如SEQ ID No.1所示。

以CaMYB61序列为参考，利用Premier 5设计特异性引物，用艾科瑞生物的DNA聚合酶进行基因扩增。具体为提取辣椒野生型“6421”株RNA，进行反转录，以反转录的cDNA为模板，通过PCR的方法，对CaMYB61基因进行克隆。

基因克隆的引物如下：

F：5′-ATGGGGAGGCATTCTTGTTGC-3′，如SEQ ID No.4所示。

R：5′-CTAAGAGAATTGACCGAAGACGG-3′，如SEQ ID No.5所示。

PCR反应体系如表1所示。

表1：PCR反应体系

模板(cDNA)	1μL
		正向引物	2μL
反向引物	2μL
		2×ApexHFFSPCRMasterMix	25μL
ddH₂O	补至50μL

PCR的反应程序：94℃1min，98℃10s，60℃15s，72℃8s，35个循环，4℃5min。扩增结果如图1所示，扩增得到1263bp的条带。

实施例2

CaMYB61基因生物信息学分析。

以辣椒野生型“6421”的cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到该基因，该基因的编码序列(CDS)全长1263bp，编码一个由421个氨基酸残基组成的蛋白质序列，氨基酸序列如SEQID No.2所示。

为了了解CaMYB61氨基序列与其它物种间的相似性，通过序列分析软件DNAMAN和BioEdit进行氨基酸序列比对分析，对CaMYB61蛋白与其他植物MYB61蛋白进行比对，主要是对番茄、窄刀薯、多疣茄、绒毛烟草、小果咖啡、木薯、毛果杨、木犀榄、甜橙、三裂叶薯和君迁子中的MYB61蛋白进行同源性分析，其蛋白一致性为61.49％。

为了了解CaMYB61蛋白的亲/疏水性，用Prot Scale在线软件获得氨基酸序列亲/疏水性预测图，结果如图2所示，结果表明CaMYB61蛋白的亲水性平均系数，多肽链中具有最低分值(-3.289)的是位于第145位，亲水性最强；具有最高分值(2.189)的是位于第81位，疏水性最强。亲水氨基酸(负值)多于疏水氨基酸(正值)，推测CaMYB61基因编码氨基酸序列对应的蛋白质为亲水性蛋白。

为了了解其二级结构，应用在SOPM在线软件对蛋白的二级结构及其预测和分析。得出CaMYB61蛋白的二级结构主要由34.05％α螺旋(Alphahelix)、4.29％的β折叠(Betaturn)、7.38％延伸链(Extendedstrand)和54.29％的无规则卷曲(Randomcoil)组成，结果如图3所示。

为了了解其有无信号肽，应用在线软件SignaIP-5.0预测CaMYB61基因所编码的蛋白质的信号肽，结果如图4所示，该蛋白有信号肽的概率为0.08％，表明CaMYB61蛋白不存在信号肽区域。利用在线软件WoLF PSORT预测CaMYB61的亚细胞定位，结果显示CaMYB61定位于细胞核的可能性最大。

为了了解该蛋白是否存在跨膜结构域，利用TMHMMServerv.2.0在线工具输入氨基酸序列预测CaMYB61蛋白的跨膜结构域，结果如图5所示，跨膜结构域预测图无峰值，证明CaMYB61蛋白不存在跨膜结构域，可能为非跨膜蛋白。综上所述，信号肽分析和跨膜结构域分析，推测该蛋白既不属于分泌蛋白，也不能认为是膜蛋白。

为了了解该蛋白的三级结构，利用在线软件SWISS-MODEL得到蛋白质的三级结构的预测结果，如图6所示。CaMYB61蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。蛋白结构由一个PDB号为6kks.1.A的结构为模板建立的，序列的一致性为54.05％，GMQE值(全球性模型质量估测)为0.19。

为了了解该蛋白在进化过程中与哪些物种的亲缘关系较近，在NCBI网站上用CaMYB61全长蛋白序列进行Blast比对搜索，构建了CaMYB61与不同植物蛋白序列的系统进化树，如图7所示，结果表明，CaMYB61蛋白与番茄、窄刀薯和多疣茄蛋白同属一个分支，同源性最高。

实施例3

CaMYB61基因在不同部位的表达量分析。

在NCBI(Primer designing tool(nih.gov))在线设计定量PCR引物(5′→3′)，具体如下：

qCaMYB61-F：AGTCGGAGACAGAGGCGAAA，如SEQ ID No.6所示。

qCaMYB61-R：CGCCTTCACAAGAGATTGCT，如SEQ ID No.7所示。

用艾科瑞生物的Steady Pure植物RNA提取试剂盒提取野生型“6421”株RNA，用艾科瑞的反转录试剂盒Evo M-MLV反转录试剂预混液(用于qPCR)反转录成cDNA。选用辣椒的actin基因作为内参基因，引物如下：

Actin-F：CCACCTCTTCACTCTCTGCTCT，如SEQ ID No.8所示。

Actin-R：ACTAGGAAAAACAGCCCTTGGT，如SEQ ID No.9所示。

荧光定量PCR在Roche96荧光定量PCR检测系统上进行。PCR反应体系如下表2所示。

表2：荧光定量PCR反应体系

模板(cDNA)	0.1μL
		正向引物	0.4μL
反向引物	0.4μL
		2×SYBRGreenPCRMasterMix	5μL
ddH₂O	补至10μL

扩增程序为：95℃总变性30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环。

分析CaMYB61基因在不同组织中的相对表达量，结果如图8所示，从图中可知，与根相比，该基因在茎秆中的表达量最高。

实施例4

CaMYB61病毒诱导的基因沉默(VIGS)。

(1)载体构建

为了验证该基因的功能，本实施例进一步借助病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)，根据CaMYB61基因的cDNA序列，通过在线工具(vigs.solgenomics.net)寻找适合构建VIGS载体区域(碱基序列和其他基因的相似性低)，比对到NCBI找到CaMYB61特异性序列，如SEQID No.3所示，然后根据pTRV2载体多克隆位点所包含的酶切位点，根据序列设计引物，特异性引物扩增序列如下所示：

VIGS-CaMYB61-F：TCGGCAAACAGTAACAATAAGAACA，如SEQ ID No.10所示。

VIGS-CaMYB61-R：AGGAGAGATAACTAGACAAATCAGG，如SEQ ID No.11所示。

以野生型“6421”辣椒的cDNA为模板进行PCR，PCR反应体系如下表3所示，以cDNA进行扩增。

表3：PCR反应体系

模板(cDNA)	1μL
		VIGS-CaMYB61-F	2μL
VIGS-CaMYB61-R	2μL
		2×ApexHFFSPCRMasterMix	25μL
ddH₂O	补至50μL

扩增程序为：94℃1min，98℃10s，60℃15s，72℃2s，35个循环，4℃5min。扩增结果如图1所示，扩增得到223bp的条带。

扩增后获得长度为223bp的PCR产物，用天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，纯化后的片段构建到线性化的pTRV₂载体。利用同源重组的方法将纯化后的目的片段和线性化的载体通过单片段重组试剂盒(Vazyme，One step cloningKit)连接。将以上构建的载体分别转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂在含有卡那霉素抗生素的LB培养上，14～16h后挑取5～6个单克隆进行PCR鉴定，验证后确认有目的条带的菌液进行测序，与载体引物设计序列比对确认无误后进行质粒提取，得到含有CaMYB61基因的沉默载体(pTRV2-CaMYB61)。

(2)转化农杆菌

取新鲜制备的或-75℃保存的100μL GV3101农杆菌感受态细胞，置冰上，待感受态细胞呈冰水混合物时加入10μL上述提取的pTRV2-CaMYB61质粒，混匀后依次冰上放置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min，加入700μL LB液体培养基，28℃振荡培养1h，4000rpm离心5min，去除700μL上清，留100μL液体重悬细胞。将菌液涂布于含有kan抗生素的LB平板上，28℃培养32～48h，挑取长出的农杆菌菌落进行菌落PCR检测，结果为阳性的说明表达载体构建成功。

(3)侵染

利用人工气候箱育苗，出苗前28℃、黑暗培养，出苗后，昼/夜温度28℃/20℃、光照375μmol·(m^-2·s^-1)(12h/12h)、相对湿度60％，培养至两片子叶完全展开、真叶尚未长出时用于接种。具体步骤如下：

3.1、将含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS、pTRV2-CaMYB61质粒的菌液使用含三种抗生素的LB培养基(终浓度为Kan 50μg·mL^-1，Rif50μg·mL^-1，Gen 50μg·mL^-1)，28℃，200rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。

3.2、取培养液以1:20稀释至诱导培养液体中(终浓度为Kan 50μg·mL^-1，Rif50μg·mL^-1，Gen 50μg·mL^-1，20μMAS)，28℃，200rpm至OD₆₀₀＝0.5-0.8。

3.3、取培养产物20mL于离心管中，5000g离心8min，弃上清，加入10mM MES溶液(MES 1.066g，MgCl₂·6H₂O 1.0165g，超纯水定容至500mL，调节pH至5.6)，终浓度200μM AS(NH₄Cl 2g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，KCl 0.3g，CaCl₂0.02g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，超纯水100mL)重悬菌体，调节OD₆₀₀＝1.0。

3.4、同样方法制备pTRV1，pTRV2、pTRV2-PDS菌液。

3.5、将pTRV1菌株分别与其他菌株1:1混合，28℃暗处静置4-6h后接种。

3.6、直立野生型辣椒株系为侵染对象，无针头渗透法接种辣椒子叶(接种前2天脱水处理)，接种后人工气候箱18℃黑暗培养3d，再调至昼/夜温度为22℃/18℃，光照375μmol·(m^-2·s^-1)(16h/8h)，相对湿度60％条件下培养。

(4)表型观察

沉默至4-5个星期之后开始出现表型，沉默植株表现出匍匐性状，如图9所示。

(5)沉默植株中CaMYB61表达水平分析

提取沉默植株TRV₂-CaMYB61和对照植株TRV₂的RNA并反转录成cDNA，然后进行qRT-PCR分析，qRT-PCR引物如下：

正向引物：GAGAAAGCGTCGGCAAACAG，如SEQ ID No.12所示。

反向引物：TTCATGAGTTGGTGGGGCAA，如SEQ ID No.13所示。

反应体系如下表4所示。

表4：qRT-PCR反应体系

反应程序为：95℃总变性30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环。

结果如图10所示，显示在沉默匍匐株系中该基因表达量降低。

(6)沉默植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量的测定

研究采用乙酰化法测定木质素含量，乙酰化法使木质素中的酚羟基发生乙酰化，其在280nm处有特征吸收峰，280nm的吸光值高低与木质素含量正相关。纤维素是由葡萄糖基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖。然后在浓硫酸作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物。本研究利用蒽酮试剂与糠醛类化合物反应生成蓝绿色物质。经光谱扫描该蓝绿色物质在620nm处有最大吸收峰，进而得到纤维素含量。半纤维素是植物细胞壁中与纤维素紧密结合的多糖混合物，是构成细胞初生壁的主要成分，广泛存在于植物中，是一种新型可利用能源。本研究测定半纤维素的方法在美国NREL实验室的方法基础上略做改进以检测半纤维素含量，在酸性条件下加热使半纤维素水解生成木糖。通过比色法检测生成的木糖含量，进而计算得出半纤维素含量。具体操作由苏州格锐思生物科技有限公司实施。茎秆强度测定，利用质构仪(TA.XTplus，Stable Micro Systems)，统一切割第一节间茎秆，以切割茎秆70％时的切割力作为茎秆的强度指标。

结果表明沉默植株中木质素、纤维素和半纤维素含量减少；同时茎秆抗切割力也减少。与对照组相比，木质素、纤维素和半纤维素含量分别减少了24.6％、23.2％和8.25％，结果如图11所示。茎秆抗切割力减小了59％，结果如图12所示。表明CaMYB61可能通过影响茎秆细胞壁成分和茎秆强度影响茎秆抗倒伏能力。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.CaMYB61基因片段在构建不具备抗倒伏性能的辣椒植株模型中的应用，其特征在于，所述CaMYB61基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下应用中的至少一种：

(1)沉默CaMYB61基因后，辣椒植株中木质素、纤维素和半纤维素含量减少；

(2)沉默CaMYB61基因后，辣椒茎秆强度减弱。