CN109825513B

CN109825513B - 大豆病程相关蛋白基因、重组载体、重组细胞、重组体系及应用

Info

Publication number: CN109825513B
Application number: CN201910282954.9A
Authority: CN
Inventors: 王丕武; 杜叶垚; 宋阳; 王鑫雨; 曲静; 张卓; 吴楠; 姚丹; 刘思言
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2039-04-10
Also published as: CN109825513A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及大豆病程相关蛋白基因、重组载体、重组细胞、重组体系及应用。一种大豆病程相关蛋白基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过RT‑PCR技术对该基因进行了扩增，并以该基因构建了重组质粒和表达载体，获得含有目的基因的植物体，过表达该该基因的大豆植物体具有抗大豆疫霉根腐病，为培育具有抗大豆疫霉根腐病新品种提供抗性基因和种质资源。

Description

大豆病程相关蛋白基因、重组载体、重组细胞、重组体系及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及大豆病程相关蛋白基因、重组载体、重组细胞、重组体系及应用。

背景技术

病程相关蛋白(pathogenesis relatedproteins，PRP/PRs)是植物体内部自身编码的一类蛋白质。当植物体受到生物或非生物胁迫时，在植物体内迅速大量的积累，产生一系列抗性反应，从而加强植物抵御疾病、承受外界压力以及适应不良环境的能力。病原物、化学试剂、植物激素都会诱导产生病程相关蛋白。

随着研究PRP蛋白的学者不断增多，相继在水稻、玉米、葡萄、辣椒等植物中都发现了PR1蛋白，PR1蛋白保守且独特，可以分为两类：酸性蛋白和碱性蛋白。酸性蛋白分泌于细胞间隙，碱性蛋白分泌于细胞液，其对抵抗病原菌起到了重要作用，容易受病原物和水杨酸诱导而产生，是PR蛋白家族中不可缺少的一部分。

病程相关蛋白基因的表达能够参与植物防御反应，并具有较强的抗真菌活性，所以挖掘和研究新型的病程相关蛋白基因是有必要的。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明所提供的技术方案是：

一种大豆病程相关蛋白基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有所述大豆病程相关蛋白基因的重组载体，重组细胞或者重组体系。

所述基因大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用。

所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，所述应用的步骤如下:

提取大豆突变体幼根RNA，并通过反转录合成cDNA第一条链作为模板，再进行RT-PCR扩增，获得扩增产物；

将所述扩增产物与第一质粒载体在连接克隆体系中反应，获得第一重组质粒；

以所述第一重组质粒为模板，在含有预定的扩增引物的扩增体系中进行扩增，获得目的基因片段；

将第二质粒载体在预定的酶切体系中进行酶切处理2-3h后，在60-68℃条件下时限制酶失活，获得线性化载体；

将所述线性化载体与所述目的基因片段混合，在孵育器反应，获得植物过表达载体；

将所述植物过表达载体通过冻融法转化大肠杆菌感受态细胞中，获得重组细胞；

从所述重组细胞中进行植物过表达载体提取，并通过通过花粉管道法转入至大豆植物体内，获得含有大豆病程相关蛋白基因的大豆植物体。

有益效果：

本发明首次提供了一个大豆病程相关蛋白基因GmPR1，通过RT-PCR技术对该基因进行了扩增，并以该基因构建了重组质粒和表达载体，并通过冻融法转化大肠杆菌感受态细胞获得重组细胞，并获得含有目的基因的植物体，过表达该基因的大豆植物体具有抗大豆疫霉根腐病，为培育具有抗大豆疫霉根腐病新品种提供抗性基因和种质资源。

附图说明

附图1为实施例4给出的一种重组载体的结构图；

附图2为cDNA扩增大豆病程相关蛋白基因GmPR1电泳图；；

附图3为第一重组质粒PMD-18T-GMPR1的扩增基因电泳图；

附图4为载体质粒pCAMBIA3301-GmPR1的扩增基因电泳图

附图5为GmPR1蛋白的三位结构示意图；

具体实施方式

为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。

实施例1

选择吉林农业大学植物生物中心的大豆吉农18突变体，并通过突变体的幼根进行总RNA的提取。具体方法如下：

RNA的粗提：

实验前将枪头、1.5ml离心管、PCR管于0.1％DEPC液体中浸泡12h，之后倒掉DEPC液体，高温高压灭菌20min，于80℃烘箱中干燥至无液体存在。氯仿、异丙醇、无水乙醇提前在-20℃中预冷。

a.取1.0g大豆幼根,在研钵中加入液氮磨样，之后装入1.5ml离心管中，加1mlRNAiso Plus混匀，漩涡振荡30s，在冰上静置5min，再次漩涡振荡30s，再静置5min。

b.加三氯甲烷200μL，漩涡振荡半分钟，冰浴6min。

c.在离心机中以12000r/min 4℃条件下离心15min，取上层水相转移至新管中，约600μL，下层有机相除去。

d.加500μL异丙醇，在冰上静置10min。

e.在离心机中以12000r/min 4℃条件下离心10min,去上清，RNA在管底和管壁上形成白色沉淀。

f.用0.1％DEPC液体配制75％的乙醇洗涤沉淀，之后在离心机中以7500r/min4℃条件下离心5min。

g.倒掉液体，室温静置8min，可倒扣于滤纸之上。

h.加25-30μL0.1％DEPC液，吹打消解。

纯化RNA：

a.在PCR管中加入5μL 10×DNaseⅠBuffer，然后加入1μL RNAaseInihibiter(40U/μL)再加入RNA粗提液43μL、DNaseⅠ(RNase-free 5U/μL)1μL，混匀，于孵育器中37℃反应60min。

b.反应后加入50μL 0.1％DEPC液，混匀。

c.加入100LμL体积比为25：24的酚：氯仿。充分混合，静置5min，12000rpm4℃离心10min，小心吸60μL最上层溶液至新的PCR管中。

d.重复步骤c。

e.加入6μL 3M NaAC、4ul DNA mate，加入175μL-20℃无水乙醇，醇沉45min，取出后4℃，12000rpm离心15min。

f.保留沉淀，用-20℃的70％乙醇500μL向沉淀反向加入洗涤，之后12000rpm，4℃离心5min，

g.去上清，干燥沉淀，用20ul RNAase-free Water回溶。

将纯化后的RNA进行反转录，将纯化后的RNA与Primer oligo(dT)₁₈混合在65℃条件下孵育5min，之后冰浴2min，在加入缓冲溶液，脱氧核苷酸混合物(10m/u dNTP Mix)和Ribolock RNase Inhibitor(RNA抑制剂)、Revertaid M-mul Reverse Transcriptanse(反转录酶)在42℃条件下孵育1h，之后70℃5min终止反应。反应结束后得到cDNA，于-80℃保存。

将获得的cDNA进行基因筛选，以获得与野生型吉农18大豆的区别基因，利用直系同源蛋白质家族数据库(Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG)，将大豆吉农18和吉农18突变体样品不同基因的相对表达量进行对比，选择差异倍数绝对值e≥2.8，FDR(False Discovery Rate)＜0.01，且COG注释有意义的基因作为目标基因，筛选出差异系数较大的大豆病程相关蛋白基因GmPR1，其基因序列详见序列表SEQ ID NO.1所示。

实施例2

通过引物设计原则和多种计算机程序，涉及获得了大豆病程相关蛋白基因GmPR1的扩增引物，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，引物序列为：引物1，SEQ IDNO.2：ATAATGGGATACTTGTGC，引物2，SEQ ID NO.3：CTACAGTTCGTAGGGACTT。以上述cDNA为模板，在如表1的扩增体系和扩增条件为：预变性：94℃，5min；变性：94℃，35s；复性46.5℃，35s，延伸72℃，35s；后延伸72℃，8min的条件下进行RT-PCR扩增，获得扩增产物。

表1 RT-PCR扩增体系

试剂	用量	试剂	用量
				无核酸酶水	15.2μL	引物2	1μL
缓冲溶液	2.5μL	cDNA	1μL
				MgCl<sub>2</sub>	2.5μL	Taq酶	0.3μL
引物1	1μL

实施例3

选取实施例2中获得的扩增产物，按照Axygen公司提供的DNA纯化试剂盒的说明书进行扩增产物的纯化，获得纯化的扩增产物。并利用TaKaRa公司提供的pMD-18T-vector克隆载体与纯化的扩增产物连接构建重组质粒PMD-18T-GMPR1，具体方法为：将pMD-18T-vector与纯化扩增产物以及连接酶溶液混合均匀在16℃条件下孵育12h。

实施例4

以实施例3获得的重组质粒PMD-18T-GmPR1为模板，进行PCR扩增制备GmPR1片段，使用CE Design V1.04设计引物的同源臂，获得该扩增引物SEQ ID NO.4：ACTCTTGACCATGGTAGATCTATAATGGGATACTTGTGC，SEQ ID NO.5：GGGAAATTCGAGCTGGTGACCCTACAGTTCGTAGGGACTT，并在如表1的扩增体系，除扩增引物替换为上述两种引物，其他试剂和条件不变的条件下进行扩增，获得目的基因。

选择第二质粒载体pCAMBIA3301，用双酶切法制备pCAMBIA3301线性化载体，根据GmELF4-LIKE4序列上的酶切位点和pCAMBIA3301载体上可用的酶切位点，选取限制性内切酶BglⅡ、BstEⅡ双酶切载体2h，并在65℃条件下使限制内切酶失活，获得线性化载体。酶切体系(20μL)为：ddH₂O(11μL)、Buffero(2μL)、载体质粒(5μL)、BglⅡ(1μL)、BstEⅡ(1μL)。于孵育器内37℃酶切2-3h，65℃15min使限制酶失活。

上述获得的目的基因和酶切pCAMBIA3301线性化载体分别使用DNA凝胶回收纯化试剂盒回收线性化载体pCAMBIA3301和目的基因片段。

将纯化后的线性化载体pCAMBIA3301和目的基因片段置于重组体系中，混匀后在孵育器内50℃反应15min，之后冰浴5min获得重组载体pCAMBIA3301-GmPR1。该重组体系为：5μL 2×Seamless Master Mix，线性化载体60ng，按着DNA与线性化载体摩尔比3：1，基因片段20ng左右。获得将2024bp的GUS基因替换为目的基因GmPR1，构建了以Bar基因为筛选标记的过表重组载体，其结构示意图如附图1所示。

实施例5

将实施例4获得的重组载体转化大肠杆菌，获得重组细胞，具体方法如下：

a.-80℃取出感受态细胞，加入10ul连接产物，冰上放置35min；将感受态放入42℃孵育器，90s，并置于冰上2min。

b.向感受态细胞中加入850ul LB液体培养基，置于37℃培养箱中，150rpm条件下振荡培养45min。

c.将涂布棒蘸取酒精，在酒精灯上加热消毒三次。

d.将感受态细胞4000rpm离心5min，吸出600ul LB液体培养基，剩余200ul LB液体培养基用于打散菌体。

e.按同一方向将感受态细胞均匀涂在LB+AMP固体培养基上，双层封口膜，置于37℃恒温培养箱中，正置30min后倒置12-20h，获得重组细胞大肠杆菌菌落。

载体质粒的大量提取：

a.在无菌台内挑取上述单菌落于5mlLB+k液体试管中，210rpm，37℃振荡培养13-16h。

b.将培养成功的菌液转移到2.0离心管中，分多次，收集全部菌体，11000rpm，室温下离心2min，倒掉LB液体。

c.向沉淀菌体中加入溶液Ⅰ(0.99g葡萄糖、2.5mlTrisHCL、2mlEDTANa加水定容至100ml)90ul，充分吸打混匀菌体，室温下裂解8min。

d.向菌体悬浮液中加入180ul溶液Ⅱ(NaOH0.8g定容至50ml、SDS1g定容至50ml)，吸打混匀，冰上放置8min。

e.向混合液中加入130ul事先冰上预冷的溶液Ⅲ(乙酸钾60ml、冰醋酸11.5ml、dd水28.5ml)130ul，颠倒混匀数次，置于冰上20min。

f.将上述液体离心，11000rpm，13min，将上清液转移至新的离心管中，记录体积。

g.加入与上清液等体积的酚/氯仿混合液，目的为了去除蛋白，吸打混匀多次，10000rpm离心6min。吸出上清液转移至新的离心管中。

h.加入上清液两倍体积的乙醇溶液，充分混匀，置于冰箱-20℃，18-22min，11000rpm离心6min，倒掉上清液，将离心管扣在灭菌过的滤纸上吸干管内液体。

i.配制70％的乙醇溶液，向晾干的沉淀中加入1ml乙醇溶液，悬浮洗涤沉淀，11000rpm离心2min，倒掉乙醇溶液，将离心管置于通风处吹干10min左右。

j.待沉淀透明后，加入15-25ulTE溶液，置于37℃水浴锅中15min获得载体质粒溶液，-20℃冰箱冻存。

花粉管通道法转入大豆：

在大豆吉农18突变体的盛花期，选取完全开放的大豆花器，除去其他多余花器，留下每个分支2-3朵左右，用镊子和小剪刀将大豆的花萼去除，并且用剪刀减掉柱头及其下部约1mm左右，即可看见花粉管，将制备好的上述载体质粒5ul滴加在花粉管上，40min以后再复滴一次，挂上标签，秋收时将结实籽粒收回。

结构的表征：

大豆相关病程蛋白基因GmPR1电泳分析

将实施例1获得的以cDNA扩增的大豆病程相关蛋白基因GmPR1基因、第一重组载体PMD-18T-GmPR1和pCAMBIA3301-GmPR1进行凝胶电泳检测，详见附图2、附图3和附图4(M为DNA分子量标准，1-5为目的基因扩增产物)，其在500bp以上位置有清晰的特异性条带，在PMD-18T-GmPR1获得与目的片段大小一致的525bp片段，说明目的基因GmPR1成功连入pMD-18T载体中。

大豆病程相关蛋白基因GmPR1的生物信息学分析：

GmPR1基因的开放阅读框及氨基酸组成通过ORF在线分析，GmPR1基因的开放阅读框为525bp，编码174个氨基酸。利用ProtParam软件对PR1序列进行预测的结果氨基酸残基数为174，相对分子量18639.8，理论等电点(PI)为6.07，正电荷,氨基酸残基总数(Arg+Lys)为10，负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为19，，分子式为C₈₁₀H₁₂₄₁N₂₁₉O₂₆₁S₁₃.氨基酸组分析表明:丙氨酸(Ala)缬氨酸(Val)甘氨酸(Gly)含量较高分别占10.9％、10.3％、9.2％，而苯丙氨酸(Phe)色氨酸(Trp)所占比例比较少分别为1.1％和1.7％。

GMPR1蛋白的亲疏水性预测位于16位的异亮氨酸(Ile)分值最高(3.189)，疏水性强；位于115位精氨酸(Arg)分值最低(-2.467)，亲水性最强；从整体来看，PR1基因亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，即PR1表现为亲水性。

GMPR1蛋白的三维结构预测利用SWISS-MODEL软件，对蛋白质序列进行自动同源建模，获得三维结构详见附图4，推测其参与植物获得系统抗性调控途径。

含有GmPR1基因的转化植株的抗病性鉴定：

将实施例5获得的种子进行种植，获得含有GmPR1基因的阳性转化植株，进行大豆疫霉根腐病的抗病性鉴定，并以未转化的吉农18突变体植株作为对照。具体方法如下：

a.大豆疫霉根腐菌菌种的繁殖

选用胡萝卜培养基繁殖大豆疫霉根腐菌，培养基配方如下：新鲜胡萝卜200g，洗净，切成小块状，加入约1.2L蒸馏水，煮沸约15min，使胡萝卜汁液体剩余约1L左右，经三层纱布过滤，加入琼脂10g，蔗糖20g，定容至1L，高压灭菌20min，倒板吹干备用。

将手术刀片蘸酒精灼烧消毒3次，切割0.4cm×0.4cm菌块接种于胡萝卜培养基上，双层封口膜，置于25℃培养箱7-9d，室温备用。

b.植株接菌

大豆植株培养至苗期对生真叶完全展开时，采用下胚轴侵染法，接种大豆疫霉根腐菌，操作方法如下：使用手术刀在距离子叶节下部2cm处，45度倾斜切一条伤口，深度约为茎粗的1/3，刚好流出组织液为最适宜程度。将大豆疫霉根腐菌分割成5mm的正方形菌块，插入茎部伤口处，菌丝面贴在伤口内侧，固定菌块，对伤口进行持续保湿处理5-7d。用塑料薄膜将植株罩住，温度大约保持在25℃，湿度95％以上，每个处理三次重复。

接种5d后，提取发病植株的RNA进行荧光定量检测，进一步分析目的基因在转基因植株中的相对表达量。

c.病情调查统计

对接种大豆疫霉根腐菌5d的转基因和非转基因植株的死亡率进行调查统计，植株死亡率低于30％为抗病(resistant，R)品种；死亡率介于31％～69％为中抗(moderatelyresistant，MR)品种；死亡率高于70％的为感病(susceptible，S)品种，具体抗性鉴定标准如下表1。

表1抗性鉴定标准

死亡率	抗性级别
		≤30％	抗病(R)
31-69％	中抗(MR)
		≥70％	感病(S)

大豆植株的抗病率的结果如表2所示：

株系	株数	存活株数	死亡株数	死亡率	抗性评价
						阳性转化植株	19	9	10	52.63％	MR
未转化植株	19	15	14	21.05％	R

由上表可知，含有GmPR1基因的阳性转化植株死亡率为21.05％，达到了抗性水平。对照品死亡率为52.63％，中抗水平。显然阳性转化植株对于大豆疫霉根腐病的抗性明显提高。

疫霉根腐病侵染后GMPR1基因的相对表达量测定：

荧光定量PCR以转阳性转化植株的根、叶cDNA为模板，利用荧光定量PCR仪，actin基因做内参，使用荧光定量试剂盒，目的基因扩增体系如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃条件下反应35s，共40个循环，每个cDNA样品需设置至少三次重复。

利用2^-△△Ct方法计算出经过两种病原菌侵染后目的基因在植株根部和叶片的相对表达量，结果表明，阳性转化植株GmPR1的表大量为6.27，相较于未转化植株的1.00显著增高。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 大豆病程相关蛋白基因、重组载体、重组细胞、重组体系及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggatact tgtgcattaa ggtttcgttt tgtgtgatgt gtgtgttggg gttggtgatt 60

gtgggtgatg ttgcctatgc tcaagattca gctcaagact atgtaaatgc acacaatgct 120

gcacgagcag aggtgagttc tcaatcacca agagcaaatg taattgttcc aagtttggct 180

tgggatgata cggttgctgc ttatgcagag agctatgcta atcaacgtaa aggtgactgt 240

gcactgatcc actctggtgg aaaatatggg gagaatattg caatgagcac tggtgaacta 300

agtggcacag atgcagtgaa aatgtgggtt gatgagaaag ccaactatga ctacaattcc 360

aattcctgtg ttggcggaga gtgcctgcac tacactcagg ttgtttgggc ccactctctg 420

cgtcttggat gtgccaaagt gacatgtgat aatggaggca ctttcatcac ttgcaactat 480

gatccccctg gcaacttggt tggtgaaagt ccctacgaac tgtag 525

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataatgggat acttgtgc 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacagttcg tagggactt 19

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actcttgacc atggtagatc tataatggga tacttgtgc 39

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggaaattc gagctggtga ccctacagtt cgtagggact t 41

Claims

1.一种大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述的应用步骤如下:

选择大豆吉农18突变体，对突变体的幼根进行总RNA的提取，通过反转录合成cDNA第一条链作为模板，再进行RT-PCR扩增，获得扩增产物；

从所述重组细胞中进行植物过表达载体提取，并通过花粉管道法转入至大豆植物体内，获得含有大豆病程相关蛋白基因的大豆植物体。

3.根据权利要求2所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述RT-PCR扩增，扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述RT-PCR扩增，扩增条件为：预变性：94℃，5min；变性：94℃，35s；复性46.5℃，35s，延伸72℃，35s；后延伸72℃，8min。

5.根据权利要求2所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述预定酶切体系具体包括：

限制性内切酶BglⅡ，限制性内切酶BstEⅡ，内切酶缓冲溶液，双蒸水。

6.根据权利要求2所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述以所述第一重组质粒为模板，在含有预定的扩增引物的扩增体系中进行扩增，获得目的基因片段方法中，预定的扩增引物为如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求2所述的大豆病程相关蛋白基因在抗大豆疫霉根腐病的应用，其特征在于，所述将所述植物过表达载体通过冻融法转化大肠杆菌感受态细胞中，获得重组细胞的具体方法包括：

将所述植物过表达载体加入到解冻的大肠杆菌感受态中，冰浴后在液氮中冷冻1-3min，在35-38℃水浴中融化后加入LB液体培养基，获得混合细胞悬浮液；

将所述混合细胞悬浮液放置在摇床以转速为140-150rpm的条件下振荡培养0.5-1.0h后，在转速为3000-5000rpm的条件下离心4-7min，获得悬浮菌液；

将所述悬浮菌液吸出涂于LB+AMP固体培养基上，并在35-38℃培养箱中培养24-36h。