CN111154794A - 一种棉花GhBsr-k1基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供一种棉花GhBsr‑k1基因的应用，本发明根据同源基因的序列信息，采用RT‑PCR方法从棉花中克隆得到了一个基因，命名为GhBsr‑k1，如SEQ ID NO：1所示，对该基因进行表达模式分析和VIGS介导功能验证，结果表明GhBsr‑k1在棉花抗黄萎病和/或枯萎病中发挥重要的负调控作用，通过沉默GhBsr‑k1基因后，棉花增强了对黄萎病和枯萎病的抗性，表明该基因可用于棉花广谱抗病育种中，通过创制Ghbsr‑k1的棉花突变体材料，以期大大增强棉花对黄萎病和/或枯萎病的抗性，从而减少每年因棉花病害对棉花产业所造成的直接经济损失。

Description

一种棉花GhBsr-k1基因的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种棉花GhBsr-k1基因的应用。

背景技术

棉花是世界上主要的经济作物，可为纺织工业和食品工业供给可再生的纤维和油籽。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的土传性维管束病害，是降低棉花纤维品质和产量的首要生物胁迫因素。在我国，棉花黄萎病棉田面积占种植总面积的50％，每年因黄萎病造成直接经济损失高达16～20亿美元。由于黄萎病菌寄生于寄主的维管束中，其微菌核和休眠体的存在使得黄萎病得不到有效的防治，并且尚无一种杀菌剂和种植方法可以有效防治黄萎病。在众多的棉花品种中，陆地棉(Gossypium hirsutumL)的产量占世界棉花总产量的90％以上，是种植面积最广的品种。然而抗黄萎病的种质资源在陆地棉中普遍缺少，采用育种技术培育出优质的抗病品种已成为棉花产业迫切的需求。由于传统育种技术具有周期长、难度大等缺点，现代基因工程技术的兴起极大地提高了育种的效率，目前能用于抗病育种的基因少之又少，并且棉花黄萎病抗病机制尚未彻底揭示，因此，挖掘优质的抗病基因对棉花抗病育种乃至于实现棉花高产抗病具有重大而又深远的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花GhBsr-k1基因在增强棉花对黄萎病和/或枯萎病抗性中的应用，其中，通过所构建的沉默载体、宿主菌对棉花GhBsr-k1基因沉默后，植株对黄萎病和/或枯萎病的抗性增强。

本发明的另一目的在于提供该棉花GhBsr-k1基因棉花抗黄萎病和/或枯萎病育种中的应用，其中，通过所构建的沉默载体、宿主菌对棉花GhBsr-k1基因沉默后获得的植株，对黄萎病和/或枯萎病的抗性增强。

本发明是这样实现的，棉花GhBsr-k1基因在增强棉花对黄萎病和/或枯萎病抗性中的应用；其中，该棉花GhBsr-k1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，本发明所提供的应用中，包括构建沉默GhBsr-k1基因表达的烟草脆裂病毒沉默载体pTRV1和pTRV2，通过该沉默载体增强棉花对黄萎病和/或枯萎病抗性。

优选地，本发明所提供的应用中，包括用于携带上述沉默载体的宿主菌农杆菌GV3101，通过该宿主菌沉默GhBsr-k1基因增强棉花对黄萎病和/或枯萎病抗性。

本发明进一步公开了棉花GhBsr-k1基因在棉花抗黄萎病和枯萎病育种中的应用；其中，该棉花GhBsr-k1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。通过在育种环节对棉花GhBsr-k1基因进行敲除，得到对抗黄萎病和/或枯萎病抗性的棉花种子或棉花品种。

本发明克服现有技术的不足，提供一种棉花GhBsr-k1基因在抗病育种中的应用。通过转录组数据库筛选得到一个基因，该基因与水稻Bsr-k1(broad-spectrum blastresistance digu1)高度同源，且均编码TPR蛋白，命名为GhBsr-k1，水稻Bsr-k1通过降解木质素合成基因PAL的转录本负调控了水稻对稻瘟病的广谱抗性。同时为了探讨该同源基因在陆地棉中的功能，本发明对GhBsr-k1进行了表达模式分析和病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)介导功能验证。荧光定量PCR分析显示，GhBsr-k1在根、下胚轴、真叶中均表达，其中在根中的表达量略高于茎和叶。在棉花黄萎病菌胁迫处理下，GhBsr-k1表达量呈现降低再上升的趋势。水杨酸处理后的1h、3h、6h，GhBsr-k1的表达量显著升高。VIGS技术沉默GhBsr-k1基因后，植株对黄萎病和/或枯萎病的抗性都明显增强，表明GhBsr-k1在棉花抗黄萎病和/或枯萎病中发挥重要的作用。该研究为深入揭示棉花抗黄萎病机理提供理论依据，为棉花抗病分子育种提供优质的候选基因。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：沉默GhBsr-k1基因后，棉花显著增强了对黄萎病和枯萎病的抗性，表明该基因可用于棉花广谱抗病育种中，通过创制Ghbsr-k1的突变体材料，以期大大增强棉花对黄萎病和/或枯萎病的抗性，从而减少每年因棉花病害对棉花产业所造成的直接经济损失。

附图说明

图1是GhBsr-k1基因的结构，该基因组长度9028bp，ORF区长为3531bp，编码1176个氨基酸；

图2是Bsr-k1与GhBsr-k1蛋白质具有相同的保守结构域分析；

图3是GhBsr-k1在根、下胚轴、真叶中的表达情况；

图4是大丽轮枝菌V991诱导下根系中GhBsr-k1的表达模式；

图5是2mM水杨酸处理下GhBsr-k1的表达模式；

图1～5中，误差线由3个生物学重复所得，统计分析由IBM SPSS Statistics23软件完成，*P＜0.5，**P＜0.01，***P＜0.001；

图6是沉默GhBsr-k1与阳性对照CLA1的载体构建策略；

图7是阳性对照TRV：CLA1沉默植株；

图8是接种黄萎病菌前TRV：GhBsr-k1植株的沉默效率检测；

图9是沉默GhBsr-k1增强了棉花对黄萎病的抗性；

图10是TRV：GhBsr-k1植株与TRV：00植株的黄萎病病情指数；

图11是qPCR检测黄萎病菌相对含量；

图12是茎段恢复培养结果；

图13是TRV：GhBsr-k1与TRV：00植株的剖杆情况；

图14是接种枯萎病菌前TRV：GhBsr-k1植株的沉默效率检测；

图15是沉默GhBsr-k1增强了棉花对枯萎病的抗性；

图16是TRV：GhBsr-k1植株与TRV：00植株的枯萎病病情指数；

图7～图16中，实验结果均为3个生物学重复所得，显著性分析采用单因素方差分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、材料和方法

1、植物材料及处理

供试植物材料为陆地棉“军棉1号”，选取籽粒饱满的种子，经30％过氧化氢溶液中浸泡2小时，无菌水冲洗3次，37℃培养箱中浸泡24小时，取露白的种子置于发芽纸上发芽，1天后取芽长一致的种子播种于含有蛭石的营养土(营养土：蛭石＝2：1)中，培养条件为：28℃±2，16小时光照；25℃±2，8小时暗培养；光照强度120μEM^-2/S；相对湿度75％。收集15天正常生长的根、下胚轴、真叶，用于分析组织特异性表达；高致病性棉花黄萎病菌V991用于接菌侵染，孢子浓度为1×10⁷，采用伤根蘸菌法(马平,李社增,唐文华.一种新的棉花黄萎病快速接种技术及其在病原菌致病力和寄主抗病性鉴定上的应用[J].植物病理学报,2004,34(6):536-541)分别对长势一致且健康的植株，进行大丽轮枝菌V991接菌处理，对照采用相同浓度的查氏液体培养基溶液，于侵染后0h、4h、8h、12h、24h、48h，收集根系组织，液氮速冻，-80℃保存，用于GhBsr-k1在接菌处理下的表达分析。待幼苗长至1个月左右，清洗棉苗根部土壤，然后浸泡于2mM水杨酸中进行处理，对照采用相同浓度的无水乙醇溶液处理，于处理后0h、15min、30min、1h、3h、6h，收集根系组织，液氮速冻，-80℃保存(Tang Y,Zhang Z,Lei Y,et al.Cotton WATs Modulate SA B-iosynthesis and Local LigninDeposition Participating in Plant Re-sistance Against Verticillium dahliae[J].Frontiers in plant science,2019,10.)。以上实验进行3次生物学重复。

2、陆地棉GhBsr-k1基因的克隆

利用陆地棉蛋白数据库(https://www.cottongen.org/blast/protein/protein)对水稻Bsr-k1的氨基酸序(Os10g0548200)进行Blastp比对。根据同源基因的序列信息设计特异性引物，如下表1所示：

表1引物用途及其序列

引物名称	序列(5’-3’)	用途
			GhBsr-k1-F	CACCATCCGTACCTCTCAGT	ORF序列扩增
GhBsr-k1-R	TTGTGTGCTAATGTGCGGAA	ORF序列扩增
			V-GhBsr-k1-F	GAATTCGCATCACAGGAGGAGATCACT	沉默GhBsr-k1
V-GhBsr-k1-R	GGTACCGGGCCGTAAGCACTTCTGCAAT	沉默GhBsr-k1
			V-GhCLA1-F	GGAATTCCACAACATCGATGATTTAG	沉默GhCLA1
V-GhCLA1-R	GGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC	沉默GhCLA1
			qGhBsr-k1-F	GGCACTGTCCTCAAATCTCACT	荧光定量PCR
qGhBsr-k1-R	AGTCCAACTCCTTCCCCTTCT	荧光定量PCR
			ITS-F	AAAGTTTTAATGGTTCGCTAAGA	荧光定量PCR
VE1-R	CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA	荧光定量PCR
			qGhUBQ7-F	GAAGGCATTCCACCTGACCAAC	内参引物
qGhUBQ7-R	CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG	内参引物

根据上表1中引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：5xPhusion HF buffer 10μL，dNTP 4μL，GhBsr-k1-F/R各1μL，cDNA模板1μL，Phusion polymerase0.5μL，反应程序为：98℃预变性30s；98℃10s，58℃30s，72℃延伸1min 10s，35个循环；72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，回收产物与Blunt-Zero克隆载体连接(北京全式金生物技术有限公司)，转化Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，经酶切鉴定，挑取阳性质粒送至华大基因科技有限公司测序。

3、GhBsr-k1的生物信息学分析

通过Cottongen数据库(https://www.cottongen.org/icgi/home)检索水稻Bsr-k1的同源基因，利用PlantCARE对GhBsr-k1基因上游2000bp进行启动子顺式作用元件分析(Lescot M,Déhais P,Thijs G,et al.PlantCARE,a database of plant cis-actingregulatory elements and a portal to tools for in silico ana lysis of promotersequences[J].Nucleic acids research,2002,30(1):325-327)；NCBI蛋白质保守结构域数据库CCD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structu re/cdd/w-rpsb.cgi)用于保守结构域分析。

4、农杆菌介导的基因沉默

病毒介导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing technology，VIGS)目前已经成功应用于分析棉花的基因功能。通过SGN-VIGS在线软件(https://vigs.solgenomics.net/)(Fernandez-Pozo N,Rosli H G,Martin G B,et al.The SGNVIGS tool:user-friendly software to design virus-induced gene silencing(VIGS)constructs for functional genomics[J].Molecular plant,2015,8(3):486-488)设计GhBsr-k1基因的特异性片段；阳性对照采取沉默陆地棉GhCLA1基因(刘慧,于秀立,黄先忠.TRV病毒介导的基因沉默体系在新疆陆地棉和亚洲棉中的建立[J].棉花学报,2016,28(5):485-492)。分别在上下游引物(表1)的5’端加EcoRⅠ和KpnⅠ的酶切位点和保护碱基，扩增目的片段，测序正确后，与烟草脆裂病毒载体pTRV2连接，经酶切验证，获得重组载体pTRV2-GhBsr-k1和pTRV2-CLA1；采用冻融法将阳性载体、pTRV2空载体以及pTRV1辅助载体分别转化农杆菌GV3101感受态细胞，在LB固体培养(50mg/L Kan和40mg/L Gen)上28℃培养1～2天，经过菌落PCR鉴定，挑取含有重组载体pTRV2-GhBsr-k1、pTRV2-CLA1和pTRV1、pTRV2载体的农杆菌按1％的质量浓度在LB诱导培养基(50mg/L Kan和40mg/L Gen；10mmol/LMES；20μmol/L AS)中)中以28℃，200r/min培养12h，收集菌体，重悬液(10mM MES，10mMMgCl₂，200μmol/L AS)重悬菌体，调整OD 600至1.2左右；28℃避光静置3h；pTRV1分别与pTRV2、pTRV2-GhBsr-k1以及pTRV2-CLA1重悬液按体积比1：1混匀；采用1mL无菌注射器注射幼苗子叶，避光24h。设置3组生物学重复，每组至少20株。

5、病原菌侵染与病情统计

大丽轮枝菌V991和7号生理小种分别用于棉花黄萎病和枯萎病的接种；在马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上用无菌打孔器取一块含有菌丝的培养基，接种到查氏液体培养基中，25℃，200r/min培养4～5天，至孢子数为10⁸～10⁹个孢子/mL；稀释孢子悬浮液至1×10⁶个孢子/mL；植物样本的接病方式采用蘸根法(Gao W,Long L,Zhu L F,etal.Proteomic and virus-induced gene silencing(VIGS)analyses reveal thatgossypol,brassinosteroids,and jasmonic acid contribute to the resistance ofcotton to Verticillium dahliae[J].Molecular&cellular proteomics,2013,12(12):3690-3703；Zhu W,Gao E,Shaban M,et al.GhUMC1,a blue copper-binding protein,regulates lignin synthesis and cotton immune response[J].Biochemical andbiophysical research communications,2018,504(1):75-81)，待注射子叶后15天左右，用清水冲洗，从土壤中取出棉花幼苗，浸入孢子悬浮液1min，重新种于基质中，至于培养室使幼苗继续生长，接菌前后植物生长条件保持一致。为了调查沉默植株对棉花黄萎病的抗性，病情指数(DI)测定、茎段恢复培养和真菌生物量定量测定将用于该研究。在接种病菌20天后，采用0～4级病情等级分别对样本黄萎病表型进行病指统计，植株病情分级标准如下：

0级：棉株叶片正常，无明显萎蔫，褪绿；

1级：棉株叶片发黄萎蔫的面积占整株叶片总面积25％以下；

2级：棉株叶片发黄萎蔫的面积占整株叶片总面积50％以下，25％以上；

3级：棉株叶片发黄萎蔫的面积占整株叶片总面积75％以下，50％以上；

4级：棉株叶片发黄萎蔫的面积占整株叶片总面积75％以上。

病情指数根据如下公式：病情指数(Disease index，DI)＝[∑(级数×各级病株数)/(总株数×最高病级数)]×100(Yan Z,Xingfen W,Wei R,et al.Island cottonenhanced disease susceptibility 1gene encoding a lipase-like protein plays acrucial role in response to Verticillium dahliae by regulating the SA leveland H2O2accumulation[J].Frontiers in plant science,2016,7:1830)。

病情指数代表一个群体的感病状态，病情指数越低说明植物抗病性越强；在接种黄萎病后，分别取TRV：GhBsr-k1沉默植株和对照植株的下胚轴，经10％次氯酸钠表面消毒处理，无菌水反复冲洗3遍，用无菌的双面刀片在子叶节间以下2cm处切下2mm左右的茎段，切面朝下固定在PDA培养基(280mg/L Cef)上，25℃培养5天；利用黄萎病特异性引物ITS-F、VE1-R(Ellendorff U,Fradin E F,De Jonge R,et al.RNA silencing is required forArabidopsis defence against Verticillium wilt disease[J].Journal ofexperimental botany,2008,60(2):591-602)进行相对定量PCR以检测发病植株真菌的生物含量，GhUBQ7作为内参基因，以上实验均进行3次生物学重复。

6、DNA/RNA提取及qRT-PCR

在接种20天后，采用植物DNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)分别提取5株TRV：GhBsr-k1和TRV:00样本茎的DNA，作为检测病菌生物量的模板；使用植物多糖多酚总RNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取根、下胚轴、真叶的总RNA；按照5×All-In-One RT MasterMix反转录试剂盒(ABM生物科技有限公司)提供的操作步骤完成合成单链cDNA；采用EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix试剂盒(ABM生物科技有限公司)在ABI7500-Fast实时定量PCR系统中进行qPCR检测；以陆地棉泛素基因GhUBQ7(DQ116441)作为内参基因(引物见表1)，2^-△△Ct法(Livak,K.J.and Schmittgen,T.D.Analysis ofRelative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods,2001(25):402-408)计算基因的相对表达量；基因的表达分析采用IBM SPSS Statistics 23和Graphpad Prism 8.0软件完成。

二、结果与分析

1、GhBsr-k1基因的克隆

木质素在棉花抗病中起了重要的作用，在棉花抗病分子机制的研究中，报道了许多与木质素沉积相关的基因，水稻Bsr-k1是一个TPR蛋白，通过降解PALs基因的mRNA从而影响水稻对稻瘟病的抗性，水稻bsr-k1突变体能具有对稻瘟病和白叶枯病的广谱抗性，为了探讨棉花中Bsr-k1同源基因在抵御病原菌的入侵中的作用。该研究从陆地棉数据库中克隆获得了Bsr-k1的同源基因，命名为GhBsr-k1，GhBsr-k1开放阅读框的长度为3531bp，编码1176个氨基酸(图1)，含有与Bsr-k1相同的TPR结构域(图2)，启动子元件分析表明存在包含多种反应元件，其中含有一个水杨酸应答元件，推测GhBsr-k1受水杨酸调控。

2、GhBsr-k1基因的表达分析

为了分析GhBsr-k1在组织中的表达情况，分别对以真叶、下胚轴、根反转录产物为模板，进行荧光定量PCR，检测GhBsr-k1在3不同组织部位的表达情况(图3)，结果显示GhBsr-k1在3个组织中均检测到信号，其中根的表达量略高，而下胚轴和子叶的表达量无显著差异。为了探讨GhBsr-k1是否受棉花黄萎病诱导，分析了在接种棉花黄萎病后6个时间点GhBsr-k1的表达模式，结果显示在12和48小时GhBsr-k1的表达增强，表明GhBsr-k1受黄萎病菌诱导(图4)，由于GhBsr-k1的启动子区含有水杨酸应答元件，而水杨酸为植物免疫反应中一类重要的激素，为了探讨GhBsr-k1是否响应水杨酸，用外源水杨酸浸泡根部后设置了6个时间点，结果显示在水杨酸处理的初期即0.25h和0.5h，GhBsr-k1的表达无显著性增加，而在1～6h，GhBsr-k1的表达量明显增强(图5)，表明GhBsr-k1的表达受水杨酸的调控。

3、GhBsr-k1基因的功能验证

为了明确GhBsr-k1在棉花防卫反应中的作用，采用VIGS技术对GhBsr-k1基因进行沉默，获得GhBsr-k1基因沉默植株TRV：GhBsr-k1(载体的构建策略见图6)；采取子叶注射的方式对7天左右大的苗进行注射，在注射后15天阳性对照TRV：CLA1沉默植株叶片白化(图7)，表明VIGS系统正常工作，沉默效率检测发现植株根茎中均发生GhBsr-k1基因的沉默(图9)；在接种大丽轮枝菌V991后第20天，TRV:GhBsr-k1与TRV:00出现叶片萎蔫、黄化，脱落的数量逐渐增多，两者在叶片坏死，黄化以及落叶的程度上表现出明显的差异(图8)。在接种枯萎病菌7号生理小种后第20天，TRV:GhBsr-k1与TRV:00均出现叶片枯萎，脱落的叶片数逐渐增多，两者在叶片枯萎和落叶的程度上表现出明显的差异(图14、图15)。病情指数统计的结果表明在分别接种黄萎病和枯萎病后TRV:GhBsr-k1的病指显著低于对照植株(图10、图16)。取下胚轴子叶节间下5厘米的茎秆，提取DNA，依据大丽轮枝菌特异性引物进行qPCR以检测黄萎病菌的含量。qPCR结果表明，TRV:GhBsr-k1沉默植株中，黄萎病菌含量明显低于TRV:00对照(图11)，种15天后的棉花茎杆恢复培养也有类似的结果(图12)；通过对TRV：GhBsr-k1与TRV：00植株进行剖杆检测，结果显示TRV：00植株比沉默植株的维管束有更大面积的褐变(图13)，表明在抑制GhBsr-k1表达后显著增强了棉花对黄萎病的抗性。

近年来水稻中报道了一个Bsr-k1基因，作为一个广谱抗稻瘟病位点，其编码TPR蛋白能够结合并降解免疫相关PALs基因的mRNA，导致木质素含量增加，植株抗病性增强。Xu等研究表明木质素在棉花抗黄萎病中扮演了重要的角色，其中GhPALs处于木质素合成途径中的关键基因，由于Bsr-k1编码的TPR结构域在不同的植物中是高度保守的，并且其同源基因可能与Bsr-k1调控相似的免疫通路，因此验证GhBsr-k1的功能对棉花抗黄萎病研究的意义重大。基于此，本发明克隆得到了陆地棉中与水稻Bsr-k1的同源基因，并命名为GhBsr-k1，氨基酸序列比对结果表明GhBsr-k1与水稻Bsr-k1的相似度E值为0.0，同时蛋白质保守结构域分析表明GhBsr-k1与Bsr-k1具有相同的TPR功能域，这进一步证实了Bsr-k1在进化过程中的保守性。大丽轮枝菌V991和SA诱导了GhBsr-k1的表达；沉默GhBsr-k1基因后，植株对黄萎病和枯萎病表现出更高的抗性，因此GhBsr-k1有望成为棉花抗病分子育种中优质的候选基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> 一种棉花GhBsr-k1基因的应用

<141> 2019-12-10

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> GhBsr-k1

<211> 3531

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum spp

<400> GhBsr-k1

atgaaaacaa cgggtgagct ggagggagaa gaaagaaggc gactggagga gttggtcgaa 60

aataatcccg atgactcttc ccttcatttt caacttggag tatgcttgtg ggagactcag 120

acggagaaag agaaagcggc ggagcattgg gtgatttccg ttaaacaaaa ccctaagaac 180

gcagctgcct tcatctactt gggccattac tacgccaccg tttcggtcga tatccccaga 240

gccatcaagt gttaccagcg agcgttatcc cttaatcccg atgattccga ttctggggaa 300

gctttgtgtg atttgttgga tagtcaaggc aaggagacct tggaggtcgc aatttgcaaa 360

gatgcttctc acaactctcc cagggctttc tgggctttcc gccgattggg ttgtctccag 420

gtgcatcaaa agaaatggtc tgaagctgta caaagtcttc aacaagctat tcggggctat 480

ccgacttctc ctgatttgtg ggaagctctt ggtcttgcct accaccggct tggcatgttt 540

actgctgcta ttaagtccta ttcacgtgca attgaattag aagattcaag agtctttgcg 600

ctgattgaat gtggaaacat ctttttgatg cttggttcct ttagaaaggg aattgaacaa 660

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ttattagagg acgcatgtaa agttgcagaa gcaagcatca aatcagctgg aaattcatca 840

tgtacatgga agttgcatgg tgatgttctg cttacatatg cacaagtttt tccatggaca 900

gaggagagcc agagtttaga atacaatgca gaaactttca agaagtccgt atacacatgg 960

aagaatacct gtcgtttggc tgctaaatct gccagaaact cttatcaacg agctttgcac 1020

ttagctccat ggcaggctaa tatctacatt gacattgcaa ttagttctaa tcttatctct 1080

tctttcaatc aggattacac acttgataag tgtacttgga agttacccga gaagttgaca 1140

ctgggggctt tagcactaga gggtgagaac tctgagttct gggtggcttt gagctgtttg 1200

actgagtgta atgcacttaa gcagcactcg ttaattaggg gactgcagtt ggatgtgtct 1260

ttagcctatg cttgggcata tcttggaaag ctttatagag aagagaatga gaagaaattg 1320

gctaggcaag catttgactg tgctagaggt atagatccat ccctggcatt accatgggct 1380

ggcatgtcag ctgatgctca tactggggat tcaacaccag atgatgcttt tgagagctgc 1440

ctacgtgctg tggagatatt tccccttgca gagttccaaa ttggacttgc taagcttgct 1500

ttactttctg ggaacctttc ttcttcgcag gtatttggag ctatccagca ggctgtgcaa 1560

cgggcaccgc actaccatga atcccataat ttaaatgggc tagttcacga ggcacgtatg 1620

cagtttcaaa ctgccattgc atcttacagg ctagctcgct atgccatcaa catttcttta 1680

ggcactgtcc tcaaatctca cttgaaagac atatcaacta atttggctag atcacttagt 1740

aaggcaggga atgccattgg tgctgtgcaa gaatgtgaag acttgaagaa agaaggtatg 1800

cttgatgctg aaggtttgca aatatatgct ttctccttat ggcaattggg tgagaatgat 1860

tcagccctct ctgtgactag ggccctggct gccagcgttt ctaccatgga taggatatct 1920

gcagctgtgt ctgttagttt catttgtaga ttgctgtact acatttctgg accggattta 1980

gcaattggta gcattctgaa aatgccgaag gaattatttc atagttcaaa aataagcttt 2040

attgtgtctg ccattaatgc tctggatcag aataataggc tggaatcgat tatttcaagc 2100

agtcgatact ttcttgcatc acaggaggag atcactggga tgcattatct aatagcactt 2160

agcaaactaa ttaaacatag gacaaagcac tatcttgggt ttcagaatgg agtcaaccat 2220

cttagaaaag ctcttcacat gtaccctaac agtattttaa taaggaacct acttggttat 2280

cttttgctat gcagtgaagt atggggaaat agtcatgtgt caagtagatg ttccgtcgtt 2340

gacgattctg actctaagaa caaagagggc ttaaaatcgg cctgggagat ttccagtgct 2400

ggggcagttg cttgccatgc gatcggcaat agtgaaccga gattctcttt cccaacatgt 2460

agctgtcaat gcacgagttc tggagccatg caagaattgc agaagtgctt acggcgggag 2520

ccatggaacc ataatgcccg atacttgctt atccttaatc ttttacagaa agcacgtgaa 2580

gagagatttc ctgtaaacat ctgtattgtt cttgagcgtc tcataagtgt ggctctttct 2640

aatgagttct attctggaaa agaagccatt tgtcaatatc agaagtttca gatttattta 2700

tgtgcttctg aaattctttt gcaaaggggg aatataatgg gctgtattga ccaagccaaa 2760

aatgcttcag cactttctct tccggatagc ttccagtttt tcggacactt actattatgt 2820

cgcgcctacg ctgcagaagg aaatttaaaa ttttctaaag aagagtatga gaggtgcttg 2880

gagcttaaga cagattttct agttggttgg ctatgcctaa aactgatgga atctcagtat 2940

gaagagcaac ctgtttcaaa tatttttgag ttagccttca aggaaggctc agaagggagg 3000

aataattcat ggaatatgtg gatggctgta tatagtttag tgatgggcct gatatgttta 3060

tggaatcggg actttctttc agcagaggaa tttctggaac aaccttgttc gttgaccagt 3120

gctgagagct gcattttcct ttgtcatggt gtcacttcta tggagattgc aaggaggtat 3180

catgattcgc aatttttatc cagtgccata aggagtctca gtaaagctca tataacttct 3240

tcggtcccaa tacccattgt ctcagcattg ttagcccaag cagaaggaag cattggttct 3300

aggaaaaagt gggagagaaa tcttcgcctt gaatggtttt cttggccacc agaaatgaga 3360

ccagcagagc tgttttttca aatgcatttg cttgcaagac agattgcatc cgagtctgac 3420

agttcatcca gggtggaggg ctgccaaagt cccctgcaat gggttcttcg agccattcac 3480

acaaaccctt ctgacttgag atattggaaa gttctgccaa agcttttgta a 3531

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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caccatccgt acctctcagt 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ttgtgtgcta atgtgcggaa 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gaattcgcat cacaggagga gatcact 27

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<212> DNA

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ggggtaccat gatgagtaga ttgcac 26

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ggcactgtcc tcaaatctca ct 22

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aaagttttaa tggttcgcta aga 23

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cttggtcatt tagaggaagt aa 22

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gaaggcattc cacctgacca ac 22

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cttgaccttc ttcttcttgt gcttg 25

Claims (6)

1.棉花GhBsr-k1基因在增强棉花对黄萎病和/或枯萎病抗性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，一种沉默GhBsr-k1基因表达的沉默载体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，一种含有权利要求2所述的沉默载体的宿主菌。

4.棉花GhBsr-k1基因在棉花抗黄萎病和/或枯萎病育种中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，一种沉默GhBsr-k1基因表达的沉默载体。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，一种含有权利要求5所述的沉默载体的宿主菌。

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