CN113684217B - PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用 - Google Patents

PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113684217B
CN113684217B CN202110946806.XA CN202110946806A CN113684217B CN 113684217 B CN113684217 B CN 113684217B CN 202110946806 A CN202110946806 A CN 202110946806A CN 113684217 B CN113684217 B CN 113684217B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peach
ppwrky40a
gummosis
resistance
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110946806.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113684217A (zh
Inventor
刘军伟
李国怀
谭钰琪
张东梅
孟建
沈兴仪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202110946806.XA priority Critical patent/CN113684217B/zh
Publication of CN113684217A publication Critical patent/CN113684217A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113684217B publication Critical patent/CN113684217B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用，本发明通过基因工程手段，在PpWRKY40a基因的全长序列中选取一个目标片段，设计目标片段的引物对VI GS‑PpWRKY40a进行扩增，通过酶切法将目标片段与病毒载体pchRNA3相连，构建VI GS载体，将VI GS载体转化到桃植株，降低PpWRKY40a的表达，获得具有流胶病抗性的植株材料；所述目标片段的序列为SEQ I D NO：2，所述目标片段的引物对VI GS‑PpWRKY40a序列为SEQ I D NO：3和SEQ I D NO：4。本发明通过转基因手段提高桃流胶病抗性，显著降低流胶病发病率，减少桃流胶病带来的经济损失。

Description

PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用
技术领域
本发明涉及提高桃的抗病性方法领域，具体涉及PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用。
背景技术
桃流胶病(Peach gummosis)是一种枝干性病害，普遍发生于长江流域及以南地区。该病引起树势衰弱或树体死亡，缩短桃树经济寿命，降低果实产量和品质，是我国桃产业生产实践中最严重的病害之一(陈彦等2011)。引起病原性桃流胶病的病原菌较多，大部分属葡萄座腔菌科真菌(Wang et al 2011)。目前，有关桃对病原性流胶病的抗病机制的理论研究相对较少。
发明内容
本发明的目的在于克服目前没有行之有效的防治手段，也没有抗性较强的桃品种或材料的不足，提供PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用，所述PpWRKY40a基因的序列为SEQID NO：1。
上述应用是通过基因工程的方法沉默桃的PpWRKY40a基因来提高流胶病抗性。
进一步地，上述应用是通过在PpWRKY40a基因的全长序列中选取一个目标片段，设计引物对VIGS-PpWRKY40a的目标片段进行扩增，通过酶切法将目标片段与病毒载体pchRNA3相连，构建VIGS载体，将VIGS载体导入桃植株来提高桃的流胶病抗性；所述目标片段的序列为SEQ ID NO：2，所述目标片段的引物对VIGS-PpWRKY40a序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
本发明的有益效果为：本发明可通过基因工程手段提高桃的流胶病抗性，可显著降低桃的流胶病发病率，减少因桃流胶病带来的损失。
附图说明
图1为PpWRKY40a基因全长的电泳照片；
图2为不同桃品种接种桃流胶病菌后的发病症状；
图3为PpWRKY40a基因在不同桃品种中的qRT-PCR分析；
图4为桃‘春雪’接种不同桃流胶病菌后的发病症状；
图5为不同桃流胶病菌侵染后PpWRKY40a基因的qRT-PCR分析；
图6为转基因番茄植株的PCR检测；
图7为T1代转基因番茄植株及其对照接种桃流胶病菌的发病症状；
图8为转基因番茄植株及其对照病程相关基因的qRT-PCR分析
图9为沉默毛桃植株中PpWRKY40a的qRT-PCR分析；
图10为沉默毛桃植株及其对照接种桃流胶病菌的发病症状；
图11为沉默毛桃植株及其对照接种桃流胶病菌的病斑直径；
图12为沉默毛桃植株及其对照病程相关基因的qRT-PCR分析。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
我们通过qRT-PCR技术，筛选出了一个响应桃流胶病菌Lasiodiplodiatheobromae JMB-122菌株的转录因子PpWRKY40a,发现其表达水平与桃品种的敏感性桃流胶病菌的致病力呈正相关关系。基于转基因技术，在普通番茄A57中异源过表达该基因，发现转基因植株对桃流胶病菌的抗性降低。由于目前桃尚无转基因体系，且难以通过VIGS沉默枝条的现状，本文采用VIGS技术在毛桃叶片中沉默目的基因，发现沉默植株对桃流胶病菌的抗性增强。
主要实验过程如下：
1、PpWRKY40a基因的全长克隆
基于前期得到的RNA-seq数据，筛选出一个响应桃流胶病菌的WRKY转录因子，其编号为Prupe.1G393100。将其氨基酸序列经NCBI数据库BlastP比对分析，发现与拟南芥中WRKY40同源性较高(42.38％)，命名为PpWRKY40a。
根据在NCBI上获得序列信息通过Primer 5.0软件设计全长扩增引物，以接种桃流胶病菌的桃一年生枝条韧皮部组织为样本，EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab，Beijing)提取总RNA，Nanodrop one(Thermo，USA)和凝胶电泳对RNA浓度和质量进行检测，将合格的RNA样本利用反转录试剂盒PrimerRT Reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa,Dalian,China)进行反转录得到cDNA，最后使用Vazyme公司的Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase进行CDS片段扩增。扩增引物分别为：PpWRKY40a-Full-length-F：5’--ATGATTTCATATTGTCCTGTGGCTC--3’PpWRKY40a-Full-length-R：5’--TCACTGGTTTTGTCTGTCTGCAGAA--3’
扩增获得的产物经TSINGKE公司DNA凝胶回收试剂盒(TSINGKE)回收、Transgene公司pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体构建、TSINGKE公司测序获得序列，PpWRKY40a的全长序列为：
ATGATTTCATATTGTCCTGTGGCTCTTGAAATCTTGATGAACATGGATGATCATACCCCTTCCAAAAGAAAGGTGGATGCTCTCCAACAAGACTTGCTGCGTCTGCGAAAAGAGAATGAAGCTCTGCGATTCTTGCTTACAGCTATGACCACCAAATGCAACACACTTGAGCAGCTAATCCGAGAGAAAAACAGTGAACGAAATGATCAGTTTCCGGTTGCTCAGAAGACAACACAGTTTCTTGTGAGAACCGACTCCAAAGACAACACCCTAATTGTGAAAGATGGATATCAATGGAGGAAATACGGACAGAAGGTTACGAAAGACAACCCATCATCCCCTCGAGCTTATTTCAAGTGTTCCTTGGCTCCTCGATGTCCAGTCAAGAAGAAGGTGCAGAGATGCATGGTGGATAAGTCTCTTCTTGTGGCAACATATGAAGGACAGCACAACCATGAAGCCATCAATGGCTCACCACTTGGACAATTTTCATGTTCATCATCCACAGCTGTTCATAATAATAATATTATTATTAATCCTATTAATTTTCCTTCGCATGGTACCTCAGCAGATATTAATAATAATGATGTCATAAATATTGTTAGCCCTTCGAATTCTTCTCGGCCGGTGCCTATCACCCTTGATCTGACACTCTCGGGATCCACGAGCAATCAAGAAAATAATAGATCAGCTGGAAGCCCTCAAAACTCATCATCAAGTGCCCAGAACATCGACTGTGAAAGTAGAATTGAAGATTACGTTGCTTATTTAACCAAAGATCATAATTTCACACAAGCTTTGGCTGCTGCAGTTGCAAGCTCCATTACAAGACCTTCTGCAGACAGACAAAACCAGTGA
该序列全长858bp，电泳照片见图1，与桃基因组WRKY40比对，仅在第61位处发生了腺嘌呤到胸腺嘧啶的变异，相应的氨基酸序列在第21位发现生了苏氨酸到丝氨酸的突变，经SWISS数据库(https://swissmodel.expasy.org/)预测，本突变未对蛋白的三维结构、亲水性和膜定位性等造成改变。
2、PpWRKY40a的qRT-PCR分析
桃枝条接种的方法参考高磊(2016)。在接种后2、4、6d时间点观察枝条的发病症状；在0、6、12、24、48、72h的时间点取病斑周围0.5-1cm处的韧皮部组织，置于-80℃液氮冷冻。qRT-PCR点样和上机参数按照Yeasen公司Hieff qPCR Green Master Mix定量试剂盒操作，计算方法参考Livak and Schmittgen(2001)。序列特异性引物如下：
桃PpWRKY40a荧光定量引物序列：
PpWRKY40a-F：5’--TTTCCTTCGCATGGTACCTCA--3’
PpWRKY40a-R：5’--TGGATCCCGAGAGTGTCAGAT--3’
桃内参基因PpTEF2的引物序列(Tong et al 2009)：
PpTEF2-F：5’--AGCAAGTCACCCAACAAGCATA--3’
PpTEF2-R：5’--CCAACCAAACTCTTCAGCCAAT--3’
使用桃流胶病菌JMB-122分别离体接种桃‘春雪’和‘大红袍’一年生枝条的结果显示，桃‘春雪’和‘大红袍’对流胶病菌的敏感性有差异，敏感性：‘春雪’>‘大红袍’(图2)。使用Aidlab公司EASYspin Plus plant RNA Kit分别提取‘春雪’和‘大红袍’组织的RNA，并使用TaKaRa公司PrimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser获得反转录后的cDNA，设计特异性引物，对上述桃‘春雪’和‘大红袍’一年生枝条中的PpWRKY40a进行定量分析，结果显示，PpWRKY40a的表达水平与桃品种对流胶病菌的敏感性呈正相关(图3)。
使用4个桃流胶病菌菌株JMB-122、NP10、LHKB-111和XNHG-241分别离体接种桃‘春雪’一年生枝条。结果显示，不同桃流胶病菌的致病力有差异，致病力：JMB-122>NP10>LHKB-111>XNHG-241(图4)。同样提取RNA并反转录获得cDNA，设计特异性引物对桃‘春雪’一年生枝条中的PpWRKY40a进行定量分析，结果显示，PpWRKY40a的表达水平与桃流胶病菌的致病力呈正相关(图5)。
3、超表达载体的构建
通过Gateway载体同源重组技术，先通过Vazyme公司Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase进行两轮PCR反应给目的片段加接头，第一轮PCR的模板为含目的基因的质粒，引物序列：
attB-PpWRKY40a-F：
5’--AAAAAGCAGGCTCCATGATTTCATATTGTCCTGTGGCTC--3’
attB-PpWRKY40a-R：
5’--AGAAAGCTGGGTTTCACTGGTTTTGTCTGTCTGCAGAA--3’
第二轮PCR的模板上一轮产物，引物序列：
attB-F：5’--GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT--3’
attB-R：5’--GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT--3’
然后使用Thermo公司Gateway试剂盒进行BP反应和LP反应，将PpWRKY40a全长片段先后连接至入门载体pDONR207和终端载体pK7WG2D，完成过表达载体的构建pK7WG2D-PpWRKY40a。
将过表达载体pK7WG2D-PpWRKY40a通过热激发转入大肠杆菌DH5α，通过康为世纪公司2×Es Taq MasterMix(Dye)进行PCR阳检后测序。通过全式金生公司EASY purePlasmid MiniPrep Kit提取质粒，通过上海唯地公司试剂盒转化农杆菌EHA105。
4、番茄遗传转化及T1代植株的阳性筛选
参考欧阳波等(2003)的方法进行农杆菌介导的番茄子叶遗传转化和T0代植株的筛选。通过喷施卡纳霉素(100μg mL-1)和PCR阳检的方式筛选阳性的T1代植株。将T0代种子播种9d后，连续4d早晚在叶面喷施卡纳霉素，剔除叶片出现黄化畸形的非阳性植株，再通过艾德莱公司EASYspin Plus plant DNA Kit提取单株DNA，以载体引物进行PCR检测，结果显示阳性植株出现了预期大小的目标条带(图6)。
过表达载体pK7WG2D的引物序列：
pK7WG2D-F：5’--TTTCATTTGGAGAGGACTCC--3’
pK7WG2D-R：5’--TAACGTGACTCCCTTAATTC--3’
5、T1代转基因番茄及野生型对桃流胶病菌菌株JMB-122的抗性鉴定
以T1代转基因番茄和野生番茄对照株系的第二复叶的离体叶片为材料，参考赵丽娜(2012)的方法进行桃流胶病菌菌株JMB-122的叶片接种(便于快速发病，改为叶背面接种)。接种72h后观察发病症状，结果显示，T1代转基因株系OX#28和OX#33对桃流胶病菌菌株JMB-122的抗性显著降低，其叶片背面出现较多的侵染点，且黄化明显(图7)。
6、T1代转基因番茄中病程相关蛋白基因的qRT-PCR分析
在上述接种后24和48h的时间点取T1代转基因番茄和对照叶片接种点周围5mm的组织(去叶脉)，置于-80℃液氮冷冻，进行病程蛋白相关基因的qRT-PCR分析。结果显示，接种桃流胶病菌后，T1代转基因番茄叶片中的病程相关基因SlPR1a、SlPR2、SlPR5、SlPRNP24和SlchiE的表达均受到抑制(图8)。PpWRKY40a可能通过抑制病程相关蛋白基因的表达，使T1代转基因番茄株系对桃流胶病菌的抗性减弱。
番茄病程蛋白相关基因引物序列：
SlPR1a-F：5’--GATGTGGGACGATGAGAAGCAATG--3’
SlPR1a-R：5’--GTTGCATCGAACCCTAGCACAACCT--3’
SlPR2-F：5’--CAGATTTCACTTCCGTATGCTCTT--3’
SlPR2-R：5’--CCATCCACTCTCTGACACAACAAT--3’
SlPRNP24-F：5’--GAGGGGAACTAAGATGGCACGTAT--3’
SlPRNP24-R：5’--CTCCACCACAATCACCAGTCTGAC--3’
SlPR5-F：5’--AACTGCCCCTACACCGTTTG--3’
SlPR5-R：5’--GCCCAAAACCACCAACTCTG--3’
SlchiE-F：5’--TTTTTCGGTCAAACATCTCACG--3’
SlchiE-R：5’--ATTATCCTGTTCTGTCATCC--3’
番茄内参引物序列(刘军霞2009)：
SlActin-F：5’--ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA--3’
SlActin-R：5’--GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG--3’
7、毛桃VIGS转化及沉默效率
在PpWRKY40a的全长序列中选取100bp的特异性目标片段，目标片段的序列为：
CCTATCACCCTTGATCTGACACTCTCGGGATCCACGAGCAATCAAGAAAATAATAGATCAGCTGGAAGCCCTCAAAACTCATCATCAAGTGCCCAGAACATCGACTGTGAAAGTAGAATTGAAG
设计引物VIGS-PpWRKY40a对目标片段进行扩增，通过Thermo公司FastDigestXbal快切酶和TaKaRa公司T4 DNA Ligase将其与病毒载体pchRNA3相连，构建VIGS载体。
VIGS-PpWRKY40a片段扩增的引物序列：
VIGS-PpWRKY40a-F：
5’--GCTCTAGACCTATCACCCTTGATCTGACACTCT--3’
VIGS-PpWRKY40a-R：
5’--GCTCTAGACTTCAATTCTACTTTCACAGTCGATGT--3’
参考Cui and Wang(2017)的方法进行毛桃实生苗的VIGS瞬时转化。将VIGS-PpWRKY40a和VIGS-pchRNA1&2分别转入农杆菌GV3101感受态，阳性检测后将携带VIGS-PpWRKY40a和VIGS-pchRNA1&2的农杆菌菌液调至OD约为1.0后，按照体积比1:1混匀后将菌液注射至苗龄6-8片叶的毛桃幼苗叶片中，避光2d，以VIGS-pchRNA3和VIGS-pchRNA1&2为阳性对照。14d后对沉默株系和对照新叶进行qRT-PCR分析，结果显示，沉默毛桃株系pchRNA3:PpWRKY40a#1、pchRNA3:PpWRKY40a#3的沉默效率分别达37.18％和49.87％(图9)。
8、沉默毛桃植株对桃流胶病菌菌株JMB-122的抗性鉴定
以沉默毛桃株系和对照的离体叶片为材料，参考赵丽娜(2012)的方法进行桃流胶病菌菌株JMB-122的叶片接种(便于快速发病，改为叶背面接种)。接种24和48h后观察发病症状，结果显示，沉默毛桃株系pchRNA3:PpWRKY40a#1、pchRNA3:PpWRKY40a#3对桃流胶病菌菌株JMB-122的抗性显著增强(图10)，病斑直径显著小于对照(图11)。
9、沉默毛桃植株中病程相关基因的qRT-PCR分析
在上述接种后24h的时间点取沉默毛桃和对照叶片接种点周围5mm的组织(去叶脉)，置于-80℃液氮冷冻，进行病程蛋白相关基因的qRT-PCR分析。结果显示，沉默毛桃植株叶片中的PpSTH-2、PpPR3、PpPR4和PpchiE基因的基础表达量均显著上调表达，接种流胶病菌48h，PpPR3和PpPR4的相对表达量也显著高于对照组(图12)。沉默桃苗中PpWRKY40a，可能通过提高病程相关蛋白基因的表达，使沉默毛桃植株对流胶病菌的抗性增强。
桃病程蛋白相关基因引物：
PpSTH-2-F：5’--ACAGGAGGACCATTGGCTTG--3’
PpSTH-2-R：5’--ACGGCCATGGTATGAAGCTC--3’
PpPR3-F：5’--ACGGCTTAAACTCGCCAGAA--3’
PpPR3-R：5’--TGATGCGGGCTTGAACTAGG--3’
PpPR4-F：5’--GGTGACAAACACGGGCACAGGAG--3’
PpPR4-R：5’--AAGAAGCGATCCCACTTTGAACT--3’
PpchiE-F：5’--CGGTGCAGGAAGCTACTCTC--3’
PpchiE-R：5’--CCATCCAAAACTGCGTCACC--3’
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用
<140> 202110946806X
<141> 2021-08-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 858
<212> DNA
<213> 碧桃(Prunus persica)
<400> 1
atgatttcat attgtcctgt ggctcttgaa atcttgatga acatggatga tcatacccct 60
tccaaaagaa aggtggatgc tctccaacaa gacttgctgc gtctgcgaaa agagaatgaa 120
gctctgcgat tcttgcttac agctatgacc accaaatgca acacacttga gcagctaatc 180
cgagagaaaa acagtgaacg aaatgatcag tttccggttg ctcagaagac aacacagttt 240
cttgtgagaa ccgactccaa agacaacacc ctaattgtga aagatggata tcaatggagg 300
aaatacggac agaaggttac gaaagacaac ccatcatccc ctcgagctta tttcaagtgt 360
tccttggctc ctcgatgtcc agtcaagaag aaggtgcaga gatgcatggt ggataagtct 420
cttcttgtgg caacatatga aggacagcac aaccatgaag ccatcaatgg ctcaccactt 480
ggacaatttt catgttcatc atccacagct gttcataata ataatattat tattaatcct 540
attaattttc cttcgcatgg tacctcagca gatattaata ataatgatgt cataaatatt 600
gttagccctt cgaattcttc tcggccggtg cctatcaccc ttgatctgac actctcggga 660
tccacgagca atcaagaaaa taatagatca gctggaagcc ctcaaaactc atcatcaagt 720
gcccagaaca tcgactgtga aagtagaatt gaagattacg ttgcttattt aaccaaagat 780
cataatttca cacaagcttt ggctgctgca gttgcaagct ccattacaag accttctgca 840
gacagacaaa accagtga 858
<210> 2
<211> 124
<212> DNA
<213> 碧桃(Prunus persica)
<400> 2
cctatcaccc ttgatctgac actctcggga tccacgagca atcaagaaaa taatagatca 60
gctggaagcc ctcaaaactc atcatcaagt gcccagaaca tcgactgtga aagtagaatt 120
gaag 124
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctagacc tatcaccctt gatctgacac tct 33
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctctagact tcaattctac tttcacagtc gatgt 35

Claims (2)

1.PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用，其特征在于，所述PpWRKY40a基因的序列为SEQ ID NO ：1；应用是通过基因工程的方法沉默桃PpWRKY40a基因来提高流胶病抗性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在PpWRKY40a基因的全长序列中选取一个目标片段，设计目标片段的引物对VIGS-PpWRKY40a进行扩增，通过酶切法将目标片段与病毒载体pchRNA3相连，构建VIGS载体，将VIGS载体导入桃植株来提高桃的流胶病抗性；所述目标片段的序列为SEQ ID NO ：2，所述目标片段的引物对VIGS-PpWRKY40a序列为SEQID NO ：3和SEQ ID NO ：4。
CN202110946806.XA 2021-08-18 2021-08-18 PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用 Active CN113684217B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110946806.XA CN113684217B (zh) 2021-08-18 2021-08-18 PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110946806.XA CN113684217B (zh) 2021-08-18 2021-08-18 PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113684217A CN113684217A (zh) 2021-11-23
CN113684217B true CN113684217B (zh) 2023-10-13

Family

ID=78580685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110946806.XA Active CN113684217B (zh) 2021-08-18 2021-08-18 PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113684217B (zh)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
桃WRKY基因家族全基因组鉴定和表达分析;谷彦冰;冀志蕊;迟福梅;乔壮;徐成楠;张俊祥;周宗山;董庆龙;;遗传(第03期);摘要 *
桃转录因子PpWRKY11的克隆及表达分析;王庆杰;张泽杰;高彦刚;陈修德;肖伟;付喜玲;李玲;李冬梅;高东升;;植物生理学报(第04期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113684217A (zh) 2021-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8252979B2 (en) Manipulation of ammonium transporters (AMTS) to improve nitrogen use efficiency in higher plants
CN111118005B (zh) 一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用
WO2011127744A1 (zh) 与植物株型相关的蛋白ipa1及其编码基因与应用
CN111235165B (zh) 一种百合的易感真菌基因LrWRKY-S1及其应用
CN112175965B (zh) 增强水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的基因、蛋白及提高水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的方法
CN106754957B (zh) OsSCAMP13基因及编码蛋白与抗逆性的应用及获取方法
CN106554964B (zh) 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用
CN116555321A (zh) PpERF98基因在调控桃流胶病抗性中的应用
CN113684217B (zh) PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用
CN110862996A (zh) 一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用
CN116083445A (zh) 一种CrBZR1基因及其应用
CN113957082B (zh) 一种低温下保护水稻叶绿体发育基因tsa及其编码蛋白质和应用
CN113528540B (zh) 水稻粒型基因OsMKK3编码基因及其应用
CN106397558B (zh) 蛋白质及其编码基因在调控植物抗黄萎病性中的应用
CN112662688B (zh) 核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在油脂合成与积累中的应用
CN106434659B (zh) 大豆低温诱导型启动子、包含该启动子的重组表达载体及应用
CN112048507B (zh) 一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用
CN111690665A (zh) 一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用
CN111154794A (zh) 一种棉花GhBsr-k1基因的应用
US20140075594A1 (en) USE OF AT(n) INSERTIONS IN PROMOTER ELEMENTS FOR CONTROLLING THE EXPRESSION LEVELS OF CODING SEQUENCES IN PLANTS
CN117126880B (zh) 本氏烟NbKTI1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN110760522B (zh) Ak209基因及编码蛋白与抗逆增产的应用
WO2022213453A1 (zh) 一种调控植物抗铝性的铝离子受体alr1基因或蛋白的应用
CN110295192B (zh) 利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用
CN117925704A (zh) Stm和ath1同源基因和蛋白在烟草中的联合抑芽应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant