CN111118005B

CN111118005B - 一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用

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Publication number: CN111118005B
Application number: CN201911366075.0A
Authority: CN
Inventors: 王加峰; 陈淳; 黄明; 王慧; 刘永柱; 郭涛; 陈志强
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN111118005A

Abstract

本发明公开了一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用，属于植物基因工程技术领域。本发明miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明发明人鉴定并证实了miRNA‑T21可以通过抑制OsCYS1及OsPAO4的表达以调控半胱氨酸的合成和H₂O₂的积累，从而负调控稻瘟病抗性。结合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除miRNA‑T21，可以显著提高水稻对稻瘟病的抗性，具有较好的应用前景。

Description

一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用。

背景技术

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病，是水稻生产上的重要限制因素。根据不同的感染部位，稻瘟病可以分为叶瘟、节瘟、穗颈瘟以及谷粒瘟等，其中以叶瘟和穗颈瘟的危害最大，严重时可造成水稻严重减产甚至绝收。长期的生产实践证明，鉴定和利用广谱抗性基因进行水稻抗病育种成为了防治稻瘟病最为经济有效的策略。目前已有超过100个稻瘟病完全抗性位点被定位，24个主要抗稻瘟病基因被克隆。它们主要分布在除3号染色体外的其它11条染色体上。其中，第6号、第11号和第12号染色体分别存在一个很大的抗病基因簇。

结合分子标记辅助选择(MAS)技术，大量抗病新品种被选育成功，但这些仍不能彻底解决稻瘟病对水稻的严重威胁，旧的问题与新的挑战并存。首先，从抗病机理上来看，水稻-稻瘟病菌互作机理的认识仍不十分明确，极大了限制了育种工作的进程。其次，单一抗病基因的频繁应用，会加速优势生理小种的进化，造成育成品种抗性逐年递减，3-5年后抗性即会消失，带来品种推广使用难以持久的问题。因此急需发现新的优异抗病资源或者将近些年的新方法新技术用于抗病育种工作中，为抗病育种拓展新的研究方向。

MicroRNA(miRNA，微小RNA)是一类长度约20-24个核苷酸(nucleotide，nt)的内源单链非编码小分子RNA，它通过与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，以碱基互补配对方式切割靶基因mRNA、抑制mRNA的翻译或介导靶基因DNA甲基化来调控基因的表达(Zhang et al.，2006；Boosani et al.，2015)。近年来研究发现miRNA作为一个重要的调控因子，广泛参与植物的抗病防御反应过程，它们可能通过抑制或激活某些靶基因的表达以调节植物信号传导途径、激活抗病途径相关转录因子及调控植物体内的各种代谢途径等方式来参与植物抗病反应途径(Li et al.，2010；Li et al.，2014；Gupta et al.，2014；Wu et al.，2015；Zhang et al.，2015；Li et al.，2017；Wu et al.，2017)。

miRNA的调控与各个层级的抗病反应途径具有重要关系，如miRNA能够调控某些抗病途径中的关键靶基因来抵御病菌的入侵。王兴军等发明的“利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA”(中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病毒的方法及其专用双链RNA，我们也在前期公开了“一种稻瘟病抗性相关的miRNA及其应用”(中国专利201711155567.6)，该miRNA主要靶向负调控抗病基因Pik-H4来调控抗病性，这些研究表明miRNA可用于增强植物抗病性。

因此，进一步克隆与分析稻瘟病抗病反应相关的miRNA不仅在不同分子水平上丰富植物抗病机理，还可通过利用miRNA来指导抗病育种，为解决作物抗病性提供新思路，具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种与稻瘟病抗性相关的miRNA。它通过抑制靶基因OsPAO4及OsCYS1的表达以调控H₂O₂的积累和半胱氨酸的合成从而负调控稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供上述与稻瘟病抗性相关的miRNA的应用。敲除及靶模拟该miRNA能显著增强稻瘟病抗性，可结合CRISPR/Cas9基因编辑技术对miRNA进行定点编辑以提高水稻的稻瘟病抗性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种与稻瘟病抗性相关的miRNA，其核苷酸序列如下所示：

GGAGGGAGAGGAAGAAGAUGGGC。

编码上述与稻瘟病抗性相关的miRNA的基因，其核苷酸序列如下所示：

GGAGGGAGAGGAAGAAGATGGGC。

上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体，其核苷酸序列如下所示：

ACAAAAGUGAGGAGGGAGAGGAAGAAGAUGGGCGAUGACAAGAAGGUUAUAGUAGUAUAUCGACUUUGCUUCUUCUUUUUUUUUUCAGUUUCUA。

编码上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体的基因，其核苷酸序列如下所示：

ACAAAAGTGAGGAGGGAGAGGAAGAAGATGGGCGATGACAAGAAGGTTATAGTAGTATATCGACTTTGCTTCTTCTTTTTTTTTTCAGTTTCTA。

上述与稻瘟病抗性相关的miRNA和/或其相应的前体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

上述与稻瘟病抗性相关的miRNA和/或其相应的前体在培育抗稻瘟病水稻中的应用。

所述的应用，是利用基因工程技术，通过抑制所述的miRNA在水稻中的表达，从而提高水稻对稻瘟病的抗性。

所述的基因工程技术优选为CRISPR/Cas9技术。

一种利用CRISPR/Cas9技术培育抗稻瘟病水稻的方法，包括如下步骤：合成上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应前体的敲除序列，将其构建到载体上得到敲除载体，采用农杆菌介导转化水稻，从而得到抗稻瘟病水稻；具体包括如下步骤：

(1)根据上述与稻瘟病抗性相关的miRNA和其相应的前体的序列设计两个靶点，根据靶点序列分别合成接头引物U3和U6a；

(2)将引物U3和U6a的正反向接头引物退火形成双链，然后分别连接到Bsa I酶切后的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA质粒片段上，并分别利用引物B1’/B2、B2’/BL进行扩增；

(3)将扩增产物用Bsa I酶切，将酶切片段纯化后连接到Bsa I酶切后的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上，即构建成靶向所述的miRNA的敲除载体。

(4)将步骤(3)得到的敲除载体转化水稻愈伤组织，经诱导获得再生苗，筛选得到阳性植株。

步骤(1)中所述的引物U3的正向接头引物、反向接头引物序列分别如下所示：

U3F：GGCAGGAATATACAAAAGTGAGGA；

U3R：AAACTCCTCACTTTTGTATATTCC；

步骤(1)中所述的引物U6a的正向接头引物、反向接头引物序列分别如下所示：

U6aF：GCCGCATAGGACTATCGACCAAAG；

U6aR：AAACCTTTGGTCGATAGTCCTATG。

步骤(2)中所述的引物B1’/B2、B2’/BL分别如下所示：

B1’:TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG；

B2:AGCGTGGGTCTCGTCAGGGT CCATCCACTCCAAGCTC；

B2’:TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCA GCAAAGG；

BL:AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC。

步骤(4)中所述的农杆菌优选为根癌农杆菌EHA105。

本发明发明人前期对高抗稻瘟病水稻材料H4及感稻瘟病品种中二软占接种稻瘟病菌GD0193，通过构建small RNA测序文库鉴定到多个受稻瘟病菌胁迫诱导表达的新miRNA，这些miRNA靶基因涉及到转录因子、蛋白激酶及植物激素等多种与抗病相关的防卫基因，进一步的降解组测序证实部分miRNA(如miRNA-T21)可能特异的负调控一些抗病相关靶基因的表达。

进一步的降解组测序表明，其中的一个新miRNA(miRNA-T21)可能靶向调节一些稻瘟病抗性调节的相关基因。

经Northern Blot表达验证证实，miRNA-T21真实存在于抗感病水稻叶片中。miRNA-T21受稻瘟病菌调控，表达量呈现先上升后下降趋势。组织特异性表达分析表明，miRNA-T21主要在芽鞘、叶片中表达。

靶基因预测表明该miRNA-T21可能分别靶向半胱氨酸合成酶基因OsCYS1及多胺氧化酶基因OsPAO4的mRNA。通过GFP-烟草瞬时表达系统证实miRNA-T21可以直接分别裂解OsCYS1及OsPAO4的mRNA，从而负调控稻瘟病抗性。

在水稻中过表达miRNA-T21或敲除miRNA-T21后的转基因植株的抗病性检测结果表明，过表达miRNA-T21会增加水稻对稻瘟病菌的敏感性，而敲除及靶模拟miRNA-T21增强了稻瘟病抗性，推测miRNA-T21通过抑制OsCYS1及OsPAO4的表达以调控半胱氨酸的合成和H₂O₂的积累从而负调控稻瘟病抗性。

深入探究miRNA-T21及其靶基因的分子机制具有重要的理论与应用价值。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明发明人鉴定并证实了miRNA-T21可以负调控稻瘟病抗性，结合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除miRNA-T21，可以显著提高水稻对稻瘟病的抗性，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为Northern blot检测miRNA-T21表达的结果图。

图2为实时荧光定量PCR结果分析图；其中，A为miRNA-T21的表达模式，B为靶基因OsCYS1的表达模式，C为靶基因OsPAO4的表达模式。

图3为GFP-烟草瞬时表达验证结果图；其中，A为单独注射GFP-OsPAO4，B为注射GFP-OsPAO4和过表达载体OX-miRNA-T21，C为单独注射GFP-OsCYS1，D为注射GFP-OsCYS1和过表达载体OX-miRNA-T21。

图4为转基因材料的抗病性测定结果图；其中，A为野生型植株，B为过表达miRNA-T21(OX-miRNA-T21)植株，C为敲除miRNA-T21(KO-miRNA-T21)植株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所使用的各种原料及各项设备，如无特别说明，均为常规市售产品，能够通过市场购买直接获得。

本发明实施例所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。

实施例1 Northern blot检测miRNA-T21的表达

1.水稻叶片总RNA的提取

1)取水稻高抗稻瘟病株系H4及感病品种中二软占(水稻高抗稻瘟病株系H4、感病品种中二软占均已在文献“水稻抗稻瘟病蛋白Pik₂-H4基因的克隆及互作蛋白的筛选[J].广东农业科学,2014,(04):156-160.”中公开)3-4叶期水稻幼苗，液氮冷冻并研磨成粉状，转入1.5mL离心管，按照每100mg叶片加入1mL提取试剂的比例加入Trizol试剂(Invitrogen公司)，混合均匀；

2)按照每100mg叶片加入200μL氯仿的比例加入氯仿，混合均匀，13,000rpm、4℃离心15min，弃去中间层及下层有机相，收集上层水相转到新的离心管内；

3)加入600μL异丙醇，混合均匀，室温静置20min，13,000rpm、4℃离心20min，收集沉淀，待异丙醇挥发后溶于无RNA酶的超纯水中，-80℃冻存备用。

2.生物素介导的Northern blot分析

Northern blot实验参考文献“沈建强.水稻逆境应答小RNA筛选与3'非翻译区微小反向重复序列抑制翻译研究[D].2017.”中的方法。首先根据miRNA-T21成熟序列(SEQ IDNO:1)设计探针5’-GCCCATCTTCTTCCTCTCCCTCC-3’(SEQ ID NO:5)，并在序列3′端加上生物素标记(由赛默飞世尔科技公司合成)。然后取100～500μg步骤1.得到的总RNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转尼龙膜3h后，将膜置于紫外交联仪中1200J交联2min，然后将尼龙膜转至杂交炉中50℃预杂交30min以将RNA固定于尼龙膜上。利用探针对尼龙膜进行预杂交与杂交、洗膜，最后利用碧云天生物技术的化学发光法生物素检测试剂盒检测miRNA-T21的表达情况。结果如图1所示。

结果表明，miRNA-T21在中二软占及H4植株中均能正确表达，表明该miRNA真实存在于中二软占及H4植株中。

实施例2实时荧光定量PCR分析miRNA-T21在稻瘟病抗性中的作用

1.RNA反转录及实时定量PCR的引物设计

根据miRNA-T21序列预测的前体序列(SEQ ID NO:2)设计Stem-loop引物，如下：

(1)RT引物序列(SEQ ID NO:6)

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCCATCT-3’

(2)miRNA-T21正向引物(SEQ ID NO:7)

5’-GGAGGGAGAGGAAGAAGATGGGC-3’

根据靶基因的编码序列(OsCYS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，OsPAO4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)，设计以下靶基因的qRT-PCR检测引物：

(3)OsCYS1正向引物(SEQ ID NO:10)

5’-ACGTAACCCTTGACCATGCA-3’

(4)OsCYS1反向引物(SEQ ID NO:11)

5’-AATCATAGGGACCGACGGGA-3’

(5)OsPAO4正向引物(SEQ ID NO:12)

5’-ACGCCACTGAACCTACGAAG-3’

(6)OsPAO4反向引物(SEQ ID NO:13)

5’-CGGCGAAGTAGAGGTTCTCC-3’

内参基因的qRT-PCR检测引物：

(7)U6正向引物(SEQ ID NO:14)

5’-TACAGATAAGATTAGCATGGCCCC-3’

(8)U6反向引物(SEQ ID NO:15)

5’-GGACCATTTCTCGATTTGTACGTG-3’

2.材料培养及稻瘟病菌侵染

试验感病水稻品种中二软占及经过空间搭载诱变的中二软占的突变体H4株系。H4对稻瘟病有较高抗性，已在文献“水稻抗稻瘟病蛋白Pik2-H4基因的克隆及互作蛋白的筛选[J].广东农业科学，2004，(04):156-160”中公开。

温室种植中二软占与H4到三叶期，采用高压喷雾法把稻瘟病菌GD0193(已在文献“肖武名,孙大元,张景欣等.3个空间诱变水稻品系的稻瘟病抗性评价及抗性遗传分析[J].华南农业大学学报,2012(3).”中公开)孢子的明胶溶液均匀喷施在叶片表面(分生孢子浓度为5×10⁵/mL)，接种苗于25℃暗室中保湿24h后，放荫棚下继续保湿，7d后调查发病情况并拍照。

3.水稻总RNA的提取

同实施例1。

4.反转录及反转录体系

普通反转录：取-80℃保存的总RNA样品1μg，加入1μL Oligo(dT₁₆)(10mmol/L)，用RNase free H₂O补到总体积12μL，混匀置于65℃水浴锅中水浴5min后，立即置于冰上，并向管中加入4μL 5×RT buffer，2μL dNTP(10mmol/L)，RNase抑制剂1μL(10U/μL)和1μLReverTra Ace并混匀。将管置于PCR仪中，设置反应程序：30℃10min，42℃60min，99℃5min，25℃5min，得到第一链的单cDNA，于-20℃冰箱保存。

miRNA的反转录：取0.5μg DNase处理过的RNA，加入1.5μL引物混合液(0.25μL RT引物(10mmol/L)、0.25μL dNTP(10mmol/L)和1μL DEPC)。然后稍离心，65℃孵育5min，立即置于冰上3min。将1μL 5×First strand buffer，0.5μL 0.1mol/L DTT，0.15μL RRI以及0.15μL Superscript III配制成混合液，每管中加入1.8μL混合液。离心后，放置于PCR仪上，设置反应程序：16℃30min，50℃30min，85℃5min，25℃1min，将反转录产物置于-20℃备用。

5.实时荧光定量PCR及结果分析

(1)实时定量PCR反应体系

选用诺唯赞公司的定量试剂对miRNA进行定量，反应体系如下：10μL AceQ qPCRSYBR Green Master Mix，各0.8μL 10μmol/L上下游引物(检测miRNA-T21时用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物序列；检测OsCYS1时用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物序列；检测OsPAO4时用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的引物序列)，0.4μL ROXReference Dye1，0.2μL cDNA(miRNA反转录产物)，无菌水补足至20μL，进行定量检测。定量PCR仪设置反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。以U6作为内参基因，所有反应均为三次重复。

(2)结果分析

利用2^-ΔΔCt方法进行结果的分析，结果如图2所示。实时荧光定量PCR分析的结果显示，miRNA-T21的表达受到稻瘟病菌的调节，稻瘟病菌侵染后miRNA-T21的表达量呈先上升后下降趋势，而其靶基因OsCYS1及OsPAO4表达量在稻瘟病菌侵染后则呈先下降后上升的趋势，两者呈负相关性。这表明miRNA-T21有可能通过对靶基因OsCYS1及OsPAO4的调控来调控稻瘟病抗性。

实施例3miRNA-T21的靶基因验证

1.靶基因-GFP融合蛋白表达载体的构建

将靶基因中包含miRNA-T21识别区域在内的200bp左右作为目标区段，通过重组克隆方式克隆至GFP表达系统载体骨架p35S-GFP(已在文献“Wei J et al.A novel Co-immunoprec ipitation protocol based on protoplast transient gene expressionfor studying protein–protein i nteractions in rice[J].Plant Mol Biol Rep,2013”中公开)。具体的操作为：

在p35S-GFP中，选择BamH I和Sal I两个酶切位点酶切p35S-GFP载体，通过琼脂糖胶回收纯化备用；

根据酶切位点设计重组克隆引物，利用实施例2普通反转录的cDNA为模板进行靶基因的目标区段的扩增(PCR反应体系为20μL：2μL 10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μmol/L)，dNTP0.3μL(10mmol/L)，0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL模板，双蒸水补足至20μL。扩增反应PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min)。经琼脂糖胶回收纯化。其中：

扩增用到的引物为：

(1)GFP-OsCYS1正向引物(SEQ ID NO:16)

5’-GACGAGCTGTACAAGGGATCCAGGGAGAGCCAGAGTGGAGG-3’

(2)GFP-OsCYS1反向引物(SEQ ID NO:17)

5’-AATTCGAGCTGGTCAGAGCTCACCAAGCTCAACAGATCCGGA-3’

(3)GFP-OsPAO4正向引物(SEQ ID NO:18)

5’-GACGAGCTGTACAAGGGATCCCTCCTGTAAGCGGAGTTCCTC-3’

(4)GFP-OsPAO4反向引物(SEQ ID NO:19)

5’-AATTCGAGCTGGTCAGAGCTCAACGAAGCATTGGAGAGAGCA-3’。

随后通过同源重组反应，利用BamH I和Sal I将靶基因的目标片段连接至p35S-GFP中，连接反应体系：1μl Exnase Ⅱ、2μl 5×CEⅡ Buffer、10-100ng靶基因的目标片段、25-100ng p35S-GFP；反应条件：37℃水浴30min，转化大肠杆菌DH5a后进行检测，然后将测序验证成功的克隆载体利用电激法转化至根癌农杆菌EHA105中，-80℃超低温冰箱中保存甘油菌备用。

2.本生烟草的种植、农杆菌介导的瞬时转化与荧光分析

本生烟(已在文献“Zhang T,Zheng Q F,Yi X et al.Establishing RNA virusresistance in plants by harnessing CRISPR immune system.Plant Biotechnol J,2018,16(8):1415-1423”中公开)种子播种后，25℃光照/黑暗各12h培养至5-6叶。

参考文献“陈香嵩,李甜甜,周少立,赵毓.(2018).外源蛋白在烟草叶片瞬时表达.Bio-101:e1010127.DOI:10.21769/BioProtoc.1010127.”中的方法进行农杆菌注射，具体操作为：

1)将转化有GFP-靶基因融合蛋白表达载体的农杆菌在加有20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的培养皿上划线接种，28℃黑暗培养2-3d；

2)挑取单菌落接种到5mL含有相应抗生素的LB培养液中，28℃、250rpm培养24h；

3)随后将菌液按50-100倍稀释于含有0.4mmol/L AS(乙酰丁香酮)、10mmol/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)以及相应抗生素的LB培养液中28℃、250rpm培养；

4)当菌液的OD₆₀₀值到达0.8-1.0后，4,000rpm常温离心10min收集菌体，用10mmol/L的MgCl₂溶液将菌体的OD₆₀₀值调至1.0，以每毫升菌液加入2μL的比例加入100mmol/L AS，静置3h以上；

5)取5-6叶期的烟草，用1mL注射器吸取菌液，将菌液从叶片背面缓慢渗透进入表皮细胞，注射后正常培养(25℃光照/黑暗各12h)。

3-4d后剪取注射部位周围的叶片，背面朝上，在荧光显微镜下观察目标蛋白的表达情况。结果如图3所示。结果表明，GFP-OsCYS1与GFP-OsPAO4在单独注射烟草时，可以发出很强的绿色荧光，但当其与miRNA-T21的过表达载体OX-miRNA-T21(具体制备方法参考实施例4)共同注射后，其绿色荧光的发光强度明显减弱甚至消失，证实了miRNA-T21能抑制其靶基因对应的GFP-靶基因融合蛋白的表达。

实施例4过表达miRNA-T21、敲除miRNA-T21的转基因水稻的构建

利用pOX(已在文献“李超.水稻SDG711和SDG723的克隆与功能分析[D].2012.”中公开)为过量表达载体，以UBI启动子驱动miRNA-T21的过表达；利用CRISPR/Cas9技术进行miRNA-T21的敲除。具体如下：

1.miRNA-T21的过表达载体的构建

利用实施例2普通反转录的cDNA为模板扩增(具体条件参考实施例3)得到miRNA-T21前体序列片段，所需引物如下：

正向引物Pre-miRNA-T21 F(SEQ ID NO:20)：

5’-CCAAGCTTGGTAGACAACTCCTATAACCACC-3’；

反向引物Pre-miRNA-T21 R(SEQ ID NO:21)：

5’-CGGGATCCCTTAGAGTCAGGGTGGTTGTGT-3’。

利用Hind III与BamHI将该片段连接到pOX载体上，将得到的克隆载体转化大肠杆菌菌种DH5α，经过菌落PCR及后续测序鉴定，获得OX-miRNA-T21载体。

2.miRNA-T21敲除载体构建

敲除载体的构建参照文献“Ma X L,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 s ystem for convenient,high-efficiency multiplex genome editing inmonocot and dicotplants.Mol Plant,2015,8:1274–1284”记载的方法)。首先根据miRNA-T21成熟序列及其前体在C RISPR/Cas9在线靶点设计网站：http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/设计两个gRNA靶点(5’-GGAATATACAAAAGTGAGGA-3’与5’-CATAGGACTATCGACCAAAG-3’)，根据靶点设计引物。所需引物如下：

正向引物U3F(SEQ ID NO:22)：

5’-GGCAGGAATATACAAAAGTGAGGA-3’，

反向引物U3R(SEQ ID NO:23)：

5’-AAACTCCTCACTTTTGTATATTCC-3’，

正向引物U6aF(SEQ ID NO:24)：

5’-GCCGCATAGGACTATCGACCAAAG-3’，

反向引物U6aR(SEQ ID NO:25)：

5’-AAACCTTTGGTCGATAGTCCTATG-3’。

进行以下实验：(1)制备双链接头：分别取等量每个靶点的1对gRNA寡核苷酸链的上游引物与下游引物混合(终浓度1μmol/L)，95℃处理30s，然后移至室温冷却完成退火；

(2)酶切：取pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA质粒(以上质粒均在文献“Ma XL,ZhangQ,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicotplants.Mol Plant,2015,8:1274–1284”中公开)各1μg，制备20μL反应体系，用5-10U Bsa I(NEB)酶切20min，70℃处理10min使酶失活；

(3)连接和PCR扩增：分别将酶切过的pYL-U3-gRNA及pYL-U6a-gRNA质粒与各自所对应双链接头连接，然后分别利用引物B1’/B2、B2’/BL对gDNA(gRNA对应的DNA序列)进行扩增，先95℃1min，然后按95℃15s、60℃15s和68℃30s进行30个循环的反应；所用引物序列如下：

B1’:5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；

B2:5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGT CCATCCACTCCAAGCTC-3’；

B2’:5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCA GCAAAGG-3’；

BL:5’-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’。

(4)产物纯化、酶切和连接：将所有靶点gDNA PCR产物回收混合后用20U Bsa I在37℃酶切30min，然后75℃处理5min；将酶切片段纯化后与Bsa I酶切回收的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体(在文献“Ma X L,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 systemfor con venient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot anddicotplants.Mol Plant,2015,8:1274–1284”中公开)片段利用T4 DNA ligase(NEB)20℃连接2h；

(5)转化及质粒测序：连接产物转化DH5a感受态细胞后，挑取单克隆接种培养，抽提质粒后利用Asc I进行酶切鉴定，并挑取酶切(AscI)验证正确的克隆送Thermo FisherScientific公司测序，获得KO-miRNA-T21载体。

3.转基因水稻的构建

将OX-miRNA-T21载体、KO-miRNA-T21载体分别通过电激法转化根癌农杆菌EHA105，参考文献“Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Efficient transformationof rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries of the T-D NA.Plant J,1994,6:271-282”中的方法，用籼稻品系H4、中二软占的成熟种子诱导愈伤组织，21d后将愈伤进行继代；10d继代一次，继代培养2d后挑选状态良好的胚性愈伤组织用于载体的根癌农杆菌EHA105侵染；共培养3d后进入抗性愈伤组织筛选，利用50mg/L潮霉素培养基筛选，每隔2周筛选一次；挑选状态良好的抗性愈伤组织进行2周的预分化培养，再进行2周的分化培养，并将分化苗移至生根培养基中，获得转基因植株。经潮霉素基因HPT的PCR检测(所用引物为HygR-F/HygR-R)，并对miRNA-T21前体基因进行PCR检测(所用引物为T21-F/T21-R)，获得过表达miRNA-T21或者敲除miRNA-T21的转基因阳性植株。所用的引物序列如下：

HygR-F：5’-AAGATGTTGGCGACCTCGTATT-3’

HygR-R：5’-CGTGCTTTCAGCTTCGATGTAG-3’

T21-F：5’-ACAAAAGTGAGGAGGGAGAGGA-3’

T21-R：5’-TAGAAACTGAAAAAAAAAAGAAGAAGC-3’。

实施例5过表达miRNA-T21、敲除miRNA-T21的转基因水稻的抗病性分析

对转基因后代阳性植株进行抗病性检测，接种方法参照实施例2。8d后统计结果，结果如图4所示。

结果表明，接种稻瘟病菌后，miRNA-T21过表达转基因植株病斑增多，抗病性明显降低，而miRNA-T21敲除植株抗并未见明显侵染病斑，抗性明显增强。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA-T21序列

<400> 1

ggagggagag gaagaagaug ggc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA-T21序列

<400> 2

ggagggagag gaagaagatg ggc 23

<210> 3

<211> 94

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA-T21前体序列

<400> 3

acaaaaguga ggagggagag gaagaagaug ggcgaugaca agaagguuau aguaguauau 60

cgacuuugcu ucuucuuuuu uuuuucaguu ucua 94

<210> 4

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA-T21前体序列

<400> 4

acaaaagtga ggagggagag gaagaagatg ggcgatgaca agaaggttat agtagtatat 60

cgactttgct tcttcttttt tttttcagtt tcta 94

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 探针序列

<400> 5

gcccatcttc ttcctctccc tcc 23

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Stem-loop RT引物序列

<400> 6

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcccat ct 52

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Stem-loop miRNA-T21正向引物

<400> 7

ggagggagag gaagaagatg ggc 23

<210> 8

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCYC1基因序列

<400> 8

atggagctgg aggcggcggc ggtggcgttc tttccagcgg cggacggcag tagcagcagc 60

cagcggcgag ctccatgggg aaggactttg ctcctccacc cccattttct tgctctccct 120

ctctctaatc cagatccaga gccggtgggg aagttggatg tgaaagatcc aggatctccg 180

gatctgttga gcttggtggc ggcagtgaca acggcaacgt ctcagacacg ccatccttcc 240

cgagcatgca ccggcgatgt gcaggagact gaggtcaaag cggatcttcc ccggctccat 300

ttgaccttga ggggtagcaa ccggcaatag 330

<210> 9

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAO4基因序列

<400> 9

atggatccca atagcctcaa aactggaggc ctcttgcttc cgaccattga gaggcaatgt 60

gcttcgcctc catccgtcat cgtgatcggt gggggaattt caggggttgc agcagcccgt 120

gctctctcca atgcttcgtt tgaggtgact gttttggagt ccagagatcg cgtaggcggt 180

cgtgtccata ccgattactc tttcggatgc ccaattgata tgggagcctc atggctccac 240

ggcgtttgta atgagaactc cttggcacca ttgattggct atcttgggct gaaattatat 300

cgcactagtg gcgacaactc tgttctgtat gatcatgatt tagaaagtta tgcactcttt 360

gataaggctg gccatcaggt ctcaaaggag acagttgcta aagttgaaga aacatttgaa 420

agaattcttg atgagacagt taaagtgcgt gatgagcagg aacatgacat gccccttcta 480

caggcgattt cacttgttct tgagaggcac ccccatctga agttacaagg gatagatgat 540

caagtcttgc aatggtgtgt ctgtcggctt gaggcatggt ttgctgcaga tgctgatgaa 600

atatctctga aaaactggga tcaggagcat gttcttaccg gtggccatgg tctgatggtg 660

aacggatact atcctataat tcaggctctt gcacaaggtc tagatatccg gcttaatcaa 720

agggtaacca aaattgcccg ccaattcaat ggagtgacag ttaccactga agatggaaca 780

agttactctg ccgatgcttg catcattaca gtaccgctcg gtgtgctcaa ggcaaacata 840

atcaagttcg agcctgagtt gccctcatgg aagagctctg caatcgcaga ccttggtgtc 900

ggtatcgaga acaagatcgc catgcacttc gatacagtct tctggcctaa tgttgaggtg 960

ctgggaatgg ttggcccaac gcctaaagca tgtgggtact tcctgaacct ccacaaggcc 1020

accggcaatc cggtcctcgt ctacatggcc gccggtagat ttgctcaaga agtggaaaaa 1080

ctgtcagaca aggaggccgt tgatctggtc atgtctcacc tgaagaaaat gctacctgac 1140

gccactgaac ctacgaagta tttggtttca cgctggggtt ctgacccgaa ctcgctgggt 1200

tcctactcgt gcgacctggt cgggaagccg gccgacgtgt cggcgcggtt cgccgcaccg 1260

gtggagaacc tctacttcgc cggcgaggcg gccagcgccg accactcggg gtccgtccac 1320

ggcgcctact cgtcggggat cgccgccgcc gatgagtgcc ggaagcgcat cctgatgcag 1380

aagggcatcc ctgacctcgt ccaggtcaag gcctacgagg agatggccgg agtcattgct 1440

ccccttcaga tttgcaggac ctga 1464

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCYS1正向引物

<400> 10

acgtaaccct tgaccatgca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCYS1反向引物

<400> 11

aatcataggg accgacggga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAO4正向引物

<400> 12

acgccactga acctacgaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAO4反向引物

<400> 13

cggcgaagta gaggttctcc 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6正向引物

<400> 14

tacagataag attagcatgg cccc 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6反向引物

<400> 15

ggaccatttc tcgatttgta cgtg 24

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP-OsCYS1正向引物

<400> 16

gacgagctgt acaagggatc cagggagagc cagagtggag g 41

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP-OsCYS1反向引物

<400> 17

aattcgagct ggtcagagct caccaagctc aacagatccg ga 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP-OsPAO4正向引物

<400> 18

gacgagctgt acaagggatc cctcctgtaa gcggagttcc tc 42

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP-OsPAO4反向引物

<400> 19

aattcgagct ggtcagagct caacgaagca ttggagagag ca 42

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Pre-miRNA-T21 F

<400> 20

ccaagcttgg tagacaactc ctataaccac c 31

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Pre-miRNA-T21 R

<400> 21

cgggatccct tagagtcagg gtggttgtgt 30

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U3F

<400> 22

ggcaggaata tacaaaagtg agga 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U3R

<400> 23

aaactcctca cttttgtata ttcc 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6aF

<400> 24

gccgcatagg actatcgacc aaag 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6aR

<400> 25

aaacctttgg tcgatagtcc tatg 24

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B1’

<400> 26

ttcagaggtc tctctcgcac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B2

<400> 27

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B2’

<400> 28

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BL

<400> 29

agcgtgggtc tcgaccgggt ccatccactc caagctc 37

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HygR-F

<400> 30

aagatgttgg cgacctcgta tt 22

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HygR-R

<400> 31

cgtgctttca gcttcgatgt ag 22

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T21-F

<400> 32

acaaaagtga ggagggagag ga 22

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T21-R

<400> 33

tagaaactga aaaaaaaaag aagaagc 27

Claims

1.一种与稻瘟病抗性相关的miRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.编码权利要求3所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.抑制权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA和/或其相应的前体的表达的试剂在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：利用基因工程技术，通过抑制所述的miRNA在水稻中的表达，从而提高水稻对稻瘟病的抗性。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的基因工程技术为CRISPR/Cas9技术。

8.一种利用CRISPR/Cas9技术培育抗稻瘟病水稻的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）根据权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA和权利要求3所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体的序列设计两个靶点，根据靶点序列分别合成接头引物U3和U6a；

（2）将引物U3和U6a的正反向接头引物退火形成双链，然后分别连接到Bsa I酶切后的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA质粒片段上，并分别利用引物B1’/B2 、B2’/BL进行扩增；

（3）将扩增产物用Bsa I酶切，将酶切片段纯化后连接到Bsa I酶切后的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上，即构建成靶向所述的miRNA的敲除载体；

（4）将步骤（3）得到的敲除载体转化水稻愈伤组织，经诱导获得再生苗，筛选得到阳性植株；

步骤（1）中所述的引物U3的正向接头引物、反向接头引物序列分别如SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:23所示；

步骤（1）中所述的引物U6a的正向接头引物、反向接头引物序列分别如SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:25所示；

步骤（2）中所述的引物B1’/B2、B2’/BL序列分别如SEQ ID NO:26～SEQ ID NO:29所示。