CN110551736B

CN110551736B - 一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因及其应用

Info

Publication number: CN110551736B
Application number: CN201910947929.8A
Authority: CN
Inventors: 宣磊; 王芝权; 杨颖�; 华建峰; 於朝广; 裴笑笑; 殷云龙; 薛建辉
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110551736A

Abstract

本发明公开了一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述的ThHAM1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过构建基因GbF3′H1载体转化山杨新，与对照植株相比，ThHAM1基因在山新杨中高效表达，并伴随着表型出现变异，植株生长速度减慢，以根部最为明显，不定根数量减少，长度变短，目的基因的表达量上升200‑500倍，说明ThHAM1基因是调控植物根发育和影响植物形态的重要基因，在林木基因工程领域有重要的应用价值，可以用于调整植物生长发育速度或植物形态。

Description

一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因及其应用

背景技术

根是植物长期适应陆地生境而形成的一个重要器官，是土壤与植物地上部分之间物质交换的桥梁，是植物繁荣和抵抗逆境的基础。生根性状在林木遗传改良中占有重要地位，研究林木不定根发育的分子机理不仅有理论意义，而且有潜在应用价值。近些年来，国内外研究者已从不同植物的不定根中分离出一批功能基因，它们参与物质运输、信号传导、细胞分裂等一系列生理生化活动，彼此间相互协调，在各自的通路和途径中有序地调控着不定根的发育，其中GRAS转录因子家族的HAM基因被科学家广泛关注，因为HAM基因和植物顶端分生组织密切相关。研究表明，在矮牵牛的HAM基因缺失突变体ham中，顶端分生组织发生分化形成一层毛簇状的皮层组织，同时出现开花提前、花数量减少等症状，同时根的生长明显增强；烟草打顶处理后，HAM亚家族基因NtGRASR1的表达量明显降低，而根的生长得到促进，表明NtGRAS-R1负调控根的生长发育。然而林木中，除了木本模式植物杨树外，其他木本植物未见报道。

中山杉是江苏省中国科学院植物研究所从落羽杉×墨杉杂交组合中选育出来的优良无性系。其杂种优势明显，生长迅速、抗逆性强、成材率好、观赏性高。已广泛运用于湿地生态修复、沿海防护林建设和盐碱地绿化造林，以及城乡绿化和农田林网等方面。但在中山杉无性系长期选育过程中发现，不同无性系间生根能力差异显著，且随着无性系生理年龄的增长，早期选育出的无性系生根力出现衰退现象，即使不断优化扦插技术，成效也不明显，因而必须通过分子手段对其生根机理进行深入研究才能较好的解决这个问题。

综上可知：HAM基因对于植物根部发育方面发挥着重要的作用，而在中山杉中尚未有相关报道，深入研究HAM基因对于中山杉不定根发育的调控，对于进一步改良中山杉乃至落羽杉属植物的生根性状具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种调控中山杉根生长发育的ThHAM1基因。本发明所要解决的另一技术问题是提供上述调控中山杉根生长发育的ThHAM1基因的应用。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的与中山杉根发育相关的ThHAM1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

所述的与中山杉根发育相关的ThHAM1基因的载体。

优选地，所述载体为pH35GS-ThHAM1。

优选地，所述的载体中启动ThHAM1基因的启动子为P35S。

所述的与中山杉根发育相关的ThHAM1基因或所述的载体在调整植物生长发育速度或植物形态中的应用。

优选地，所述的应用，包括以下步骤：(1)构建所述的载体；(2)将所构建的载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到生长发育速度变慢或形态变异的植物。

有益效果：与现有技术相比，本发明以中山杉植株为材料，通过RACE技术克隆了中山杉根发育相关的ThHAM1基因。同时，采用通路克隆技术构建其过量表达载体pH35GS-ThHAM1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，ThHAM1在转化的山新杨中高效表达，表达量呈200-500倍上升。过量表达ThHAM1的转基因山新杨，植株表型出现变异，生长速度减慢，尤其以根部最为明显，不定根数量减少，长度变短。说明ThHAM1基因是调控植物根发育和影响植物形态的重要基因，在林木基因工程领域有重要的应用价值。

附图说明

图1是过量表达ThHAM1转基因杨树与未转基因杨树整体表型对比图，图A中左为转基因杨树，图中右为未转基因杨树；图B中左为转基因杨树的根，图中右为未转基因杨树的根；

图2是过表达ThHAM1转基因植株中基因在不同组织中的表达量变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进-步的说明。

以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

实施例1：通过RACE技术克隆ThHAM1基因

1)RNA的提取及cDNA的反转

以中山杉406(Taxodiummucronatum♀×T.distichum♂)(T.hybrid‘Zhongshanshan 406’)植株为材料，使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)中山杉总RNA的提取。在进行提取RNA操作前，所有的枪头，离心管，研钵均应用0.1％DEPC水浸泡过夜，高压灭菌40min后烘干。所有溶液均应采用0.1％DEPC水配制。利用DNA酶(天根生化科技有限公司)处理提取的RNA，使其纯化。用NanoDrop2000(ThermoScientific公司)进行总RNA浓度和纯度的测定。并用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行总RNA的分离。后采用Invitrogen公司的3′RACE和5′RACE试剂盒获得该基因的3′端和5′端间的核酸序列。

2)ThHAM1基因目的片段的获得

根据中山杉转录组测序结果进行筛选ThHAM1的Unigene序列，使用Oligo6设计特异性的引物扩增ThHAM1基因的目的片段。其中，ThHAM1目的片段的正向引物为：5′-ACAGCTGCTCAAGGCAGCGGAGGCAG-3′，5′-AACAACCACAGCCTTCGGGCAAAT-3′。采用TakaRa LATaq进行目的片段的扩增，PCR反应体系为：0.5μLLA Taq(5U/μL)，5.0μL10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μLMgCl₂(25mM)，8.0μLdNTP Mixture(2.5mM each)，2.0μLForward Primer(10μM)，2.0μLReverse Primer(10μM)，1.0μLcDNAtemplate，26.5μLMilli-Q Water。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，35cycles；72℃10min；4℃Forever。

使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并用QIA quick Gel Extraction Kit试剂盒(QIAGEN)进行回收。将回收产物连接到pMD19-T Vector载体(TaKaRa)上，取无菌离心管置于冰上，反应体系包括Solution I(2.5μL)，pMD 18-T Vector(0.5μL)，回收产物(2μL)，总体积为5μL，将连接反应体系溶液混匀，16℃连接过夜。连接后转化大肠杆菌Escherichia coliDH5α感受态细胞，将上述连接液全量加入有100μL感受态细胞的EP管，冰中放置30min后42℃加热45s，冰中放置5min。加入800μL的SOC培养基，37℃100rpm培养1h。将培养物3500rpm离心4min，弃上清，留取约100μL的菌液。悬浮菌体，涂布带有Amp抗性的LB琼脂培养基进行培养。倒置于37℃培养箱中培养过夜，挑选白色单菌落进行菌落PCR，鉴定目的片段是否转入大肠杆菌。再将筛选到的阳性克隆菌液送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

依据上述ThHAM1基因目的片段分别设计扩增基因3′RACE和5′RACE的引物，PCR筛选后进行克隆测序，最后将获得3′RACE片段及5′RACE片段进行拼接。

3)5′RACE

使用引物设计软件，注意引物设计时的相关原则，避免形成二聚体等，形成理想的Tm值。

第-链cDNA合成：1μLOligo-(dT)₁₈(0.5ug/μL)，样品总RNA(500ng)，1μLdNTP混合物(10mg/μL Each)，去RNase水，共计12μL的反应体系65℃保温5min以使RNA变性，迅速冰上冷却1min，稍离心以收集管中物质，按顺序加入4μL5×First strand buffer，2μL0.1M DTT，1μLRNase抑制剂(40ug/μL)，轻轻混匀，稍离心收集反应液，42℃温育2min，加1μLSuperScriptTM II RT(200units)，枪头吸打混匀，42℃温育60min，70℃15min以终止反应。离心10-20s，将反应液置于37℃，加1μL(2units)RNase mix(或RNase H)，混匀后37℃温育30min，稍离心收集反应液，置于冰上进行后续实验。

cDNA的S.N.A.P柱纯化：准备S.N.A.P流程的1×洗脱缓冲液和70％乙醇洗涤液，4℃保存。将结合溶液平衡到室温。对于每个要纯化的样品，准备约100μL的灭菌蒸馏水平衡到65℃，备用。将120μL的结合溶液(6M NaI)加到第-链反应液中。将cDNA/NaI溶液转移到S.N.A.P柱中，13000×g离心20s。将内管从管中移走，将流出液转移到另-个离心管中，将内管再放回管中。加0.4mL的1X洗脱缓冲液(4℃)到旋转管中，13000xg离心20s，丢弃流出液，重复该洗脱步骤3次。用400μL70％乙醇(4℃)洗涤2次。从管中移走最后的70％乙醇后，13000×g离心1min。将内管转移到1个新的回收管中，加50μL的灭菌蒸馏水(预热到65℃)到选择管中，13000xg离心20s以洗脱cDNA。

cDNA的TdT加尾：将6.5μLDEPC处理的水，5.0μL5×加尾缓冲液，2.5μL2mMdCTP，10.0μLS.N.A.P纯化的cDNA样品，加到1个管中轻轻混合，94℃温育3min，冰上冷却1min，稍离心收集管内物，冰上放置。加1μLTdT，轻轻混合，37℃温育10min后65℃10min使TdT热失活。稍离心收集管内物，冰上放置。

加尾cDNA的PCR：PCR管中加入31.5μL灭菌蒸馏水，5.0μL10×PCR buffer，3.0μLMgCl₂(25mM)，1.0μLdNTP mix(10mM)，2.0μL巢式GSP1(10uM)，2.0μLAbridgedAnchorprimer(10mM)，5.0μL加dC的cDNA，0.5μL的Taq DNA聚合酶(5U/μL)。将PCR管直接从冰上转到已预平衡到初始变性温度(94℃)的热循环仪，94℃2min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃保存。取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

巢式扩增：将5μL的初始PCR反应液用TE缓冲液(10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mMEDTA)。PCR管中加入33.5μL灭菌蒸馏水，5.0μL10×PCR buffer，3.0μL25mM MgCl₂，1.0μL10mMdNTP mix，1.0μL巢式GSP2(10uM)，1.0μLAUAP(10PM)，5.0μLPCR的稀释液，0.5μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)。将PCR管直接从冰上转到热循环仪中，进行35个循环的PCR。

5′RACE的AAP引物(Abridged Anchour Primes)：

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′

5′RACE的AUAP引物(Abridged Universal Amplification Primer)：

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′

本试验设计的用于5′RACE的引物如下：

ThHAM1GSP5R1(5′-GCCCATGTCGTTCTCTGCCTTTCA-3′，反向引物)

ThHAM1GSP5R2(5′-TCCCCGTCTCCTATGAGATGCCTGTC-3′，反向引物)产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的片段，利用切胶试剂盒回收后，连接于takara公司的PMD19-Tsimple Vector，转化大肠杆菌Escherichia coliDH5α，通过含有Amp的LB筛选培养板进行筛选，将筛选出的单克隆菌落PCR检测后送至金斯瑞公司测序鉴定。

4)3′RACE

3′RACE与5′RACE的操作步骤基本相同，主要区别是不必加尾。本实验中，用于3′RACE的引物为Adapter primer(AP)：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，以及ThHAM13F(5′-CAGCAATTTCACAGAGACGCAGGCGGA-3′正向引物)。

将测序获得的3′RACE及5′RACE产物利用Bioedit软件进行拼接，获得含有2295bp碱基的目的基因(SEQ ID NO.1所示)，其中编码阅读框为1905bp(SEQID NO.2所示)，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。Blast确认目的基因和其他物种HAM1基因高度同源，命名为ThHAM1基因。

实施例2：ThHAM1基因植物表达载体构建

利用Gateway定向克隆技术，将已获得的目的基因ORF片段转移到目的表达载体上，包含BP反应和LR反应两部分。本实施例所用的载体图如图1所示。

1)BP反应的目的是将基因片段转移到入门载体上，反应体系：vectorThHAM1 ORF片段10-20ng，Salt solution1μL，pCRTM8/GW/TOPOTMvector(入门载体)1μL，加Nuclease-free Water至总体积6μL，轻轻混匀，22℃反应60min后转移至冰上；将前步6μL反应产物转化到TOP10感受态细胞中，涂于LB筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液PCR检测，所用引物为基因特异性上游引物和载体上的T7引物，检测后的阳性克隆进一步测序验证。

2)LR反应的目的在于将已经重组入门载体的目标基因再克隆到目的载体中，反应体系：入门载体纯化后的质粒100ng，目的载体(100ng/μL)1.5μL，LR Clonase II enzymemix2μL，加1×TE(pH8.0)至总体积8μL，涡旋后短暂离心，25℃温浴1h，加入1uL ProteinaseK solution，混匀，37℃温浴10min以终止反应；取2μL LR反应产物转化Top10感受态细胞，涂于LB筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液PCR检测，所用引物为ThHAM1基因特异性上游引物和载体上的35s引物，检测后的阳性克隆进一步测序验证。验证后，回收纯化LR反应后的重组载体，即得到目的基因的表达载体，-20℃保存备用。

实施例3：ThHAM1基因的遗传转化

通过液氮冻融法将ThHAM1基因转化农杆菌，后用叶盘法转化杂种山新杨。操作步骤：在EHA105感受态细胞中加入至少100ng回收纯化的表达载体，轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃热击3min，迅速置于冰上1-2min，加入800μL LB培养基，28℃，100rmp复苏3h，4000rmp离心3min，吸掉800μL LB培养基，混匀剩余菌液，涂抹于含有抗生素的LB平板，28℃倒置培养30-48h，PCR检测阳性克隆，将阳性克隆菌落扩繁，接种于120mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃摇菌(220rmp)培养24h左右，至OD₆₀₀值约0.5，将菌液分装于50mL的离心管中，1400rcf离心10min，收集菌体，用一定体积的MS(不加蔗糖)溶液重悬菌体至OD₆₀₀值0.5，乙酰丁香酮(As)至终浓度为20μM，25℃温和振荡(90rmp)菌液45min，将生长势基本一致，4-6周的山新杨组培苗，取顶芽下的2-3片舒展的叶片，延叶的边缘剪出伤口，片剪成大小合适的不等边形，转入制备好的浸染液中25℃温和振荡30min(250mL的三角瓶，90rmp)，取出叶盘，用滤纸吸干残余菌液，转入不含抗生素的MS1分化培养平板上暗培养48h，洗菌后转入不含抗生素的MS1分化培养平板上光培养1W，再将叶盘转入含抗生素的MS1分化培养平板上，进行筛选培养，当叶盘边缘长出抗性不定芽时，将其转入含抗生素的MS2茎伸长培养平板上培养，当抗性不定芽在茎伸长培养基中生长至1em左右时，将其剪下转入含有抗生素的MS培养平板上进行抗性植株生根筛选，从而获得完整植株，扦插抗性植株的苗干于MS培养基上，进行插条的表型观测。生长4W后，从图1可以看出，ThHAM1的过量表达对植株的表型产生了一定的影响，转ThHAM1植株生长速度减慢，伴随着表型出现变异，尤其以根部最为明显，不定根数量减少，长度变短。

实施例4：ThHAM1基因表达分析

以生长4周的转基因山新杨及未转基因山新杨为材料，取根、茎、叶不同组织的材料，进行基因的表达分析检测。植物总RNA提取试剂盒(天根公司)提取叶片RNA。利用DNA酶处理提取的RNA，使其纯化。利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用紫外分光光度计在260nm和280nm下检测RNA的浓度与纯度。以1μg RNA为模板，利用HiScript Q RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(诺唯赞公司)进行反转录，合成第1链cDNA，存于-20℃冰箱备用。

利用软件Oligo6.0设计内参基因GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate)和两个目的基因ThHAM1的qRT-PCR引物。利用Analitik Jena qTOWER2.2(德国)系统进行qRT-PCR。按照SYBR Green试剂盒(Rox)说明书操作，扩增程序为：55℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，进行40个循环。随后设置60℃至95℃，生成融解曲线。每个样品进行3个技术性重复，20μL的反应体系中包含：2μL稀释后的cDNA(稀释比例为1∶3，稀释后的cDNA浓度大约是350ng·μL^-1)，10μLFastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，6pmol上游引物，6pmol下游引物以及6.8μL ddH₂O。基因的相对表达量按照2^-ΔΔCt方法进行计算。试验数据经SPSS 19.0软件统计分析并绘图。数据采用Duncan法(P＜0.05)进行单因素方差分析。

本实验用于荧光实时定量PCR的引物序列如下：

ThHAM1_qRT-PCR

正向引物5′-GCGCCACCAGCAGCAACAACAG-3′

反向引物5′-AACAACCACAGCCTTCG-3′

GAPDH_qRT-PCR

正向引物5′-CCATCGGAGCCCATTATCAG-3′

反向引物5′-ACTATGTTCAACGCCGCTGC-3′

定量结果如图2所示：无论是转基因植株还是对照植株，ThHAM1基因在根中的表达量明显比茎和叶中要都高，且转基因植株中ThHAM1基因的表达量是未转基因植株的200-500倍。结合转基因植株的表型变异，分析ThHAM1基因和根的生长发育密切相关，是调控植物根发育和影响植物形态的重要基因，在林木基因工程领域有重要的应用价值。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因及其应用

<130> 100

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2295

<212> DNA

<213> T. hybrid 'Zhongshanshan 406'

<400> 1

gaaaagcagt ggtatcaacg cagaggaatg ggtgcctgga ggcacaaacg ctgcaacagc 60

gggtatggag gatttggaga gcatcatgga ggatttggag agcatcatgt tgctggaatc 120

cgcagcggcg accgcaccgg atcagtcctt aatgcgctgg ctgcttgggg agagcgacga 180

tcccaaggat atccccgcct catcgccgct gccgcaaatt aatagtatgg agtcgagctt 240

tcctgaccct gggagctttg cattttctac cagtggtgtt gaatccatgg cgccatcgac 300

aagtaccttc cactccccgg cctattctgc attgcccacc cgccatcaat ttggcgacaa 360

ccctgcaacc atttcacccc cgcccatgtc gttctctgcc tttcagcctc aactgccaga 420

gccgccgcca ccgttactgc cagcaagttt taataacccc aaccccaatt cgctgctctt 480

tccttccaat gcgtttgcca aagaaccttc tgtgaatcct aacaatgtct ttttccccgt 540

ctcctatgag atgcctgtcc ctaagcgcct ccatggcggg cttccagtgg agcagatgcc 600

attgccttta aggcctccac cactctggca ccagcagaac cagaaccaga accagcacca 660

ggtttctgtg aagcaggaat tcatgttcaa accccagcag cagcagcaac accatgttga 720

tctcctgcag tccctccagc ggcgccacca gcagcaacaa cagcagcagc tgcttctgcc 780

tacccaattc cagcgccaga agggcggccc cccttctggg cccttcatga aatccataag 840

cttgggttca gaggaggctc agcagacaat ggtgggacag ctgctcaagg cagcggaggc 900

agtggaacaa ggcaccttta ctcacgccca ggcgatattg gcgcggctca atcagcatct 960

caccccttac ggtaagcccc ttcaccgggc agcatactat ttcaaggagg ccctagcttc 1020

ccgcatcctt aaccaaacca acggcagcaa cactggtttt gctacactgc cgccctctcc 1080

ggtggaaatc gttcacaaaa tcagcgctta caagagcttc tcagaagttt cttcgctcgc 1140

acagttcgca aatttcactg ccaatcaggc cctgctggaa gcactggagg gggcagacgc 1200

aattcacatc atagacttcg aaatcgggct gggtgggcag tgggcttcgt ttctgcagga 1260

gcttgctctc agaatgggcg gctccccttc gctccgcctt actgccctgg gcgctaggga 1320

ctccgtcgaa atgcacctgg ccagagaaaa tcttgcgcat ttcgccaagg agcccaacat 1380

aagctttgaa ttcaatgtcc tggagttgga gggagtcgaa aacctgacca tctcgatgct 1440

gcgcctcagg gagggagagt ccgtggccgt aaacatgtcg gtaggcatgc accgtctctt 1500

ctcctcctat cctccccagg actcgttcgc cgcattgctg aaagagattt gcccgaaggc 1560

tgtggttgtt cttgacggcg aaatgtgccc ctcttcatcc tcattcgtgc agcagtttct 1620

ggaagcgctt cagttctact catttctctt cgattccctg gacgctgtca acaacatgaa 1680

catggacgcc gtccacaaga ttgagaagtt tcttctggcg cccaagattg agaacctggt 1740

ggtctcgggt tcgactcctg ccaaggcagc agttcaggtt tcaccatgga ggagtgtttt 1800

catggcgggg gggctggtac cagtggcctt cagcaatttc acagagacgc aggcggagta 1860

tctgattcgg cgccttcctg cccgtggctt cgacgttatc aaagaccagt cgacgctgcg 1920

gctcgcatgg caaggcagga ccctggtttc tgcctccctc tggaggtgct gatcgcttac 1980

tgctaattta tcattattaa gctaattaag gagtcggtca ttagctgtag ctagataggt 2040

atcgtgttag tagccatggc cacacgcagg cttactgcta gaaataattg gcaactgaaa 2100

ttgtggctgt gtttttgctt attttacttg ctttttacac gcagtttact aacagagact 2160

tcttcttctt cttctgcttc tgagaaagag attatgtaag ttcagatctt tttcttcttc 2220

tgttataatt tgtggtatca aaaatcaaaa aacactattt gttgctaaaa aaaaaaaaaa 2280

aaaaaaaaaa aaaaa 2295

<210> 2

<211> 1905

<212> DNA

<213> T. hybrid 'Zhongshanshan 406'

<400> 2

atggaggatt tggagagcat catggaggat ttggagagca tcatgttgct ggaatccgca 60

gcggcgaccg caccggatca gtccttaatg cgctggctgc ttggggagag cgacgatccc 120

aaggatatcc ccgcctcatc gccgctgccg caaattaata gtatggagtc gagctttcct 180

gaccctggga gctttgcatt ttctaccagt ggtgttgaat ccatggcgcc atcgacaagt 240

accttccact ccccggccta ttctgcattg cccacccgcc atcaatttgg cgacaaccct 300

gcaaccattt cacccccgcc catgtcgttc tctgcctttc agcctcaact gccagagccg 360

ccgccaccgt tactgccagc aagttttaat aaccccaacc ccaattcgct gctctttcct 420

tccaatgcgt ttgccaaaga accttctgtg aatcctaaca atgtcttttt ccccgtctcc 480

tatgagatgc ctgtccctaa gcgcctccat ggcgggcttc cagtggagca gatgccattg 540

cctttaaggc ctccaccact ctggcaccag cagaaccaga accagaacca gcaccaggtt 600

tctgtgaagc aggaattcat gttcaaaccc cagcagcagc agcaacacca tgttgatctc 660

ctgcagtccc tccagcggcg ccaccagcag caacaacagc agcagctgct tctgcctacc 720

caattccagc gccagaaggg cggcccccct tctgggccct tcatgaaatc cataagcttg 780

ggttcagagg aggctcagca gacaatggtg ggacagctgc tcaaggcagc ggaggcagtg 840

gaacaaggca cctttactca cgcccaggcg atattggcgc ggctcaatca gcatctcacc 900

ccttacggta agccccttca ccgggcagca tactatttca aggaggccct agcttcccgc 960

atccttaacc aaaccaacgg cagcaacact ggttttgcta cactgccgcc ctctccggtg 1020

gaaatcgttc acaaaatcag cgcttacaag agcttctcag aagtttcttc gctcgcacag 1080

ttcgcaaatt tcactgccaa tcaggccctg ctggaagcac tggagggggc agacgcaatt 1140

cacatcatag acttcgaaat cgggctgggt gggcagtggg cttcgtttct gcaggagctt 1200

gctctcagaa tgggcggctc cccttcgctc cgccttactg ccctgggcgc tagggactcc 1260

gtcgaaatgc acctggccag agaaaatctt gcgcatttcg ccaaggagcc caacataagc 1320

tttgaattca atgtcctgga gttggaggga gtcgaaaacc tgaccatctc gatgctgcgc 1380

ctcagggagg gagagtccgt ggccgtaaac atgtcggtag gcatgcaccg tctcttctcc 1440

tcctatcctc cccaggactc gttcgccgca ttgctgaaag agatttgccc gaaggctgtg 1500

gttgttcttg acggcgaaat gtgcccctct tcatcctcat tcgtgcagca gtttctggaa 1560

gcgcttcagt tctactcatt tctcttcgat tccctggacg ctgtcaacaa catgaacatg 1620

gacgccgtcc acaagattga gaagtttctt ctggcgccca agattgagaa cctggtggtc 1680

tcgggttcga ctcctgccaa ggcagcagtt caggtttcac catggaggag tgttttcatg 1740

gcgggggggc tggtaccagt ggccttcagc aatttcacag agacgcaggc ggagtatctg 1800

attcggcgcc ttcctgcccg tggcttcgac gttatcaaag accagtcgac gctgcggctc 1860

gcatggcaag gcaggaccct ggtttctgcc tccctctgga ggtgc 1905

<210> 3

<211> 635

<212> PRT

<213> T. hybrid 'Zhongshanshan 406'

<400> 3

Met Glu Asp Leu Glu Ser Ile Met Glu Asp Leu Glu Ser Ile Met Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ser Ala Ala Ala Thr Ala Pro Asp Gln Ser Leu Met Arg Trp

20 25 30

Leu Leu Gly Glu Ser Asp Asp Pro Lys Asp Ile Pro Ala Ser Ser Pro

35 40 45

Leu Pro Gln Ile Asn Ser Met Glu Ser Ser Phe Pro Asp Pro Gly Ser

50 55 60

Phe Ala Phe Ser Thr Ser Gly Val Glu Ser Met Ala Pro Ser Thr Ser

65 70 75 80

Thr Phe His Ser Pro Ala Tyr Ser Ala Leu Pro Thr Arg His Gln Phe

85 90 95

Gly Asp Asn Pro Ala Thr Ile Ser Pro Pro Pro Met Ser Phe Ser Ala

100 105 110

Phe Gln Pro Gln Leu Pro Glu Pro Pro Pro Pro Leu Leu Pro Ala Ser

115 120 125

Phe Asn Asn Pro Asn Pro Asn Ser Leu Leu Phe Pro Ser Asn Ala Phe

130 135 140

Ala Lys Glu Pro Ser Val Asn Pro Asn Asn Val Phe Phe Pro Val Ser

145 150 155 160

Tyr Glu Met Pro Val Pro Lys Arg Leu His Gly Gly Leu Pro Val Glu

165 170 175

Gln Met Pro Leu Pro Leu Arg Pro Pro Pro Leu Trp His Gln Gln Asn

180 185 190

Gln Asn Gln Asn Gln His Gln Val Ser Val Lys Gln Glu Phe Met Phe

195 200 205

Lys Pro Gln Gln Gln Gln Gln His His Val Asp Leu Leu Gln Ser Leu

210 215 220

Gln Arg Arg His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Leu Leu Pro Thr

225 230 235 240

Gln Phe Gln Arg Gln Lys Gly Gly Pro Pro Ser Gly Pro Phe Met Lys

245 250 255

Ser Ile Ser Leu Gly Ser Glu Glu Ala Gln Gln Thr Met Val Gly Gln

260 265 270

Leu Leu Lys Ala Ala Glu Ala Val Glu Gln Gly Thr Phe Thr His Ala

275 280 285

Gln Ala Ile Leu Ala Arg Leu Asn Gln His Leu Thr Pro Tyr Gly Lys

290 295 300

Pro Leu His Arg Ala Ala Tyr Tyr Phe Lys Glu Ala Leu Ala Ser Arg

305 310 315 320

Ile Leu Asn Gln Thr Asn Gly Ser Asn Thr Gly Phe Ala Thr Leu Pro

325 330 335

Pro Ser Pro Val Glu Ile Val His Lys Ile Ser Ala Tyr Lys Ser Phe

340 345 350

Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala Gln Phe Ala Asn Phe Thr Ala Asn Gln

355 360 365

Ala Leu Leu Glu Ala Leu Glu Gly Ala Asp Ala Ile His Ile Ile Asp

370 375 380

Phe Glu Ile Gly Leu Gly Gly Gln Trp Ala Ser Phe Leu Gln Glu Leu

385 390 395 400

Ala Leu Arg Met Gly Gly Ser Pro Ser Leu Arg Leu Thr Ala Leu Gly

405 410 415

Ala Arg Asp Ser Val Glu Met His Leu Ala Arg Glu Asn Leu Ala His

420 425 430

Phe Ala Lys Glu Pro Asn Ile Ser Phe Glu Phe Asn Val Leu Glu Leu

435 440 445

Glu Gly Val Glu Asn Leu Thr Ile Ser Met Leu Arg Leu Arg Glu Gly

450 455 460

Glu Ser Val Ala Val Asn Met Ser Val Gly Met His Arg Leu Phe Ser

465 470 475 480

Ser Tyr Pro Pro Gln Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Lys Glu Ile Cys

485 490 495

Pro Lys Ala Val Val Val Leu Asp Gly Glu Met Cys Pro Ser Ser Ser

500 505 510

Ser Phe Val Gln Gln Phe Leu Glu Ala Leu Gln Phe Tyr Ser Phe Leu

515 520 525

Phe Asp Ser Leu Asp Ala Val Asn Asn Met Asn Met Asp Ala Val His

530 535 540

Lys Ile Glu Lys Phe Leu Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Leu Val Val

545 550 555 560

Ser Gly Ser Thr Pro Ala Lys Ala Ala Val Gln Val Ser Pro Trp Arg

565 570 575

Ser Val Phe Met Ala Gly Gly Leu Val Pro Val Ala Phe Ser Asn Phe

580 585 590

Thr Glu Thr Gln Ala Glu Tyr Leu Ile Arg Arg Leu Pro Ala Arg Gly

595 600 605

Phe Asp Val Ile Lys Asp Gln Ser Thr Leu Arg Leu Ala Trp Gln Gly

610 615 620

Arg Thr Leu Val Ser Ala Ser Leu Trp Arg Cys

625 630 635

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> ThHAM1 引物1 引物序列(Artificial)

<400> 4

acagctgctc aaggcagcgg aggcag 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> ThHAM1 引物2 引物序列(Artificial)

<400> 5

aacaaccaca gccttcgggc aaat 24

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 5'RACE AAP 引物序列(Artificial)

<400> 6

ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 5'RACE AUAP 引物序列(Artificial)

<400> 7

ggccacgcgt cgactagtac 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> ThHAM1GSP5R1 引物序列(Artificial)

<400> 8

gcccatgtcg ttctctgcct ttca 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> ThHAM1GSP5R2 引物序列(Artificial)

<400> 9

tccccgtctc ctatgagatg cctgtc 26

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 3' RACE AP 引物序列(Artificial)

<400> 10

ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> ThHAM13F 引物序列(Artificial)

<400> 11

cagcaatttc acagagacgc aggcgga 27

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> ThHAM1_qRT-PCR F 引物序列(Artificial)

<400> 12

gcgccaccag cagcaacaac ag 22

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> ThHAM1_qRT-PCR R 引物序列(Artificial)

<400> 13

aacaaccaca gccttcg 17

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH_qRT-PCR F 引物序列(Artificial)

<400> 14

ccatcggagc ccattatcag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH_qRT-PCR R 引物序列(Artificial)

<400> 15

actatgttca acgccgctgc 20

Claims

1.ThHAM1基因在制备生长缓慢的山新杨模型中的应用，其特征在于，所述的ThHAM1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。