CN118324889B - 毛竹秆高调控相关PheARF1.5蛋白及编码基因与应用 - Google Patents
毛竹秆高调控相关PheARF1.5蛋白及编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及毛竹秆高调控相关PheARF1.5蛋白及编码基因与应用。本发明首次通过农杆菌介导法将基因表达载体转入野生型水稻中，结果显示过表达PheARF1.5基因的水稻植株的高度增加，基部向上第一节间的长度增加，说明该基因能够调控植物高度。因此，PheARF1.5蛋白及其编码基因可以作为一种潜在的分子育种工具，用于改良植物高度，提高植物出材量和生态效益，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及毛竹秆高调控相关PheARF1.5蛋白及编码基因与应用。
背景技术
竹类植物在世界范围内分布广泛，被称为“世界第二大森林”。全球已知竹林面积超过5000万公顷，每天有超过15亿人的生活和竹子发生联系。毛竹（Phyllostachysedulis）是我国栽培悠久、面积最广、经济价值也最高的竹种，广泛地被应用于造林、工业生产、风景设计、有机食品制造等行业。它是世界上生长速度最快的植物之一，可以在45天~60天内长高15米~20米。茎秆是竹子最重要的支持器官，茎秆的长度、粗细、强度等指标直接决定材用价值。但目前针对毛竹茎秆发育相关基因功能研究的理论仍然十分匮乏，值得进行更加深入的探索。
研究人员对茎秆发育的分子机制开展研究并取得了一定的进展。ARF转录因子家族在植物发育过程的地位至关重要，参与植物的多种发育过程，如茎秆的生长和顶端分生组织的维持等。了解这些转录因子如何调控茎秆的发育、以及相关的分子机理非常必要。
ARF家族影响多种植物中茎秆的生长和节间伸长。例如，在水稻（Oryza sativa）中，ARF19通过调节细胞分裂和伸长影响节间发育。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，ARF2和ARF7被发现对茎秆的垂直生长具有重要的调控作用。此外，ARF6和ARF8在调节花梗的长度和角度方面起着关键作用，间接影响茎秆的整体结构和功能。在其他物种如烟草（Nicotiana tabacum）中，ARF基因同样在节间伸长和花序架构的形成中发挥核心作用。
目前已发表的大部分关于ARF家族的研究集中在一年生植物如拟南芥、水稻等模式植物上，而毛竹中ARF基因的功能还鲜有报道。因此，分离和鉴定毛竹中与茎秆发育相关的ARF基因，对于全面理解毛竹茎秆和节间生长的分子机制非常重要，同时也为培育新品种和优化栽培技术提供了可能。
发明内容
本发明从毛竹中分离得到了一个调控植物秆高的ARF基因PheARF1.5，基于此，提出如下发明内容。
首先，本发明提供了毛竹PheARF1.5蛋白，其氨基酸序列为如下（1）或（2）所示：（1）如SEQ ID NO.1所示；（2）如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的氨基酸序列。
进一步，本发明提供了编码所述毛竹PheARF1.5蛋白的核酸。
优选地，所述核酸为PheARF1.5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，本发明提供了一种生物材料，其中含有所述的毛竹PheARF1.5蛋白或所述的核酸；所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物细胞或组织。
进一步，本发明提供了所述的毛竹PheARF1.5蛋白、或所述的核酸、或所述的生物材料在植物株高调控中的应用。
进一步，本发明提供了所述的毛竹PheARF1.5蛋白、或所述的核酸、或所述的生物材料在植物茎秆高度调控中的应用。
优选地，所述植物包括水稻或毛竹。
优选地，通过提高毛竹PheARF1.5蛋白的表达或活性，以促进植物茎秆伸长。
优选地，通过过表达毛竹PheARF1.5基因，以促进植物茎秆伸长。
在一些实施方案中，所述过表达的方式选自（1）~（5）中的一种或多种的组合：（1）通过导入含有所述基因的质粒；（2）通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；（3）通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；（4）通过将强启动子与所述基因可操作地连接；（5）通过导入增强子。
优选地，通过抑制或消除毛竹PheARF1.5蛋白的表达或活性，以抑制植物茎秆伸长。
优选地，通过敲除或抑制毛竹PheARF1.5基因的表达，以抑制植物茎秆伸长。
在一些实施方案中，所述敲除是使用任意一种已知的敲除方法。
在一些实施方案中，所述敲除是使用同源重组的方法进行敲除。
在一些实施方案中，所述敲除是使用CRISPR-Cas系统编辑。
进一步，本发明提供了所述的毛竹PheARF1.5蛋白、所述的核酸、或所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。
优选地，所述应用包括：根据毛竹PheARF1.5基因设计克隆引物；以毛竹的cDNA为模板进行PCR扩增，将克隆产物与pGEM-T Easy载体连接后，进行转化测序，然后将测序正确的序列构建过表达载体pCAMBIA2300- PheARF1.5，通过农杆菌介导法转化水稻，获得转基因植物。
进一步，本发明提供了所述的毛竹PheARF1.5蛋白、所述的核酸、或所述的生物材料在植物育种中的应用。
所述育种的方式包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
进一步，本发明提供了一种调控植物高度的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中促进或者抑制所述毛竹PheARF1.5蛋白或其编码基因的表达或活性；所述植物包括水稻或毛竹。
优选地，本发明提供了一种提高植物高度的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中促进所述毛竹PheARF1.5蛋白或其编码基因的表达或活性；所述植物包括水稻或毛竹。
优选地，所述基因工程手段包括：将携带有目的基因的表达载体通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、或电穿孔技术导入植物细胞中。
优选地，所述方法还包括：借助抗生素抗性筛选和RT-PCR方法分析鉴定阳性转基因植株，然后对阳性植株表型进行观察和检测，借助实时荧光定量PCR分析转基因植株和野生型植株中目标基因的表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明首次提供了毛竹秆高调控相关的PheARF1.5蛋白及其编码基因与应用。首次通过农杆菌介导法将基因表达载体转入野生型水稻中，结果显示过表达PheARF1.5基因的水稻植株的高度增加，基部向上第一节间的长度增加，说明该基因能够调控植物高度。因此，PheARF1.5蛋白及其编码基因可以作为一种潜在的分子育种工具，用于改良植物高度，提高植物出材量和生态效益，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是转基因植株的阳性检测结果图，其中，WT为野生型水稻，1~27表示OE-PheARF1.5转基因水稻，M为D1000 DNA Marker。
图2是PheARF1.5基因过表达株系的株高分析图，其中，WT为野生型水稻，OE-PheARF1.5为转基因水稻植株。
图3是PheARF1.5基因过表达株系的第一节间长度分析图，其中，WT为野生型水稻，OE-PheARF1.5为转基因水稻植株。
图4是转基因水稻植株的PheARF1.5基因相对表达量分析图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning: a Laboratory Manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件，所用原料均为市售商品。
下面采用更为具体的实施例用以阐述本发明。
1、毛竹春笋材料采自安徽省广德市（N30°52′33″8-E119°25′22″4）。将毛竹春笋置于-80℃保存，用于后续实验。
2、RNA的提取
具体操作如下：（1）取2-3g毛竹春笋材料，置于用液氮预冷的研钵中，在液氮中迅速磨成粉末，快速转移至液氮预冷过的2mL RNase-free离心管中；（2）每管加入1mLTrizol，快速颠倒混匀；（3）每管加入200μL 氯仿，在涡旋震荡器上震荡混匀1min，冰上静置15min；（4）12,000rpm，10min，4 °C离心；（5）吸取600μL 上清液，放入1.5mL RNase-free离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上放置15min；（6）12,000rpm，10min离心，弃上清，沉淀用DEPC-H2O-70%乙醇洗2次；（7）室温晾干后，于50-100μL的 DEPC-H2O中溶解沉淀。
3、将总RNA通过反转录过程转化为cDNA
根据PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)试剂盒进行cDNA第一链反转录：（a）去除基因组DNA反应：按如下表1成分于冰上配制反应混合液，PCR反应程序为：42℃， 2min。
表1去基因组DNA反应体系
。
（b）反转录反应：反转录PCR反应程序为：37℃, 15min； 85℃, 5s； 4℃低温保存。反转录反应体系如表2所示。
表2 反转录反应体系
。
4、基因克隆
（1）PheARF1.5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；设计引物序列如下。
PheARF1.5-F：ATGGCGAATTCCGGCGC（SEQ ID NO.3）。
PheARF1.5-R：TCAGCAGTCCTTATCGGTAACAGG （SEQ ID NO.4）。
（2）PCR扩增
以毛竹cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，反应程序为：94℃，1min；95℃，10s；60℃，30s；72℃，1min；循环30次；72℃，10min。在冰上配制20μL扩增体系如下表3所示。
表3 PCR反应体系
。
（3）使用1％琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合预期，进行下一步割胶回收验证。
（4）胶回收纯化，根据M5 Gel Extraction Kit（聚合美，北京）试剂盒说明书进行胶回收纯化。
5、克隆产物与载体连接
（1）在一个新的微量离心管中，加入100ng的PCR产物、100ng的pGEM-T Easy载体（Promega公司）、1单位的T4 DNA连接酶（Promega公司）、5μL的10×连接缓冲液（Promega公司）、适量的ddH2O使总体积达到50μL。轻轻混合所有成分，在室温下进行1小时连接反应。
（2）将连接好的产物转化到感受态细菌中、热激转化包括混合连接产物和感受态细菌，短暂冰上冷却，然后在42°C下进行热激30-60秒，随后迅速冷却；将混合物加入到液体培养基中，在37°C下恢复培养60分钟；将混合物涂布到含有适当抗生素的琼脂糖平板上。
（3）在培养板上培养过夜后，挑选生长良好的菌落进行PCR检测，以确认是否包含目标克隆；选择克隆进行菌落PCR以确认插入片段的序列，将鉴定正确的阳性菌液送到苏州金唯智公司进行测序。
6、构建表达载体
（1）分别对pCAMBIA2300载体和含有PheARF1.5序列的pGEM-T Easy质粒进行限制酶EcoRⅠ和SalⅠ消化，在37°C下进行1小时消化。
（2）使用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物，然后通过凝胶回收技术提纯消化后的载体和插入片段，将净化后的载体和插入片段混合，并加入T4 DNA连接酶和连接缓冲液，轻轻混合，然后在室温下孵育1小时。
（3）将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。使用热激法进行转化，然后将细菌涂布到含有适当选择性抗生素的LB琼脂平板上。
（4）在平板上培养细菌直至形成可见菌落，挑选单个菌落进行菌落PCR，将阳性克隆进行测序，测序正确表明过表达载体pCAMBIA2300- PheARF1.5构建成功。
7、植物转化
（1）挑选无霉斑、芽口正常的米粒，用75％酒精消毒1min，灭菌水清洗，1min/次；15%次氯酸钠消毒20min，灭菌水清洗3次，1min/次；消毒后的米粒接种于诱导培养基，26℃光照培养20天。
（2）挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600=0.2的农杆菌重悬液，挑取愈伤于三角瓶中，加入农杆菌重悬液，侵染15min后弃菌液，将愈伤接种于共培培养基，20℃共培养72h。
（3）将愈伤接种于筛选培养基，26℃暗培养30天；将阳性愈伤接种至二次筛选培养基，愈伤挑取过程务必挑取单克隆愈伤，26℃暗培养10天。
（4）将阳性愈伤接种至分化培养基，25℃光照培养20天，待分化出2-5cm的芽后接种至生根培养基，30℃光照培养10天。
（5）采用CTAB法提取水稻基因组DNA，进行PCR检测，检测方法同农杆菌菌检，结果如图1所示。
8、茎秆性状观察和检测
选择经过基因筛选的阳性转基因水稻植株以及未经转化的野生型水稻植株作为对照组，确保所有植株在相同的生长条件下培养以保持一致性。水稻植株生长6个月后，在显微镜下观察并记录植株的形态特征，如株高和节间长度。
图2显示了PheARF1.5过表达水稻与野生型水稻在表型上的差异，过表达PheARF1.5的植株高度、基部向上第一节间长度显著高于野生植株（图2和图3）。
9、基因表达分析
用于实时荧光定量PCR的特异性引物同上，用于扩增目标基因。
以TIP41为内参（Fan et al., 2013），分析目的基因的表达模式。qRT-PCR反应体系（20μL）：SYBR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 7.2μL。反应程序：95℃ 5min； 95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 20s，45个循环，实验进行三次重复，对获得的数据采用2-△△CT方法计算相对表达量。
PheARF1.5基因的相对表达量如图4所示。结果表明：转基因水稻植株中PheARF1.5基因的相对表达量大幅提高。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.毛竹PheARF1.5蛋白，其特征在于，所述毛竹PheARF1.5蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述毛竹PheARF1.5蛋白的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种生物材料，其特征在于，其中含有权利要求1所述的毛竹PheARF1.5蛋白、或权利要求2或3所述的核酸分子；所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
5.权利要求1所述的毛竹PheARF1.5蛋白、权利要求2或3所述的核酸分子、或权利要求4所述的生物材料在促进植物株高中的应用；
所述应用具体为：提高毛竹PheARF1.5蛋白的表达或活性，以促进植物茎秆伸长；所述植物为水稻。
6.权利要求1所述的毛竹PheARF1.5蛋白、权利要求2或3所述的核酸分子、或权利要求4所述的生物材料在制备转基因水稻中的应用。
7.权利要求1所述的毛竹PheARF1.5蛋白、权利要求2或3所述的核酸分子、或权利要求4所述的生物材料在水稻育种中的应用。
8.一种提高水稻高度的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，在水稻中促进权利要求1所述毛竹PheARF1.5蛋白或其编码基因的表达或活性。
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