CN106480084B - OsLAC13和miR397a/b在培育高结实率或高产水稻中的应用 - Google Patents
OsLAC13和miR397a/b在培育高结实率或高产水稻中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了OsLAC13和miR397a/b基因在培育高结实率或高产水稻中的应用。本发明研究发现，水稻中OsLAC13基因的敲除或者敲低都会显著性增加水稻的结实率，增大水稻的籽粒和穗型，表明OsLAC13基因是水稻结实率和产量的负调控基因。另外，miR397a/b可以结合OsLAC13基因的编码区上的一个miRNA结合位点，造成OsLAC13基因mRNA的降解，从而达到下调OsLAC13基因表达的效果，因此miR397a/b的高表达可作为另一种下调OsLAC13的方式。因此，对OsLAC13的表达调控可用于培育高产水稻，为培育高结实率或高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域。更具体地，涉及OsLAC13和miR397a/b基因在培育高结实率或高产水稻中的应用。
背景技术
粮食问题是当今世界所面临的几个难题之一。寻找影响水稻产量相关特性的基因一直以来都是提高粮食产量的研究重点。目前已经发现了不少影响水稻产量的基因，对提高水稻产量提供了理论基础。但为了解决不断增长的人口与逐渐减少的耕地面积的矛盾，发现更多调节水稻产量的基因仍是急需解决的大问题。因此，不断寻找新的提高水稻产量基因，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。
水稻产量是一个复杂的农艺性状，它主要受单位面积有效穗数、每穗粒数及千粒重三个要素决定。其中每穗粒数还受到结实率的影响。因此，寻找调控结实率、千粒重和穗型等产量性状的基因不仅是重要的基础研究，也对生产有重要的指导意义。目前已经有一些相关的蛋白编码基因被鉴定出来。例如，PTB1是调控水稻结实率的基因，它通过影响花粉管生长而正调控结实率；GSD1则通过影响胞间连丝电导率而调控水稻结实率；THIS1则既影响结实率也影响水稻株行。Ghd7和Ghd8同时控制水稻每穗粒数。Ghd7编码一个CCT结构域蛋白，Ghd8编码一个CCAAT-box binding蛋白复合体的一个亚基。DEP1是控制穗型和穗粒数的一个关键基因， C端缺失的dep1突变蛋白能够促进细胞分裂，导致穗粒数增加，进而显著提高水稻产量。GW2是较早克隆到的一个控制粒宽同时也控制粒重的主效QTL，编码一个E3泛素连接酶，推测GW2通过参与对细胞分裂相关的蛋白的泛素化降解过程，进而影响水稻籽粒颖壳的发育和胚乳的发育过程，调控水稻籽粒大小。GS3是一个控制水稻粒长和粒重的主效QTL，而对水稻粒宽和粒厚影响较小。除了以上这些基因外，还有其他一些蛋白编码基因被报道参与调控水稻产量。
近年来，非编码RNA也被报道参与调控水稻产量。miRNA(microRNA)是一类非编码单链RNA，广泛存在于动物和植物等多细胞生物中，它可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或转录后水平导致基因沉默，从而参与基因的表达调控。miRNAs参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用。有趣的是，一些植物miRNA通过下调其靶基因而参与调控水稻产量。例如：miR167可以通过调控其靶基因ARF8，来调节生长素信号通路，并最终影响植物产量；miR159切割一类受赤霉素调控的MYB家族基因，组成型表达miR159会引起短日照情况下开花的推迟和花粉的不正常发育；近期更有报道，水稻中miR156通过对下调其靶基因OsSPL14，显著降低水稻分蘖，穗分支及种子数量，直接负调控水稻产量。因此，通过miRNA来下调负调控产量的蛋白编码基因可作为水稻育种的一种新的方式。
发明内容
本发明的目的是针对当前粮食紧缺与不断增长的人口这一主要矛盾，提供OsLAC13及miR397在培育高产水稻中的应用。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术、RNA干涉技术和miRNA调控技术等培育改良水稻品种，显著增加水稻的结实率，增大水稻的籽粒和穗型，实现增加水稻产量的目的。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了OsLAC13基因以及miR397基因在培育高结实率和/或高产水稻中的应用。
OsLAC13基因的抑制和/或沉默制剂在培育高结实率和/或高产水稻中的应用，以及miR397基因的表达促进或激活制剂在培育高结实率和/或高产水稻中的应用，也都在本发明的保护范围之内。
具体地，所述miR397基因为miR397a基因或miR397b基因。
优选地，所述miR397基因为miR397b基因。
另外，上述高产是指籽粒更大、每穗粒数更多、千粒重更重和/或每穗有效粒数更多。
其中，所述OsLAC13基因的序列公开如下：水稻基因组数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml），OsLAC13的基因编号是： LOC_Os05g38420。
所述miR397a和miR397b基因的序列均公开于网站miRbase（ http://www.mirbase.org/index.shtml），miR397a的编号是：MI0001049，miR397b的编号是：MI0001050。
本发明还提供一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，具体是在水稻中敲除OsLAC13基因，或沉默和/或抑制OsLAC13基因的表达，从而得到高结实率和/或高产水稻。
优选地，所述敲除OsLAC13基因的方法可以为CRISPR-Cas9技术。
优选地，所述沉默和/或抑制OsLAC13基因的表达的方法可以为RNAi技术或高表达OsmiR397a/b。
作为一种可选择的具体实施方案，本发明提供了一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，即利用CRISPR-Cas9技术敲除水稻中OsLAC13基因构建水稻突变株的方法，包括如下步骤：
S1.构建miR397a/b组成型表达质粒；
S2. miR397a/b组成型表达质粒转化水稻愈伤组织；
S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化。
其中，步骤S1所述构建miR397a/b组成型表达质粒的方法如下：
miR397a的基因座位为Chr6: 28489785-28489898 [+]（MSU7.0），序列为5’-UCAUUGAGUGCAGCGUUGAUG-3’，扩增引物为5’-GAATCTAGAACACGCTCTACCTACATCGTGT-3’和5’-ATTGAATTCTCACCTCGTCTGCTGGGGACCT-3’；
miR397b的基因座位为Chr2: 3280781-3280898 [-]（MSU7.0），序列为5’-UUAUUGAGUGCAGCGUUGAUG-3’，扩增引物为5’-TAATCTAGAGAGCTCATCTAAAGTCTGA-3’ and 5’-TAAGAATTCATGCTT GTATTATAAGACATCTG-3’；
使用启动子为CaMV35S，以载体pCAMBIA1390，将克隆得到的miR397a/b成熟体片段连接入载体，构建得到miR397a/b组成型表达质粒。
作为另一种可选择的具体实施方案，本发明提供了一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，即通过高表达OsmiR397a/b来敲低OsLAC13基因的表达构建突变株的方法，包括如下步骤：
S1.构建OsLAC13敲除质粒；
S2. OsLAC13敲除质粒转化水稻愈伤组织；
S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化。
其中，步骤S1所述构建OsLAC13敲除质粒的方法如下：
用在线软件CRISPR-P (http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)在OsLAC13上设计两个靶位点。通过引物5’-ggcAgcagcaacgaagaacagagg-3’和 3’-cgtcgttgcttcttgtctcccaaa-5’；以及引物 5’-gccGtacgtgtgcgtgcaggcac-3’和 3’-atgcacacgcacgtccgtgcaaa-5’构建两个靶位点的sgRNA 表达盒；将表达盒连入以双元载体pCAMBIA-1300为骨架的pYLCRISPR/Cas9载体并转化大肠杆菌，完成OsLAC13敲除质粒的构建。
作为另一种可选择的具体实施方案，本发明提供了一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，即利用RNAi的方法沉默OsLAC13基因的表达构建突变株的方法，包括如下步骤：
S1.构建OsLAC13 RNA干涉表达质粒；
S2. OsLAC13 RNA干涉表达质粒转化水稻愈伤组织；
S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化。
其中，步骤S1所述构建OsLAC13 RNA干涉表达质粒的方法如下：
S11.以水稻总RNA为模板，利用SEQ ID NO:1和2所示引物克隆部分LAC基因，在扩增产物两端加上HimdIII和BamhI的酶切位点；
S12.分别对扩增产物和RNA干涉载体进行HimdIII和BamhI双酶切，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建成中间体质粒；
S13.再用SEQ ID NO:3和4所示引物（两端加有MluⅠ和PstⅠ酶切位点）将克隆的片段从步骤S12所述中间体质粒中再次扩增出，经PstⅠ和MluⅠ双酶切后克隆到同样酶酶切的步骤S12所述的中间体质粒中，得到OsLAC13 RNA干涉表达质粒。
其中，步骤S12所述RNA干涉载体为由载体pCAMBIA1305.2、pUC18-Pubi和pZEro-T改造而来的RNA干涉载体。该载体由华南农业大学刘耀光教授赠送。
其中，引物序列如下：
SEQ ID NO:1：5’-cttcaagcttCGAGCTCTTCTTCTCCATCG-3’；
SEQ ID NO:2：5’-cagggatccAGCGGGTAGTACGGGAAGTT-3’。
SEQ ID NO:3：5'-caccctgacgcgtggtgttacttctgaagagg-3'；
SEQ ID NO:4：5'-actagaactgcagcctcagatctaccatggtcg-3'。
本发明通过CRISPR-Cas9构建OsLAC13敲除水稻突变株，或通过RNAi技术构建OsLAC13敲低水稻突变株，并对其表型分析时发现，对OsLAC13的敲除或者敲低都能够引起水稻结实率的上升。这表明了OsLAC13是水稻结实率的负调控基因。
另外，研究发现在OsLAC13基因的编码区上有一个miRNA的结合位点，该位点可通过结合miR397a/b而造成OsLAC13基因mRNA的降解，从而达到下调OsLAC13基因表达的效果，因此miR397a/b的高表达可作为另一种下调OsLAC13的方式，也可能具有提高水稻结实率的效果。为了验证miR397a/b对OsLAC13的调控及对结实率的影响，本发明分析了过表达miR397a/b的水稻突变株中OsLAC13的含量及其结实率，发现高表达miR397a/b可显著下调OsLAC13的表达量，并提升水稻结实率。这说明用miRNA敲低OsLAC13的表达量同样可以达到提升水稻结实率的效果。
我们对上述突变株进行详细的产量相关表型分析后发现，用CRISPR-Cas9技术敲除、用RNAi技术或miR397a/b高表达敲低OsLAC13表达量的水稻突变株谷粒显著大于野生型谷粒，并且每穗粒数与千粒重都也明显高于野生型。这说明OsLAC13除了对水稻结实率有负调控作用外，同时也影响其他产量相关指标。因此通过上述技术敲除或敲低OsLAC13都可以达到增加产量的效果，尤其是通过CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13可以通过遗传手段完全消除转基因痕迹，非常适宜于投入生产使用。
综上所述可以得出结论：OsLAC13基因是水稻结实率和产量的负调控基因，用各种手段对OsLAC13基因的敲除或者敲低均可以作为培育高结实率或高产水稻的一种全新的技术手段，可显著提高水稻的结实率和产量。尤其是Crisper/CAS9技术敲除OsLAC13基因时可通过简单的遗传手段筛除转基因痕迹，而不影响对水稻结实率和产量的提升效果，安全有效，可大规模推广使用，且不会对环境造成污染，食用安全。因此对OsLAC13的表达调控可用于培育高产水稻。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次公开了OsLAC13基因和miR397a/b在培育高结实率和高产水稻中的应用。本发明研究发现用CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13或者用RNAi技术或miR397a/b高表达敲低OsLAC13基因表达可以显著提高水稻的结实率，增大谷粒大小与千粒重，增多每穗粒数，这一结果为培育高结实率或高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用；
本发明通过分子生物学技术培育高产水稻，尤其是通过CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13可以通过遗传手段完全消除转基因痕迹，不但水稻的产量高，而且不会对环境造成污染，食用安全。
附图说明
图1为qRT-PCR检测RNAi敲低OsLAC13突变株中OsLAC13的表达水平。
图2为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13突变株的基因型检测。
图3为qRT-PCR 检测过表达miR397a/b突变株中OsLAC13的表达水平。
图4为野生型与突变株结实率的比较。
图5为野生型与RNAi敲低OsLAC1 3突变株的种子大小比较。
图6为野生型与过表达miR397a/b突变株的种子大小比较。
图7为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13突变株的每穗粒数的统计比较。
图8为野生型与RNAi敲低OsLAC1 3突变株的千粒重的统计比较。
图9为野生型与过表达miR397a/b突变株的千粒重的统计比较。
图10为野生型与过表达miR397a/b突变株的和每穗有效粒数的统计比较。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 水稻总RNA提取
本实施例采用酚氯仿异戊醇法提取水稻总RNA，所用到的各种试剂均为市售。具体步骤如下：
（1）称1g水稻样品液氮研磨成细粉，加入10mLRNA zol（100ml中含有异硫氰酸胍47.2g，1M柠檬酸钠(pH7.0) 2.5ml，10%月桂酰基氮酸钠 5ml）和1mL醋酸钠（2M，pH 4.0），继续研磨；
（2）加入10mL的水饱和酚，4mL的氯仿：异戊醇（49:1，体积比）混合液，混匀后转入离心管，涡旋1min，冰上放置5分钟，然后4℃，12000rpm离心15min；
（3）离心后取上清，并向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（50：49：1，体积比）混合液，涡旋1min，冰上放置5分钟，然后4℃，12,000rpm离心15min；
（4）离心后取上清，重复步骤（3）2~3次；
（5）离心后取上清，并向上清液中加入异丙醇（异丙醇和上清液的体积比为0.6：1），冰上放置30min～1h；
（6）4℃，12,000rpm离心15min，弃上清，往管中加入1.2mL DEPC处理水溶解管底沉淀，然后每管600μl分装转入1.5mL的离心管；
（7）向上述1.5L离心管中加入600μl的酚:氯仿:异戊醇（50:49:1，体积比）混合液，上下颠倒混匀后，冰上放置5分钟，室温12,000rpm离心15min；
（8）离心后取上清，重复步骤（7）2~3次；
（9）离心后取上清，将上清液每管分装300μL分装入新的离心管中，并向分装后的离心管中加入1/10上清体积的3M NaAc（pH 5.2）和3倍上清体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜；
（10）4℃，12,000rpm离心15min，弃除上清，70%乙醇洗两次，95%乙醇洗一次，晾干，用15~30μL DEPC处理水溶解，即获得水稻总RNA，-20℃保存备用。
实施例2 OsLAC13敲除、RNA干涉和过表达miR397的水稻突变株的构建
本实施例使用实施例1的RNA为模板，进一步扩增构建了OsLAC13敲除、RNA干涉和过表达miR397的水稻突变株。
1、OsLAC13 RNA干涉表达质粒的构建
本实施例选择由载体pCAMBIA1305.2、pUC18-Pubi和pZEro-T改造而来的RNA干涉载体。
从以实施例1制备的处理样品总RNA为模板，克隆部分LAC基因，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且在扩增产物两端加上HimdIII和BamhI的酶切位点。PCR扩增反应条件参考PCR扩增反应试剂盒说明。
上游引物（SEQ ID NO:1）：5’-cttcaagcttCGAGCTCTTCTTCTCCATCG-3’；
下游引物（SEQ ID NO:2）：5’- cagggatccAGCGGGTAGTACGGGAAGTT-3’。
PCR结束后回收扩增产物并进行HimdIII和BamhI双酶切，同时对RNA干涉载体也进行HimdIII和BamhI双酶切，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来即构建成中间体质粒。
再用两端加有MluⅠ和PstⅠ酶切位点的RNAi 载体特异引物（SEQ ID NO:3：5'-caccctgacgcgtggtgttacttctgaagagg-3'；SEQ ID NO:4：5'-actagaactgcagcctcagatctaccatggtcg-3'）将克隆的片段从中间体质粒中再次扩增出，经PstⅠ和MluⅠ双酶切后克隆到同样酶酶切的中间重组质粒中，完成了LAC RNA干涉质粒的构建。
上述所涉及的扩增产物回收，双酶切反应，T4连接等反应均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。
2、OsLAC13敲除质粒的构建
用在线软件CRISPR-P (http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)在OsLAC13上设计两个靶位点。通过引物5’-ggcAgcagcaacgaagaacagagg-3’和 3’-cgtcgttgcttcttgtctcccaaa-5’；以及引物 5’-gccGtacgtgtgcgtgcaggcac-3’和 3’-atgcacacgcacgtccgtgcaaa-5’构建两个靶位点的sgRNA 表达盒。
将表达盒连入以双元载体pCAMBIA-1300为骨架的pYLCRISPR/Cas9载体并转化大肠杆菌，完成OsLAC13敲除质粒的构建。
这里的试验操作采用本领域的常规技术。实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。
3、miR397a/b组成型表达质粒的构建
MiR397包含两个家族成员，miR397a基因和miR397b基因。
其中，miR397a的基因座位为Chr6: 28489785-28489898 [+]（MSU7.0），序列为5’-UCAUUGAGUGCAGCGUUGAUG-3’，扩增引物为5’-GAATCTAGAACACGCTCTACCTACATCGTGT-3’和5’-ATTGAATTCTCACCTCGTCTGCTGGGGACCT-3’。
miR397b的基因座位为Chr2: 3280781-3280898 [-]（MSU7.0），序列为5’-UUAUUGAGUGCAGCGUUGAUG-3’，扩增引物为5’-TAATCTAGAGAGCTCATCTAAAGTCTGA-3’ and 5’-TAAGAATTCATGCTT GTATTATAAGACATCTG-3’。
本实施例选择载体pCAMBIA1390（市售），使用启动子为CaMV35S。这里的试验操作采用本领域的常规技术。
将克隆得到的miR397a/b成熟体片段连接入载体，构建成miR397a/b组成型表达质粒。
上述所涉及的实验均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。
4、OsLAC13敲除、RNA干涉和过表达miR397a/b质粒转化水稻愈伤组织
将上述构建的三种表达质粒转化根癌农杆菌（市售），所述转化方法为本领域常规操作，然后将该转化有miR397过表达质粒的根癌农杆菌菌种，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培养基（10g酵母膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，15 g琼脂）上进行划线培养，28℃黑暗培养2～3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，28℃黑暗培养2天，刮取适量菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的液体共培养基中，使之稀释至OD550 为0.3左右，28℃摇床（140 rpm）培养40分钟，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于侵染。
取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75%酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用1%次氯酸钠处理两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基（N6大量，B5微量，B5有机，铁盐，2mg/L 2,4-D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L 植物凝胶）上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2～3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养。
挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入上述制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次。侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1～2小时。然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于26℃黑暗培养2～3天。
5、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化
取出共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26℃黑暗培养14～21天。共筛选两次。挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26℃光照培养。21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行再生。
待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4～6 cm时，将其转到生根培养基上，继续在26℃光照培养。待小苗长至10～12 cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得到转基因水稻（过表达miR397）。
上述筛选培养基的配方为：N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少量+1g/L 水解酪蛋白+1g/L 脯氨酸+2mg/L（2，4-D）+30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+头孢500mg/L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH=5.8。
上述预分化培养基的配方为：MS培养基＋1g/L 水解酪蛋白＋20g/L蔗糖+1mg/L（2，4-D）+头孢500mg/L+潮霉素50mg/L＋4g/L植物凝胶，预分化培养基的终pH=5.8。
上述分化培养基的配方为：MS培养基+2mg/L（6-BA）+0.5mg/L萘乙酸＋1mg/L激动素+30g/L蔗糖+3%山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终pH=5.8。
上述生根培养基的配方为1/2 MS培养基。
本实施例中所采用的MS培养基、1/2MS培养基和N6培养基等的配方均采用本领域的常规配方。上述各培养基配方中所涉及的试剂均为市售。
实施例3 突变株水稻中OsLAC13表达量的检测以及突变株水稻种植和表型分析
1、实验方法
（1）使用实施例2中构建的三种水稻突变株，用实施例1方法获得各种突变株的总RNA。通过PrimeScript™ II（TaKaRa）反转录酶进行反转录，总RNA的使用量为500ng。
使用罗氏的实时定量PCR仪进行OsLAC13表达量的检测，对照样品为野生型植株，内参基因为Actin2。
扩增引物如下：Actin2-F (5’-GTGCTTTCCCTCTATGCT-3’) 和Actin2-R (5’-CTCGGCAGAGGT GGTGAA-3’)；OsLAC13-F (5’- CAACTGCTCAGCCCAAGACACGAGGAGGTGCCCATCATGTTC-3’)和OsLAC13-R (5’- AGCGTGTGGTTGGCGATGGCCTTCAGCTTAAACGTGTCTTGG -3’)。
（2）所有过表达和RNAi突变株表型分析均使用T3代水稻植株。CRISPER-Cas9敲除突变株使用两条染色体上OsLAC13均失活的突变株。水稻种子用水萌发，在平盘上种植一周后，转种于大田中长至谷粒成熟。其中，种子大小，千粒重比较使用完全成熟并烘干后的种子；每穗粒数统计使用完全成熟并烘干的完整的穗；结实率的统计使用成熟完整的穗。所有统计数据均为多于30棵的水稻苗的平均值。
2、结果
图1为qRT-PCR检测RNAi敲低OsLAC13突变株中OsLAC13的表达水平；其中，最左1为野生型对照，2~4为T3代突变株的不同转基因系列。结果表明，在突变株中OsLAC13的表达水平显著下降。
图2为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13突变株的基因型检测；其中，最上为野生型中OsLAC13的基因型，下面两个为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13后的两个突变株的OsLAC13基因型，它们均为移码突变。
图3为qRT-PCR 检测过表达miR397a/b突变株中OsLAC13的表达水平；其中，最左1为野生型对照，2~4为过表达miR397a突变株的不同转基因系列，5~8为过表达miR397b突变株的不同转基因系列。结果表明，在过表达miR397a/b突变株中OsLAC13的表达水平有明显的下降，尤其是在过表达miR397b突变株中OsLAC13的表达水平显著下降。
图4为野生型与突变株结实率的比较，其中，左边1为野生型，2~4为过表达miR397a的突变株的不同转基因系列，5~8为过表达miR397b突变株的不同转基因系列，9~10为RNAi敲低OsLAC13突变株的不同转基因系列，11~13为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13突变株的不同转基因系列。结果表明，于野生型相比，突变株的结实率有较明显的增长。
图5为野生型与RNAi敲低OsLAC1 3突变株的种子大小比较；其中，下排为野生型，上排为RNAi敲低OsLAC1 3突变株籽粒。可以看出，突变株的粒明显大于野生型。
图6为野生型与过表达miR397a/b突变株的种子大小比较；其中，最上为野生型，中间为过表达miR397a的突变株，最下为过表达miR397b的突变株籽粒。可以看出，突变株的籽粒明显大于野生型。
图7为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13突变株的每穗粒数的统计比较；其中，最左WT为野生型，2~3为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC13突变株的不同转基因系列。结果显示，突变株的每穗粒数显著多于野生型。
图8为野生型与RNAi敲低OsLAC1 3突变株的千粒重的统计比较；其中，最左1为野生型，2~4为RNAi敲低OsLAC1 3突变株的不同转基因系列。结果显示，突变株的千粒重显著大于野生型。
图9为野生型与过表达miR397a/b突变株的千粒重的统计比较。图10为野生型与过表达miR397a/b突变株的和每穗有效粒数的统计比较。图中，最左1均为野生型，2~4均为过表达miR397a的突变株的不同转基因系列，5~8均为过表达miR397b突变株的不同转基因系列。
Claims (1)
1.一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，其特征在于，在水稻中敲除OsLAC13基因，从而得到高结实率和/或高产水稻；所述敲除OsLAC13基因的方法为CRISPR-Cas9技术；
具体地，培育高结实率和/或高产水稻的方法包括如下步骤：
S1.构建OsLAC13敲除质粒；
S2.OsLAC13敲除质粒转化水稻愈伤组织；
S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化；
其中，步骤S1所述构建OsLAC13敲除质粒的方法如下：
在OsLAC13上设计两个靶位点，通过引物5’-ggcAgcagcaacgaagaacagagg-3’和3’-cgtcgttgcttcttgtctcccaaa-5’；以及引物5’-gccGtacgtgtgcgtgcaggcac-3’和3’-atgcacacgcacgtccgtgcaaa-5’构建两个靶位点的sgRNA表达盒；将表达盒连入以双元载体pCAMBIA-1300为骨架的pYLCRISPR/Cas9载体并转化大肠杆菌，完成OsLAC13敲除质粒的构建。
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