CN117778457A - 蛋白ZmERF018及其编码基因在玉米干旱响应中的应用 - Google Patents

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CN117778457A CN202311854017.9A CN202311854017A CN117778457A CN 117778457 A CN117778457 A CN 117778457A CN 202311854017 A CN202311854017 A CN 202311854017A CN 117778457 A CN117778457 A CN 117778457A
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郑军
王逸茹
王小东
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Abstract

本发明公开了蛋白ZmERF018及其编码基因在玉米干旱响应中的应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白ZmERF018及其编码基因在玉米干旱响应中的应用。本发明的蛋白质或调控基因的表达物质或调控蛋白质活性或含量的物质可应用在调控植物抗旱性能方面，通过敲除蛋白ZmERF018的编码基因可以提高植物的抗旱性能，对加快改良玉米品种具有积极的作用。

Description

蛋白ZmERF018及其编码基因在玉米干旱响应中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白ZmERF018及其编码基因在玉米干旱响应中的应用。
背景技术
随着自然环境的改变，人口急剧上升，急需提高作物产量，而干旱作为重要的非生物胁迫，严重影响作物的生长发育和产量。玉米(Zea mays L.)是世界上种植最为广泛的粮饲兼用的作物，整个生命周期内对干旱胁迫极为敏感，尤其是在开花授粉时期，干旱导致花粉活力下降和穗发育异常，会造成15％-25％的产量损失。挖掘玉米耐旱相关的QTL位点和基因，深入研究玉米抗旱机制，结合植物基因工程与传统育种加快玉米优良种质资源选育具有重要意义。
在双子叶和单子叶植物中，乙烯响应因子(AP2/ERF)是转录因子最大的成员之一，AP2/ERF家族成员在各种非生物胁迫响应中扮演着重要的角色，包括干旱、涝、盐、高温和冷等非生物胁迫，此外AP2/ERF还参与植物体内激素的合成。例如，敲除OsEBP89不仅提高了水稻种子萌发率，同时也降低了对干旱的敏感性。在拟南芥中过表达棉花GhERF38基因，增强了其对干旱和盐胁迫的敏感性。
鉴于AP2/ERF在植物非生物胁迫中的作用，鉴定和克隆玉米中AP2/ERF转录因子对作物抗逆机理研究和生产应用具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗旱性能。
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物干旱抗性中的应用。
本发明提供的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物干旱抗性中的应用；
2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物干旱抗性的产品中的应用；
3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育干旱抗性改变的植物中的应用；
4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育干旱抗性改变的植物的产品中的应用；
5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
a1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
a2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
a3)a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
a4)a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
上述a1)所述蛋白质的名称为ERF018。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ERF018的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ERF018的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ERF018且具有蛋白质ERF018功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gapcost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述蛋白质来源于玉米(Zea mays L.)。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质ERF018。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。
上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与前文所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
c1)编码前文所述蛋白的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，c1)所述核酸分子可为如下任一所示的DNA分子，
d1)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
d2)编码区序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码前文所述蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述蛋白的DNA分子。
上述应用中，e2)所述的表达盒可为核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体PBUE411载体。
可用现有的植物表达载体构建含有ERF018基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用ERF018基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ERF018基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得干旱抗性改变的转基因细胞系及转基因植株。携带ERF018基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
可选地，e2)所述的表达盒为SEQ ID No.4所示的DNA分子。
在一个具体的实施例中，e3)所述重组质粒PBUE411-sgRNA的核苷酸序列是SEQIDNo.4。PBUE411-sgRNA表达靶向于ZmERF018基因的sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1靶序列为：5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’(SEQ ID No.5)，该sgRNA1的靶点位于ERF018基因的第一个外显子，该sgRNA1的靶点的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第623-645位或对应序列2的第23-45位；sgRNA2靶序列为：5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’(SEQ ID No.6)，该sgRNA2的靶点位于ERF018基因的第一个外显子，该sgRNA的靶点的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第952-974位或对应SEQ ID No.2的第352-374位。
本发明还提供了一种提高植物干旱抗性的方法，所述方法包括步骤M，所述步骤M为抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默前文所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物干旱抗性。
本发明还提供了一种降低植物干旱抗性的方法，所述方法包括步骤P，所述步骤P为增强、提高或上调目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调前文所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物干旱抗性。
上述方法中，所述抑制或降低或沉默目的植物中所述蛋白质ERF018的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质ERF018的编码基因活性下降或失活。
所述基因敲除(geneknockout)是指通过基因编辑技术使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
本发明提供一种培育干旱抗性提高的植物的方法，包括抑制或降低或沉默目的植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和抑制或降低或沉默上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到干旱抗性提高的植物。
在本发明的一个实施方案中，所述培育干旱抗性提高植物的育种方法包括如下步骤：
(1)构建抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物中，获得干旱抗性低于所述受体植物的植物。
本发明中，所述植物育种的目的可包括培育干旱抗性提高的植物。
上述方法中，所述敲除目的玉米所述蛋白质的编码基因可为将玉米基因组中的SEQ ID No.3所示的所述蛋白质的编码基因进行下述至少一种突变：
1)用5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAAGCAGG-3’替换玉米基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’，从而将编码ERF018蛋白的基因敲除；用5’-ATCATGGACGACGACGCGGCGG-3’替换玉米基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’，从而将编码ERF018蛋白的基因敲除；
2)用5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAAGCAGG-3’替换玉米基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’，从而将编码ERF018蛋白的基因敲除；用5’-ATCATGGACGACGCCGATCGGCGG-3’替换玉米基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’，从而将编码ERF018蛋白的基因敲除；
3)用5’-CAGG-3’替换玉米基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’，从而将编码ERF018蛋白的基因敲除。用5’-ATCATGGACGACGCCGAGCGGCGG-3’替换玉米基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’，从而将编码ERF018蛋白的基因敲除。
本发明中，所述植物可为如下任一种：
N1)单子叶植物：
N2)禾本目植物；
N3)禾本科植物；
N4)玉蜀黍属植物；
N5)玉米。
本发明鉴定了一个玉米ZmERF018(Zm00001d018288)蛋白及其编码基因，蛋白质ZmERF018属于AP2/ERF家族的成员，鉴定和克隆玉米中AP2/ERF转录因子对作物抗逆机理研究和生产应用具有重要的意义。通过构建PBUE411-sgRNA重组质粒敲除ZmERF018基因，获得了ZmERF018基因的三个不同编辑植株，并在温室鉴定苗期的抗旱性，发现编辑植株的抗旱性提高。为抗旱玉米品种选育提供新材料，对加快改良玉米品种具有积极的作用。
附图说明
图1为PBUE411-sgRNA重组载体结构示意图。
图2为ZmERF018的敲除突变体鉴定。其中a为ZmERF018基因的结构示意图，gRNA1和gRNA2是PBUE411-gRNA的两个靶位点；b为3个ZmERF018编辑株的突变位点信息，和野生型相比，ZmERF018-1在第一个gRNA1中插入1bp，在第二个gRNA2中替换2bp和缺失1bp；ZmERF018-2在第一个gRNA1中插入1bp，在第二个gRNA2中有1bp的替换和1bp的插入；ZmERF018-3在第一个gRNA1中缺失19bp，在第二个gRNA2中有1bp的替换和1bp的插入。
图3为CRISPR/Cas9敲除ZmERF018突变体的表型鉴定。其中A为自交系Z31和ZmERF018基因敲除突变体株系叶片表型；B为自交系Z31和ZmERF018基因敲除突变体的ERF018的相对表达量；C为自交系Z31和ZmERF018基因敲除突变体的存活率。
图4为ZmERF018敲除突变体的生理变化。其中A为相对电导率；B；为相对含水量；C为过氧化氢含量；D为丙二醛含量；E为过氧化物酶含量；F为脯氨酸含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的PBUE411载体由中国农业大学陈其军馈赠，已记载于：Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ.A CRISPR/Cas9toolkitformultiplex genome editing in plants.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14:327。。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的PCBC-MT1T2载体由中国农业大学陈其军馈赠，已记载于：XingHL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ.A CRISPR/Cas9toolkitfor multiplex genome editing in plants.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14:327。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的农杆菌LBA4401已记载于：Liu Y,Zhang Y,Liu Y,Lu W,WangG.Metabolic effects of glyphosate on transgenic maize expressing a G2-EPSPSgene from Pseudomonas fluorescens.J Plant Biochem Biot.2015:24(2):233–241。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例采用EXCEL统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用T-Test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例1、ZmERF018基因突变体获得
1、ZmERF018基因的克隆
将生长到二叶一心的玉米自交系B73幼苗叶片立即用液氮速冻，利用RNAEasyFast Plant Tissue kit(TIANGEN)试剂盒提取RNA，利用HiScript III 1stStrandcDNA Synthesis Kit(Vazyme)试剂盒进行反转录，合成第一链cDNA。以cDNA模板，根据ERF018基因的cDNA序列设计同源重组引物ERF018-CDS-F/ERF018-CDS-R进行PCR扩增，扩增引物序列如下：
ERF018-CDS-F：5’-ATGACGTCGTCGTCGTGG-3’；
ERF018-CDS-R：5’-CTAGTATCTGAAGTAGGAGTC-3’。
PCR扩增反应体系见表1。PCR扩增程序：94℃2min；98℃10s；60℃30s；68℃1min；68℃7min；35个循环。
表1、PCR扩增反应体系
KOD Buffer 15μL
dNTP 5μL
ddH2O 6μL
KOD FOX 1μL
Forward Primer 1μL
Reverse Primer 1μL
cDNA 1μL
总体系 30μL
将得到的PCR产物送测序，ZmERF018的CDS序列长度为717bp，编码238个氨基酸的蛋白，属于AP2/ERF家族成员。ZmERF018基因在玉米B73的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的ZmERF018蛋白。玉米B73的基因组DNA中，编码ZmERF018蛋白的基因组基因如序列表的SEQ ID No.3所示。ZmERF018基因的结构示意图见图2中a。
2、玉米叶片DNA的提取
利用双液法植物DNA提取试剂盒提取玉米叶片DNA。取幼苗叶片2-10mg装到含有钢珠的灭菌2mL离心管中，液氮冷冻并在植物组织破碎仪上打成粉末，在离心管中加入100μLPDA混匀，50℃水浴5-15min，间或摇动，加入100μL PDB轻柔翻转混匀，室温静置5min，12000rpm离心10min。移液器吸取上清约80-100μL，转移到新的1.5mL离心管中，加入等体积的无水乙醇混匀，静置10min，12000rpm离心2min，弃上清，加入800μL 70％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min沉淀DNA，弃上清，凉置使其残余乙醇发挥，加入20-100μL灭菌水，获得玉米叶片DNA。
3、ZmERF018的CRISPR/Cas9敲除突变体的获得
在ERF018编码基因的第一个外显子上选择两个脱靶率低同时打靶率高的靶序列作为构建载体的靶序列，连接PBUE411载体，随后转化玉米自交系Z31。
1)ZmERF018靶点序列的获得
利用CRISPR/Cas9系统，对ERF018的编码区进行敲除。利用GuideDesignResources(https://zlab.bio/guide-design-resources)设计ZmERF018的特异靶序列sgRNA1(SEQ ID No.5)和sgRNA2(SEQ ID No.6)，设计含有靶序列的引物，引物信息如下：
ZmERF018-MT1-BsF:5’-ATATATGGTCTCTGGCGAGACGGAGGCCGGGAGCAGC-3’；
ZmERF018-MT1-F0:5’-GAGACGGAGGCCGGGAGCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
ZmERF018-MT2-R0:5’-CCGTCGGCGCCGTCCATGATCGCTTCTTGGTGCC-3’；
ZmERF018-MT2-BsR:5’-ATTATTGGTCTCTAAACCCGTCGGCGCCGTCCATGAT-3’。
以中间载体PCBC-MT1T2为模板，ZmERF018-MT1-F0和ZmERF018-MT2-R0为引物进行PCR，用第一轮PCR产物为模板，ZmERF018-MT1-BsF和ZmERF018-MT2-BsR为引物做第二轮PCR，PCR扩增如下：KOD Buffer 15μL；dNTP 5μL；ddH2O 7.4μL；KOD FOX0.6μL；第一轮PCR扩增引物ZmERF018-MT1-F0 0.75μL，ZmERF018-MT2-R0 0.75μL；第二轮PCR扩增引物ZmERF018-MT1-BsF 0.75μL，ZmERF018-MT2-BsR 0.75μL；PCBC-MT1T2 0.5μL。
PCR扩增程序：94℃2min；98℃10s；60℃30s；68℃1min；68℃7min；35个循环，得到含有酶切位点的靶序列。
2)PBUE411-sgRNA重组质粒的构建
利用BsaI-HF在37℃水浴分别酶切PBUE411载体和第二轮PCR产物2小时，酶切体系如下：10Cutsmart 5μL；BsaI-HF 1μL；PBUE411/PCR产物10μL；ddH2O 34μL。之后利用连接酶Ligation Mix酶将PBUE411和PCR产物进行同源重组，连接体系如下：PBUE411 5μL，PCR产物1μL，Ligation Mix 10μL。
上述反应在室温条件下进行30分钟后，立即将反应体系加入到大肠杆菌TOP10中，冰浴30分钟，随后立即在42℃水浴90秒后，冰浴2分钟，在超净工作台加入500μL的LB培养基，在37℃摇床摇1小时，5000rpm离心2min沉淀菌体，在超净工作台将菌体均匀涂布到LB培养基上，37℃培养箱培养12小时。在超净工作台挑取单克隆进行PCR扩增和测序，PCR扩增引物如下：
OsU3-FD3:5’-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’；
TaU3-RD:5’-CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC-3’。
将测序正确的单克隆进行转化本实验的农杆菌LBA4401，首先将测序正确的单克隆在YEB液体培养基中进行扩繁，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，将质粒加入到农杆菌LBA4401中冰浴30分钟后，液氮速冻5分钟，37℃水浴2分钟，随后冰浴5分钟，在超净工作台加入800μL的YEB培养基，在28℃摇床摇菌5小时，5000rpm离心2min沉淀菌体，在超净工作台将菌体均匀涂布YEB培养基上，28℃培养箱培养24小时,挑取单克隆在YEB液体培养基中进行扩繁，采用质粒提取试剂盒(金连宝生物技术有限公司，货号DP105-03)提取阳性克隆的质粒，得到重组载体PBUE411-sgRNA。
重组质粒PBUE411-sgRNA的结构示意图如图1。重组质粒PBUE411-sgRNA含有核苷酸序列是SEQ ID No.4的表达盒。PBUE411-sgRNA表达靶向于ZmERF018基因的sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1靶序列为：5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’(SEQ ID No.5)，该sgRNA的靶点位于ERF018基因的第一外显子，该sgRNA1的靶点的核苷酸序列是SEQID No.3的第623-645位或对应SEQ ID No.2的第23-45位；sgRNA2靶序列为：5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’(SEQ ID No.5)，该sgRNA2的靶点位于ERF018基因的第一外显子，该sgRNA的靶点的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第952-974位或对应SEQID No.2的第352-374位。
PBUE411-sgRNA含有核苷酸序列是SEQ ID No.4的第1-1781位的sgRNA基因表达盒，sgRNA1基因如SEQ ID No.4的第465-487位核苷酸所示，第84-463位核苷酸为启动sgRNA1基因转录的启动子，第564-854位核苷酸为终止sgRNA1基因转录的终止子，sgRNA2基因如SEQ ID No.4的第1380-1402位核苷酸所示，第855-1378位核苷酸为启动sgRNA2基因转录的启动子，第1479-1769位核苷酸为终止sgRNA2基因转录的终止子。
PBUE411-sgRNA中，Cas9蛋白的表达盒是核苷酸序列是SEQ ID No.4的第1782-8699位，SEQ ID No.4中的第3909-8009位核苷酸编码Cas9蛋白，第1782-3773位核苷酸为启动Cas9蛋白基因转录的启动子，第8605-8699位核苷酸为终止Cas9蛋白基因转录的终止子。
3)TO代转基因植株的获得
取授粉10天左右的的玉米，利用75％的酒精浸泡3～5分钟，之后用蒸馏水冲洗干净。在超净台用解剖刀将籽粒中的胚挑出，用洗胚液洗胚两次，用移液枪吸出洗胚液，加入含有重组质粒PBUE411-sgRNA侵染菌液并混匀，42℃水浴2分钟，在黑暗静置5分钟，吸出菌液并倒入培养基，使胚凹面向下，晾干培养基，将培养基置于23℃培养箱3天。将培养3天的胚转移至新的培养基，放入28℃黑暗条件下培养7天，在将培养7天的胚进行切芽处理，并转移到新的培养基，放入28弱光条件下培养14天，之后将培养14天的幼苗转移到培养瓶中，放入28℃正常光照条件下培养，直至长出完整的根、叶等组织，在移栽到花盆中继续生长，获得T0代转基因苗
将得到的T0代转ZmERF018基因敲除玉米培养到T3代，每代培养的玉米经过自交后进行PCR和测序鉴定，筛选纯合株系。筛选得到3个纯合突变型植株(即两条同源染色体发生的突变一致)，分别命名为ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3株系。
利用双液法提取T3代的植株叶片DNA，利用特异测序引物ERF018-F/ERF018-R进行扩增，以野生型玉米自交系Z31的DNA作为对照，将PCR产物送公司测序。
测序引物：ERF018-F：5’-GCCATTCTCGAGTTGAACCT-3’；
ERF018-R：5’-CCCTCTCTCTCATGCACTCA-3’。
PCR扩增体系见下表2。PCR扩增程序：95℃3min；95℃15s；60℃15s；72℃80s；72℃5min；35个循环。
表2、测序引物进行PCR扩增的反应体系
2×Es Taq Master Mix 12.5μL
Forward Primer 1μL
Reverse Primer 1μL
DNA 2μL
DMSO 0.5μL
ddH2O 13μL
结果如图2中b所示：共鉴定到3个不同的编辑株系：ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3。
经测序鉴定，与玉米自交系Z31的基因组DNA相比，ZmERF018-1植株(用ZmERF018-1表示)的两条同源染色体中，编码ZmERF018蛋白的基因均发生了如下突变，第一个靶点sgRNA发生突变，“5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’”突变为“5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAAGCAGG-3’，突变位点对应于SEQ ID No.3的第640-641位(对应于SEQID No.2的第40-41位)；第二个靶点sgRNA发生突变，“5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’”突变为“5’-ATCATGGACGACGACGCGGCGG-3’，突变位点对应于SEQ ID No.3的第961-962位、第964-965位和第968-969位(对应于SEQ ID No.2的第361-362位、第365-366和368-369)，编码蛋白序列中甘氨酸突变为天冬氨酸，天冬氨酸变为丙氨酸，甘氨酸变为谷氨酸”；从而将编码ZmERF018蛋白的基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2中b。
经测序鉴定，与玉米自交系Z31的基因组DNA相比，ZmERF018-2植株(用ZmERF018-2表示)的两条同源染色体中，编码ZmERF018蛋白的基因均发生了如下突变，第一个靶点sgRNA发生突变，“5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’”突变为“5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAAGCAGG-3’，突变位点对应于SEQ ID No.3的第639-640位(对应于SEQID No.2的第39-40位)；第二个靶点sgRNA发生突变，“5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’突变为“5’-ATCATGGACGACGCCGATCGGCGG-3’，突变位点对应于SEQ ID No.3的第961-962位和第968-969位(对应于SEQ ID No.2的第361-362和368-369位)，编码蛋白序列中甘氨酸变为精氨酸”；从而将编码ZmERF018蛋白的基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2中b。
经测序鉴定，与玉米自交系Z31的基因组DNA相比，ZmERF018-3植株(用ZmERF018-3表示)的两条同源染色体中，编码ZmERF018蛋白的基因均发生了如下突变，第一个靶点sgRNA发生突变，“5’-AGACGGAGGCCGGGAGCAGCAGG-3’”突变为“5’-CAGG-3’,突变位点对应于SEQ ID No.3的第623-641位(对应于SEQ ID No.2的第22-41位)，编码蛋白序列中缺少了6个氨基酸”；第二个靶点sgRNA发生突变，“5’-ATCATGGACGGCGCCGACGGCGG-3’突变为“5’-ATCATGGACGACGCCGAGCGGCGG-3’，突变位点对应于SEQ ID No.3的第961-962位和第968-969位(对应于SEQ IDNo.2的第361-362和368-369位),编码蛋白序列中甘氨酸变为天冬氨酸，天冬氨酸变为谷氨酸，甘氨酸变为精氨酸”；从而将编码ZmERF018蛋白的基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2中b。
4、玉米叶片RNA的提取及荧光定量RT-PCR定量分析
待测植株：基因编辑植株ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3，野生型对照玉米自交系Z31。
使用RNA Easy Fast Plant tissue kit(TIANGEN)分离上述植株叶片RNA并根据RNase-free DNase I(Lany)的说明去除样品中的基因组DNA，RNA浓度和纯度使用分光光度计(Nanodrop 2000C)和琼脂糖凝胶电泳测定，利用HiScript III 1st StrandcDNASynthesis Kit(Vazyme)从DNase l处理的1μg RNA中合成第一链cDNA。RT-qPCR采用SYBRGreen Fast qPCR Mix(Vazyme)和Bio-Rad CFX96仪进行，以GAPDH为内参基因。qRT-PCR引物如下：
ERF018-Q-F：5’-TTGGTGGAGAAAGAGGAGCC-3’；
ERF018-Q-R：5’-CATCCAGCATGTCATCGTCG-3’；
GAPDH-F：5’-AGGATATCAAGAAAGCTATTAAGGC-3’；
GAPDH-R：5’-GTAGCCCCACTCGTTGTCG-3’。
qRT-PCR扩增反应体系见表3。qRT-PCR扩增程序：95℃30S；95℃10s；60℃30s；35个循环；95℃15s；60℃60s；95℃15s。
表3、qRT-PCR扩增反应体系
2×ChamQ SYBR qPCR 10μL
Forward Primer 0.4μL
Reverse Primer 0.4μL
Template cDNA 2μL
ddH2O 7.2μL
实施例2、ZmERF018的CRISPR/Cas9敲除突变体苗期耐旱性鉴定
将玉米自交系Z31和转基因株系ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3植株种植到一个花盆中(长×宽×高＝60×25×15cm)，每个株系播种32粒，播种完之后均匀的浇2L水，控水20天后，自交系Z31和转基因表现出明显的表型差异，再均匀的浇2L水，鉴定ZmERF018的CRISPR/Cas9敲除突变体耐旱性。所有种植材料均在28℃光照周期为16小时光照/8小时黑暗的温室中种植，设置三个生物学重复。
qRT-PCR检测敲除株系中ZmERF018基因的表达，在敲除株系ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3中ERF018的表达量显著下降(图3中B)；在控水20天后，自交系Z31叶片完全干枯，而转基因株系叶片呈现卷曲或萎蔫表型(图3中A)；干旱复水3天后，分别统计自交系Z31和ZmERF018基因的转基因存活株数，转基因株系ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3植株存活率显著高于自交系Z31(图3中C)。
实施例3、ZmERF018的CRISPR/Cas9敲除突变体抗旱性评价
将玉米自交系Z31和转基因株系ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3植株种植到一个花盆中(长×宽×高＝60×25×15cm)，每个株系播种32粒，在28℃光照周期为16小时光照/8小时黑暗的温室中种植。研究设置两种处理方式，正常处理组(WW)在玉米播种后正常浇水，实验组(Drought)只在玉米播种后浇水一次。待玉米植株生长至15-16天后，实验组的自交系和敲除突变体出现明显表型差异时取样，测定干旱相关生理指标。每种处理方式设置三个生物学重复。
将0.5g叶片置于15mL装有去离子水中，浸泡12h后测定相对电导率(Relativeelectrolytic leakage)，电导仪测定浸提液电导R1，然后沸水加热30min，冷却至室温，测定浸提液电导R2，相对电导率＝R1/R2×100％。
结果显示：在正常处理下，野生型Z31和ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3的相对电导率无明显差异，而在干旱处理下野生型Z31的相对电导率明显高于敲除株系(图4中A)。
将玉米幼苗叶片用去离子水冲洗干净，称取重量W1，之后置于蒸馏水中24h，擦干叶片表面水分并称取重量W2，随后置于烘箱80℃烘干48h至重量不再发生变化，称取重量W3，测定叶片的相对含水量(Relative water content)＝(W1-W3)/(W2-W3)×100％。
结果显示：正常处理下，野生型Z31和ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3的相对含水量无明显差异，而在干旱处理下野生型Z31的相对含水明显低于敲除株系(图4中B)。
利用试剂盒测定过氧化氢含量(H2O2content)、丙二醛含量(MDA content)、过氧化物含量(POD content)、脯氨酸含量(Proline content)。称取0.1g叶片，装到含有钢珠的2.0mL的离心管中，按照试剂盒说明测定酶含量(Comin Assay Kit)。
正常处理下，野生型自交系Z31和敲除株系ZmERF018-1、ZmERF018-2、ZmERF018-3的H2O2、MDA、POD、Pro含量无明显变化，而在干旱胁迫下，野生型Z31的H2O2和MDA含量显著高于敲除株系，POD和Pro含量显著低于敲除株系(图4中C至F)，以上说明ZmERF018的敲除突变体较野生型对照组更加抗旱。
综上所述，利用CRISPR/Cas9敲除玉米ZmERF018基因可以提高玉米苗期的抗旱能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
1)在调控植物干旱抗性中的应用；
2)在制备调控植物干旱抗性的产品中的应用；
3)在培育干旱抗性改变的植物中的应用；
4)在制备培育干旱抗性改变的植物的产品中的应用；
5)在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
a1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
a2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于玉米。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与权利要求1或2所述应用中所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：
c1)编码所述蛋白的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
e1)抑制或降低或沉默所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子，
d1)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
d2)编码区序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白的DNA分子。
5.一种提高植物干旱抗性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤M，所述步骤M为抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1或2中所述应用中蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述应用中蛋白的编码基因的表达量，来提高植物干旱抗性。
6.一种降低植物干旱抗性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤P，所述步骤P为增强、提高或上调目的植物中权利要求1或2中所述应用中蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调权利要求1或2中所述应用中蛋白的编码基因的表达量，来降低植物干旱抗性。
7.一种培育干旱抗性提高的植物的育种方法，其特征在于：包括抑制或降低或沉默目的植物中权利要求要求1或2中所述应用中蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到干旱抗性提高的植物，所述干旱抗性提高的植物的干旱抗性高于所述受体植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述应用中的所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物中，获得植物干旱抗性高于所述受体植物的植物。
9.权利要求1或2中所述的蛋白质和/或权利要求3或4中所述的生物材料。
10.权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，和/或，权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下任一种：
N1)单子叶植物：
N2)禾本目植物；
N3)禾本科植物；
N4)玉蜀黍属植物；
N5)玉米。
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