CN108148858B - 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法 - Google Patents

抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108148858B
CN108148858B CN201810171347.0A CN201810171347A CN108148858B CN 108148858 B CN108148858 B CN 108148858B CN 201810171347 A CN201810171347 A CN 201810171347A CN 108148858 B CN108148858 B CN 108148858B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
osa
mir1320
heading
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810171347.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108148858A (zh
Inventor
陈华民
胡积祥
张立新
陈禹彤
余超
田芳
杨凤环
何晨阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201810171347.0A priority Critical patent/CN108148858B/zh
Publication of CN108148858A publication Critical patent/CN108148858A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108148858B publication Critical patent/CN108148858B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及水稻生长特性的改良，具体涉及抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法。所述方法包括：向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段的过表达载体，获得转基因水稻植株。通过该方法获得的水稻新品种，生殖生长加快，抽穗开花期至少提前一周，从而缩短了生长周期。

Description

抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法
技术领域
本发明涉及水稻生长特性的改良，具体涉及抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法。
背景技术
水稻是世界最重要的粮食作物之一，也是我国种植面积最广、总产量最大的主粮。水稻按照生长的气候生态型可以分为籼稻和粳稻，籼稻具有耐热、耐强光的习性，主要分布于热带和亚热带地区；粳稻具有耐寒、耐弱光的习性，分布范围更广，主要分布于北方广大地区及南方的高寒山区。粳稻的生长期相对较长，尤其在北方地区，因此，适当地促进水稻的抽穗开花、缩短生长周期更有利于水稻产量的提高。当前促进水稻开花的措施主要有喷施赤霉素，或者增施叶面肥等。
2009年，我国公开颁发了水稻的转基因安全证书，这为利用生物技术手段来改良水稻品质提供了新的契机和信号。近几年的研究成果表明，miRNAs在植物的生长发育过程中发挥重大的作用。miRNAs又因其不编码具体产物而最大程度地降低了公众对转基因事件的抵触和反对。因此，寻求和开发能够促进水稻抽穗开花的miRNAs，选育出抽穗开花期提前的水稻新品种，是提高水稻产量的一个潜在捷径。
发明内容
为满足上述领域的需求，本发明提供一种抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，通过该方法获得的水稻新品种，生殖生长加快，抽穗开花期至少提前一周。
本发明请求保护的技术方案如下：
抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，包括：向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段的过表达载体，获得转基因水稻植株。
优选地，还包括：将获得的转基因水稻植株与其它水稻植株进行杂交。
优选地，所述过表达载体通过农杆菌介导到水稻受体材料中。
优选地，所述表达载体采用双元表达载体pCXUN且含有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
用于促进水稻抽穗开花的表达载体，其特征在于，骨架载体的多克隆位点装载有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段。
优选地，所述骨架载体为双元表达载体pCXUN，还装载有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
所述的用于促进水稻抽穗开花的表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(a)以水稻基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增并分离核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段；(b)将扩增并分离的基因片段克隆到骨架载体中。
优选地，所述PCR方法采用如下引物：
上游引物osa-miR1320-F：5'-ATATGTGTTGCTGGCCTGATGCTGG-3'；
下游引物osa-miR1320-R：5'-ATGTCGTAGTTCTGTCCAACGGCTG-3'。
优选地，所述骨架载体为双元表达载体pCXUN，骨架载体上还装载有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
优选地，步骤(b)具体如下：
所述双元表达载体pCXUN用XcmI酶进行酶切，获得线性化pCXUN-XcmI载体，
用T4连接酶连接所述线性化pCXUN-XcmI载体和核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段，然后利用热激转化法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆并测序验证序列信息正确的阳性克隆，采用碱裂解法提取阳性克隆的质粒，获得osa-miR1320过表达载体。
在miRBase数据库中，osa-miR1320的mRNA序列号为MI0009717，其茎环序列对应水稻数据库(MSU7)Chr6:5073506..5073602(-)，长度为97bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；其成熟miRNAs序列在miRBase数据库中的mRNA序列号分别为MIMAT0009137(miR1320-5p)，长度为21bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；MIMAT0015286(miR1320-3p)，长度为21bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明选取包含Chr6:5073506..5073602(-)序列及其上、下游序列在内的381bp片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，构建过量表达载体并转入水稻中，获得的水稻osa-miR1320过表达植株的开花期明显比对照植株至少提早7天。
本发明优选pCXUN载体构建osa-miR1320过量表达载体，利用泛素启动子驱动osa-miR1320基因的表达，获得的转基因植株的高表达水平具有遗传稳定性。但本发明的实现并不依赖于pCXUN载体，也可以利用本领域已知的其它带选择性标记或不带选择标记的表达载体来构建osa-miR1320过量表达载体，也可以利用CaMV 35S强启动子或玉米泛素(Ubiquitin)强启动子来驱动osa-miR1320的表达。
本发明采用农杆菌侵染水稻植株，所述农杆菌包含携带SEQ ID NO：1所示基因序列的植物双元表达载体。除此之外，也可以采用基因枪法转化水稻，提取表达载体质粒，用金粉包埋后，轰击水稻组织，获得相关转基因植株。
本发明的试验数据证明，过量表达osa-miR1320可以促进水稻提早抽穗开花，可用于水稻品种的遗传改良。一方面，可以构建osa-miR1320的过量表达载体，直接转化水稻生产品种，将遗传稳定的转基因材料应用于生产。另一方面，构建osa-miR1320的过量表达载体，转化实验用水稻材料，将获得的转基因水稻材料与其它水稻生产品种进行杂交，从而达到水稻遗传改良的作用。将osa-miR1320用于作物遗传改良，培育适合我国北方日照不强的地区的水稻新品种，使植株提前开花，生长周期缩短，从而提高水稻产量。
附图说明
图1.PCR扩增osa-miR1320前体基因的电泳结果；
其中，扩增模板用水稻基因组DNA，扩增引物为osa-miR1320-F和osa-miR1320-R，扩增片段的长度为381bp。
图2.pCXUN-osa-miR1320双元表达载体的构建原理示意图；
其中，PCR扩增的osa-miR1320前体基因片段(末端加A)，插入XcmI消化后的pCXUN载体中(位于组成性启动子泛素启动子下游)，形成pCXUN-osa-miR1320双元表达载体，筛选标记为潮霉素抗性。
图3.osa-miR1320转基因T1代植株中潮霉素基因的检测结果(A)和osa-miR1320表达水平的qRT-PCR检测结果(B)；
其中，A.CK：非转基因植株，1-10：Hyg检测阳性植株；B.以非转基因植株为对照，其osa-miR1320表达水平视为1；21、38、76分别代表osa-miR1320过表达植株的不同株系。
图4.osa-miR1320转基因植株的开花情况；
其中，A.调查的第一天转基因植株的开花情况；B.调查的第七天转基因植株的开花情况；WT代表非转基因对照植株，OE20、OE21、OE36、OE38和OE76分别代表osa-miR1320过表达植株的不同株系。
图5.调查期内转基因植株开花率的数据统计分析；
其中，WT为非转基因对照植株，OE20、OE21、OE36、OE38和OE76分别代表osa-miR1320过表达植株的不同株系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
生物材料
日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)，已知水稻品种，研究用野生稻，记载在已知文献“温福平，张檀，张朝晖等.赤霉素对盐胁迫抑制水稻种子萌发的缓解作用的蛋白质组分析，《作物学报》，2009，35(3)：483-489”中，由中国农业科学院植物保护研究所保存。
上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
主要试剂
XcmI酶，购买自NEB公司；
T4连接酶，购买自Invitrogen公司；
2×Det PCR Master Mix，购买自天根生化科技(北京)有限公司；
Figure BDA0001585919310000041
qPCR Master Mix，购买自Promega公司；
载体pCAMBIA1300，购买自BioVector NTCC典型培养物保藏中心；
Figure BDA0001585919310000042
MicroRNA Reverse Transcription Kit，购自ABI公司；
E.coli DH5α感受态细胞、农杆菌EHA105感受态细胞，购自上海唯地生物技术有限公司。
以下各实施例中，未特别说明的各种试验材料、试剂、载体等，均可通过商业购买途径获得；未特别说明的各种试验操作方法，包括RNA的提取、cDNA的制备、克隆或表达载体的构建、酶切、连接、菌株转化、筛选等等，均为本领域内常规的试验手段，具体可参见分子克隆实验指南(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)或相关产品的目录、技术支持和产品说明书部分。
实施例1
利用反向遗传学方法证明osa-miR1320能够促进水稻抽穗开花
1、克隆osa-miR1320前体基因
osa-miR1320定位于水稻第6号染色体上，在Genbank中的Locus为LM381131(成熟序列osa-miR1320-5p)；在miRBase数据库中，osa-miR1320的成熟序列的序列号分别为MIMAT0009137(osa-miR1320-5p)和MIMAT0015286(osa-miR1320-3p)，核苷酸序列如SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示；茎环序列的序列号为MI0009717，其茎环序列对应水稻数据库(MSU7)Chr6:5073506..5073602(-)，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明选取包含Chr6:5073506..5073602(-)序列及其上、下游序列在内的381bp片段(Chr6:5073368..5073748)作为osa-miR1320前体基因，其碱基编码序列如SEQ ID NO：1所示。
利用CTAB法(参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325)提取水稻叶片基因组DNA，以基因组DNA为PCR模板，利用特异性引物osa-miR1320-F/R，扩增osa-miR1320前体基因，扩增产物末端加A(适用于TA克隆)。
引物osa-miR1320-F/R的核苷酸序列如下：
上游引物osa-miR1320-F(SEQ ID NO：2)：
5'-ATATGTGTTGCTGGCCTGATGCTGG-3'；
下游引物osa-miR1320-R(SEQ ID NO：3)：
5'-ATGTCGTAGTTCTGTCCAACGGCTG-3'。
PCR体系(25μL)：基因组DNA(20ng/μL)1μL，10μM引物osa-miR1320-F 0.5μL，10μM引物osa-miR1320-R 0.5μL，dNTPs 1μL，Taq酶0.2μL，10×缓冲液2.5μL，补ddH2O至25μL。
PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃ 10min；10℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图1所示，扩增条带的大小为381bp。
2、构建osa-miR1320过表达载体
采用植物转化双元载体pCXUN(经pCAMBIA1300载体修饰而成，载体的修饰方法参考文献Chen S,Songkumarn P,Liu J,Wang GL.A versatile zero background T-vectorsystem for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol.2009,150:1111–1121.doi:10.1104/pp.109.137125中所记载的方法)，用XcmI酶按照厂家说明书上的酶切体系和条件对载体pCXUN进行酶切，获得线性化的pCXUN-XcmI载体。
用T4连接酶按照厂家说明书上的连接体系和条件，连接消化后的pCXUN-XcmI载体(T突出末端)和osa-miR1320前体基因(A突出末端)，然后利用热激转化法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆并测序验证序列信息正确的阳性克隆，采用碱裂解法提取质粒，获得osa-miR1320过表达载体。
3、获得osa-miR1320过量表达的转基因水稻植株
采用电击转化法将osa-miR1320过表达载体转入农杆菌EHA105感受态细胞中，利用卡那霉素抗性筛选阳性转化子。
利用携带osa-miR1320过表达载体的农杆菌侵染水稻，获得T1代转基因植株，遗传转化方法参见“周蕾，陈晨.农杆菌介导水稻遗传转化方法的优化研究，农业科学，2015，35(17)33-34”。通过潮霉素基因的PCR检测以及osa-miR1320的qRT-PCR检测，筛选得到osa-miR1320表达明显增高的植株。
(1)潮霉素基因的PCR检测：用CTAB法分别提取每个转基因植株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用如下引物：
Hyg上游引物序列：5’-TCCATACAAGCCAACCACG-3’，
Hyg下游引物序列：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’，
按照下列PCR体系和程序进行扩增，
PCR体系(20μL)：基因组DNA(20ng/μL)1μL，10μM Hyg上游引物0.5μL，10μM Hyg下游引物0.5μL，2×Det PCR Master Mix 10μL，ddH2O 8μL。
PCR程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图3(A)所示，其中CK为非转基因植株，1-10为Hyg检测阳性的植株。
(2)osa-miR1320的qRT-PCR检测：提取Hyg检测阳性植株的RNA，采用茎环引物法反转录成miRNA(参照
Figure BDA0001585919310000062
MicroRNA Reverse Transcription Kit的使用说明书)，采用的反转录茎环引物序列为：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGAAC-3’，
定量PCR检测引物为：
反向引物：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGAAC-3’
正向引物：5’-GCTGCGTGGAACGGAGGA-3’，
按照如下反应体系和程序进行实时定量PCR，
PCR体系(20.0μL)：
Figure BDA0001585919310000061
qPCR Master Mix 10.0μL，10μM正向引物0.4μL，10μM反向引物0.4μL，cDNA(20ng/μL)2.0μL，无核酸酶水7.2μL。
PCR程序：预变性95℃，10min；然后95℃15s，60℃60s，反应40个循环。
结果如图3(B)所示，21、38、76代表不同的osa-miR1320过表达株系，其osa-miR1320表达水平为非转基因植株的20倍左右，这里将非转基因植株中的osa-miR1320表达水平视为1。
4、检测T2代转基因植株的开花
于转基因植株出现抽穗开花而对照植株并没有开花时开始统计植株的抽穗、开花情况，每隔3-5天统计一次，直至对照植株基本完全抽穗开花为止。
结果如图4和图5所示，当转基因植株开始抽穗开花时，对照植株还没有抽穗开花。一周后，转基因植株的开花率基本达到80％～100％，而对照植株的开花率则仅仅维持在14％左右。两周后，转基因植株的开花率全部达到100％，而对照植株的开花率在三周后才达到97％，转基因植株的开花期明显比对照植株至少提早7天。
实施例2
按照实施例1步骤3中的方法将osa-miR1320过表达载体转入实验用水稻材料中，然后通过杂交将osa-miR1320过表达性状转移到生产品种上，筛选osa-miR1320表达水平较高的植株，构建osa-miR1320高表达稳定遗传株系。
例如，将实施例1中获得的过量表达osa-miR1320的转基因水稻与生产品种杂交，收获杂交一代的种子，杂交二代分离群体中挑选农艺学性状接近杂交用生产品种，且osa-miR1320表达量高的植株；挑选出的植株经过自交后，再继续挑选农艺学性状更接近杂交用生产品种，且osa-miR1320表达量高的植株；如此循环几次后，使最终筛选到植株的农艺学性状与生产品种非常接近，且osa-miR1320的表达量明显增高的植株，即为osa-miR1320高表达的稳定遗传株系。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法
<130> P170643/ZWB
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320前体基因的编码序列
<400> 1
atatgtgttg ctggcctgat gctggtgctt actgctttgc aaacttgtgc cttcgctgag 60
atagcttgcc cactgtagaa gatagctcct gcgcttcgcc gttttcgatg gccgcggctt 120
ttcatttgct ccctttaaga tcaaagttag gcctactttg gaacggagga attttatagg 180
atttttgcgg gaattttaac agattcctgt aaaattcatt cgttccaatg tagccctatt 240
agctttggca agcaagccag ttgagttaca tgtgctctag ctagactaca agaaggaaat 300
caggttcaag atgggagctg tgtatcttca tcaatgggtg gccgggtttt cagtggcagc 360
cgttggacag aactacgaca t 381
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增osa-miR1320前体基因的上游引物序列
<400> 2
atatgtgttg ctggcctgat gctgg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增osa-miR1320前体基因的下游引物序列
<400> 3
atgtcgtagt tctgtccaac ggctg 25
<210> 4
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320茎环序列
<400> 4
ttaggcctac tttggaacgg aggaatttta taggattttt gcgggaattt taacagattc 60
ctgtaaaatt cattcgttcc aatgtagccc tattagc 97
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320-5p成熟序列
<400> 5
uggaacggag gaauuuuaua g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320-3p成熟序列
<400> 6
uguaaaauuc auucguucca a 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hyg上游引物序列
<400> 7
tccatacaag ccaaccacg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hyg下游引物序列
<400> 8
cctgacctat tgcatctccc 20
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320的反转录茎环引物序列
<400> 9
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactggaac 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320定量PCR检测的反向引物序列
<400> 10
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactggaac 50
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> osa-miR1320定量PCR检测的正向引物序列
<400> 11
gctgcgtgga acggagga 18

Claims (7)

1.抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，包括：向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段的过表达载体，获得转基因水稻植株。
2.根据权利要求1所述的抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，还包括：将获得的转基因水稻植株与其它水稻植株进行杂交。
3.根据权利要求1所述的抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，所述过表达载体通过农杆菌介导到水稻受体材料中。
4.根据权利要求1所述的抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，所述表达载体采用双元表达载体pCXUN且含有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
5.根据权利要求4所述的抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，所述过表达载体的构建包括如下步骤：
(a)以水稻基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增并分离核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段；(b)将扩增并分离的基因片段克隆到双元表达载体pCXUN中。
6.根据权利要求5所述的抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，所述PCR方法采用如下引物：
上游引物osa-miR1320-F：5'-ATATGTGTTGCTGGCCTGATGCTGG-3'；
下游引物osa-miR1320-R：5'-ATGTCGTAGTTCTGTCCAACGGCTG-3'。
7.根据权利要求5或6所述的抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法，其特征在于，步骤(b)具体如下：
所述双元表达载体pCXUN用XcmI酶进行酶切，获得线性化pCXUN-XcmI载体，
用T4连接酶连接所述线性化pCXUN-XcmI载体和核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段，然后利用热激转化法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆并测序验证序列信息正确的阳性克隆，采用碱裂解法提取阳性克隆的质粒，获得osa-miR1320过表达载体。
CN201810171347.0A 2018-03-01 2018-03-01 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法 Active CN108148858B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810171347.0A CN108148858B (zh) 2018-03-01 2018-03-01 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810171347.0A CN108148858B (zh) 2018-03-01 2018-03-01 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108148858A CN108148858A (zh) 2018-06-12
CN108148858B true CN108148858B (zh) 2020-10-23

Family

ID=62455892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810171347.0A Active CN108148858B (zh) 2018-03-01 2018-03-01 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108148858B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014100252A1 (en) * 2012-12-18 2014-06-26 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods and compositions to modulate rna processing
CN105779492A (zh) * 2016-03-28 2016-07-20 四川农业大学 水稻miR396c的应用
CN107418972B (zh) * 2017-09-04 2020-07-24 中国农业科学院植物保护研究所 一种获得生长特性改良水稻品种的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108148858A (zh) 2018-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Multi-gene co-expression can improve comprehensive resistance to multiple abiotic stresses in Brassica napus L.
US9688984B2 (en) SPL16 compositions and methods to increase agronomic performance of plants
CN107779468B (zh) 水稻nrt1.1a基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用
CN107418972B (zh) 一种获得生长特性改良水稻品种的方法
WO2011127744A1 (zh) 与植物株型相关的蛋白ipa1及其编码基因与应用
CN107400670B (zh) 控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方法、应用
CN111511916A (zh) 花期调控基因cmp1和相关的载体及其应用
CN107365370A (zh) 与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因与应用
CN104710521A (zh) 一个控制植物产量的相关基因及其应用
CN117511957A (zh) 一个水稻NBS-LRR编码新基因Piyn及其在抗稻瘟病育种中的应用
CN108341857B (zh) 一种与水稻产量相关蛋白及其编码基因与应用
CN105237631B (zh) 一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用
CN110819602A (zh) 水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中的应用
CN108148858B (zh) 抽穗开花期提前的水稻新品种的选育方法
WO2022057780A1 (zh) 一个调控植物氮素利用效率和产量的蛋白质及其应用
CN110904109B (zh) 控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用
CN103397048B (zh) 培育抗全蚀病和纹枯病转基因小麦的方法及其相关生物材料
CN113073144A (zh) 一种筛选磷高效利用小麦的分子标记caps-799、引物组和应用
CN101565702A (zh) Gif1启动子及其应用
CN107739403B (zh) 一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用
CN106349353B (zh) 一种调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用
CN116814644B (zh) 一个控制水稻分蘖数和花期的基因OsMADS22及其应用
CN117210490B (zh) 一种调控苹果属植物自花结实的pchr基因及其应用
CN108841839B (zh) 蛋白质TabZIP60在调控植物对氮素吸收中的应用
CN114524865B (zh) 一种提高玉米开花期抗旱性的dna分子及其相关生物材料与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant