CN101565702A

CN101565702A - Gif1启动子及其应用

Info

Publication number: CN101565702A
Application number: CNA2009101385087A
Authority: CN
Inventors: 何祖华; 王二涛; 李群
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2009-10-28
Anticipated expiration: 2029-04-24
Also published as: CN101565702B; WO2009129743A1

Abstract

本发明公开了一种新的植物组织特异性表达启动子——GIF1启动子及其应用，所述的启动子分离自作物籽粒灌浆基因GIF1。本发明还公开了含有所述启动子序列的载体以及宿主细胞。本发明还公开了所述启动子的用途，所述启动子对于指导目的基因在植物中组织特异性表达，尤其是在植物的种子、节间和/或根部特异性表达，从而对改良植物(尤其是作物)品质特别有用。

Description

GIF1启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域。具体而言，本发明涉及新的植物(优选作物)组织特异性表达启动子，本发明还涉及所述启动子的用途，尤其在启动目的基因在植物组织中特异性表达的基因工程中的用途。

背景技术

当前，对于农作物产量改良的研究主要集中在以下几个方面：1.增加作物的源，即加强作物的光合作用；2.增加作物库的大小；3.提高作物光合产物由源向库运输的能力。

在很多作物中，籽粒是判断该作物优劣的标准，直接关系到作物的产量和品质。尽管人们采取了许多方式来提高农作物的产量和对农作物进行改良，然而，目前还缺乏有效的手段。例如，我国的主要粮食作物水稻，当前的许多水稻高产栽培品种尤其超级杂交稻和大穗大粒品种存在籽粒灌浆不饱满的情况，这在很大程度上影响了水稻产量的进一步提高。

植物的根部对其生长、营养吸收、能量传递等均具有重要作用。改善作物根部的吸收、传输、生长等能力有助于提高作物的总体生长和品质。植物的节间是物质、能量运输的枢纽，也对植物的支撑起到一定作用。

对于除作物以外的其它植物而言，种子、节间或根本身或整株植物可能存在其经济价值或实用价值，例如观赏等。因此，组织特异性地改造这些植物，是提高其品质的有用手段。

组织特异性表达启动子可以驱动靶基因在特定的组织或细胞表达，而不影响植物其它组织的生理活动。

因此，为了改良植物(尤其是作物)的品质性状或调控作物籽粒次生代谢，本领域迫切需要开发新的特异性良好的植物组织(尤其是在种子、根部、节间等部位)特异性表达启动子，从而实现农作物或其它经济植物产量和品质的提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的植物(尤其是作物)组织特异性表达启动子，所述启动子可指导目的基因特异性地在植物籽粒、根部或节间等组织中表达。

本发明的目的还在于提供所述启动子的用途。

在本发明的第一方面提供了一种分离的多核苷酸，其选自下组：

(1)由SEQ ID NO：3的1-2379位所示的序列构成的核苷酸序列；

(2)具有SEQ ID NO：3中1-2379位所示的核苷酸序列且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；

(3)SEQ ID NO：3中1-2379位所示的核苷酸序列的片段，所述片段能启动目的基因在植物中组织特异性表达；

(4)在严格条件下能够与(1)、(2)或(3)限定的核苷酸序列杂交且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；

(5)与(1)、(2)或(3)限定的核苷酸序列有70％、80％、85％、90％、95％以上相同性且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；或

(6)与(1)-(5)任一项所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在一个优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：3的1-2379位所示。

在一个优选例中，所述植物是作物，优选禾本科植物，更优选所述的禾本科作物选自：水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。

在一个优选实施方式中，所述目的基因选自：编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白、以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。

在一个优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是与作物籽粒的品质、产量、抗性或代谢相关的基因。

在一个优选例中，所述目的基因为编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白。

在本发明的另一优选实施方式中，特异性表达所述目的基因的组织是种子、根部和/或节间，即种子、根部、与节间中的一者、两者或三者。

在一个优选例中，特异性表达所述目的基因的组织是种子。

在本发明的第二方面，提供了本发明多核苷酸作为启动植物组织特异性地表达目的基因的启动子的用途。

在一个优选例中，所述植物是作物，优选为禾本科植物，更优选所述的禾本科植物选自：水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。

在一个优选例中，所述目的基因特异性表达的组织是种子、根部和/或节间，优选种子。

在本发明的第三方面中，提供了一种载体，所述的载体含有本发明前述的多核苷酸，作为启动子元件。

在一个优选实施方式中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。

在另一个优选实施方式中，所述的目的基因选自：编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白，以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。

在一个优选例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且与所述启动子的间隔小于1000bp，优选小于500bp，更优选小于100bp，最优选小于50bp。

在本发明的第四方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有本发明前述的载体；或其基因组中整合有外源的本发明前述的多核苷酸。

在本发明的第五方面中，提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物的组织特异性表达目的基因，所述的方法包括：

(a)提供含有作为启动子元件的本发明的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物；

(b)将所述构建物导入植物细胞、组织或器官；

(c)选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组织或器官；和

(d)使所述植物细胞、组织或器官再生成植株。

在一个优选例中，所述植物为作物。

在本发明的第六方面中，提供了一种转基因植物。

在一个优选例中，所述转基因植物是用本发明前述方法制得的。

在另一优选例中，所述转基因植物是含有本发明前述的多核苷酸或本发明前述的载体的植物，优选所述转基因植物为作物，更优选为禾本科植物，更优选所述的禾本科植物选自：水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了本发明优选实施方式中的GIF1启动子的序列。

图2显示了在本发明启动子作用下GUS基因的组织特异性。其中，

A：根； B：节间；

C：伸长的节间； D：开花后2天的种子；

E：开花后4天的种子； F：开花后6天的种子；

G：开花后10天的种子； H：开花后15天的种子；

I：开花后25天的种子； J：开花后10天的颖壳；

K：开花后10天种子的横切面。

图3显示了在本发明启动子作用下GIF1基因在植物不同部位的表达情况。

图3A：突变体和野生型种子中GIF1基因的表达情况。

图3B：GIF1基因在水稻幼苗、叶片、根、节间和穗的表达情况。其中，

R：水稻幼苗的根； L：水稻叶片；

YL：水稻幼苗叶片； I：水稻节间；

P：水稻穗子； ubi-1：泛素基因。

图3C：GIF1基因在开花后不同时间的表达情况(数字指开花后天数)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从植物籽粒灌浆基因(GIF1，其序列如SEQ ID NO：3所示)中分离到一个能够指导目的基因在作物中组织特异性表达的启动子，该启动子来源于GIF1基因(GIF1，Grain Incomplete Filling1)的上游区域，因此本发明人将之命名为GIF1启动子。所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：作物、具有经济价值或实用价值的其它植物等。

如本文所用，所述的“作物”包括但不限于：禾本科植物。更优选的，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻，小麦、大麦、玉米、高粱等。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。本发明中，所述的“组织特异性启动子”是指导基因在植物中组织特异性表达启动子，所述组织选自籽粒、根部或节间。

通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少1倍，优选高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。

如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于：改良作物籽粒品质、产量、性状或代谢相关的基因(例如编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白)、以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。

植物组织特异性表达启动子

本发明提供一种植物组织特异性表达的多核苷酸(启动子)，所述的核酸具有选自下组的序列：

(1)由SEQ ID NO：3的1-2379位所示的序列构成的核苷酸序列；

(6)与(1)-(5)任一项所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：3的1-2379位所示。

在本发明的另一个实施方式中，所述植物是作物，优选禾本科植物，包括但不限于水稻、玉米、小麦、大麦、或高粱等。

在本发明的另一个实施方式中，特异性表达所述目的基因的组织是种子、根部和/或节间，优选种子。

也可通过基因工程方法在该启动子中加入增强子等顺式作用元件达到进一步调控基因表达的作用。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。

本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在植物中组织特异性表达的功能。

本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上)相同性的核酸，所述核酸也具有指导目的基因在植物中组织特异性表达的功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。

在本发明启动子的指导下，可以使β-葡萄糖苷酶(GUS)基因特异地在水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等禾本科植物的籽粒、根部或节间中表达。因此可见，本发明的启动子是一种组织或器官特异性的启动子。所述的启动子对于定点地改良植物的品质是特别有用的。

β-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。

本发明的组织特异性启动子在理论研究和作物改良中具有重要的应用价值。这些启动子可以被应用于标记特定组织，引导特定的功能基因在特定的组织中表达，以及应用于特有组织的生长发育研究和针对性改良。本发明的启动子对于改良植物的品质或表型(尤其是作物籽粒(例如水稻籽粒))是特别有用的。

目的基因

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。

合适的目的基因包括但不限于：改良作物品质、性状或代谢相关的基因。例如，所述的目的基因选自：与作物籽粒的品质、产量、抗性或代谢相关的基因(例如作物灌浆蛋白基因(GIF1基因))，以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

载体和宿主细胞

本发明的任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。

作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。

作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

例如，可通过叶圆片转化-再生程序(如Horsch等人(1985)Science 227：1229所述)将融合基因导入植物内。也可采用其它转化方法，如PEG法、基因枪法、电激法(Horsch等人，1984，Scienc 223：496，Barton等人，1983，Cell 32：1033，Liu等人，Acta Phytophysiol Sin，21：195-205)，这也在本发明范围内。但是这些方法有操作复杂、外源基因插入的多拷贝性和不完整性以及较高比例的不育植株等缺点(Potrykus 1990，Bio/Technol，8：535-542；Finnegan和McElroy，1994，Bio/Technol.12：883-888)。

作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的双元载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、小麦等。

在本发明的一个实施方式中，本发明人构建GIF1基因的启动子连β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的克隆，并转化水稻ZH11，观察GIF1启动子启动GUS报告基因和GIF1基因的组织特异性表达。

本发明的主要优点

揭示一种可指导目的基因在植物中组织特异性表达的启动子，所述的启动子对于定点地改良植物品质特别有用。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：Alaboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A LaboratoryMannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.GIF1基因的获得

本发明人从水稻中花11(ZH11)诱变突变体库中，发现了一个水稻突变体，该突变体的种子的灌浆受到较为严重的影响，营养生长和野生型相比没有变化，但籽粒灌浆受到严重影响，种子千粒重减少15-30％，并且米质变差，本发明人将之命名为gif1(grain incomplete filling 1)，说明GIF1基因是一个重要的通过灌浆控制产量和米质的基因。

本发明人通过gif1突变体和珍汕97杂交得到基因定位群体。利用BSA(Bulked Segregant Analysis)分析法，以均匀分布在水稻12条染色体上的130对SSR引物对GIF1位点进行扫描，将GIF1位点初步定位在4号染色体长臂SRD5附近，最终将GIF1基因定位在caps-4和caps-8之间的32Kb中，经预测这段区域共包含三个基因，本发明人通过对突变体和野生型的DNA的测序，发现在突变体gif1中有一个碱基的缺失(GIF1基因组DNA序列第4588位)。

通过对GIF1的精细定位，通过测序和功能验证，得到野生型GIF1的基因组(DNA)序列见SEQ ID NO：3(包括启动子)；GIF1编码区的序列(cDNA序列)见SEQ ID NO：1；GIF1蛋白的序列见SEQ ID NO：2。

当发生前述的突变(GIF1基因组DNA序列第4588位缺失)后，突变型不表达GIF1蛋白。

实施例2.GIF1启动子序列的获得

本发明人根据已经克隆的GIF1基因，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库搜索该基因的基因组区域，经过生物软件预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)启动子，最终选择了2379bp作为启动子序列。

实施例3.载体构建和农杆菌转化

本发明人构建GIF1基因的启动子连β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的克隆，并转化水稻ZH11，观察GIF1启动子启动GUS报告基因和GIF1基因的组织特异性表达。

具体的构建方法如下：

采用以下引物：

正向引物tataagcttgatcggccatactcc(SEQ ID NO：4)和

反向引物taggatccctttgctctcacacttg(SEQ ID NO：5)，

以GIF1的基因组DNA为模板，PCR得到GIF1基因的启动子(其序列如图1所示)，并克隆载体pBI101(购自Clonetech公司，带有GUS)，再用EcoR I、Hind III酶切，回收片断，将该片断连入用相同酶切的pCAMBIA1300便得到了pCAMBIA1300+启动子+GUS的相应克隆(组织显色方法见Jeferenson，RA(1987)Plant Mol Biol Rep)。

结果见图2A-K，可知GUS基因在植株的根部、节间、种子的背腹部的微管束有特异性表达。

此外，采用RT-PCR的方法，从所述的野生型或突变型植株中抽提mRNA，通过RT-PCR分别扩增GIF1，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测。

在该实验中，用来扩增GIF1的引物为：

Gif-F：cccgccggcgacgagcaccacat(SEQ ID NO：6)和

Gif-R：ccgccggcctgaacaccctgaaga(SEQ ID NO：7)

用来扩增ubi-1的引物为：

ubi-1-F：gacggacgcaccctggctgactac(SEQ ID NO：8)和

ubi-1-R：tgctgccaattaccatataccacgac(SEQ ID NO：9)。

结果见图3A-C，其中，图3A是突变体gif1和野生型的mRNA的RT-PCR检测结果；图3B是水稻不同组织中GIF1 mRNA的RT-PCR检测结果；图3C是不同时期(DAF)水稻穗部组织中GIF1 mRNA的RT-PCR检测结果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>GIF1启动子及其应用

<130>092295

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1797

<212>DNA

<213>稻属(Oryza sativa L.)

<400>1

atgggagttc ttggtagtag ggtcgcttgg gcatggctgg tccagctgct gctgctccag 60

cagctcgccg gagcgtcgca cgtcgtctac gacgacctcg agctgcaggc ggctgctacc 120

acagcggacg gcgtgccgcc gtccatcgtc gactctgagc tccggactgg gtatcacttc 180

cagccaccca agaactggat caatgatccg aacgcgccga tgtactacaa ggggtggtac 240

catctgttct accagtacaa ccccaagggc gccgtgtggg ggaacatcgt gtgggcgcac 300

tcagtgtcac gtgacctcat caactgggtg gcgctcaagc cggccatcga gcccagcatc 360

agggccgaca agtacggctg ctggtcgggg tcggcgacga tgatggccga cgggacgccg 420

gtgatcatgt acaccggcgt caaccgcccc gacgtcaact accaggtgca gaacgtggcg 480

ctgccgagga acgggtcgga cccgctgctg cgcgagtggg tgaagcccgg ccacaacccg 540

gtgatcgtgc ccgagggcgg catcaacgcg acgcagttcc gcgacccgac caccgcgtgg 600

cgcggggccg acggccactg gcggctgctc gtcggcagcc tcgcggggca gtcccgcggc 660

gtggcgtacg tgtaccggag cagggacttc cggcggtgga cgcgcgcggc gcagccgctg 720

cactcggcgc ccacggggat gtgggagtgc ccggacttct acccggtcac cgcggacggc 780

cgccgcgagg gcgtcgacac ctcgtccgcc gtcgtcgacg ccgccgcctc ggcgcgcgtc 840

aagtacgtgc tcaagaacag cctcgacctg cgccggtacg actactacac cgtcggaacg 900

tacgaccgga aggccgagcg gtacgtgccg gacgaccccg ccggcgacga gcaccacatc 960

cgctacgact acggcaactt ctacgcctcc aagacgttct acgacccggc gaagcgccgc 1020

cgcatcctct ggggatgggc caacgagtcc gacaccgccg ccgacgacgt ggccaagggc 1080

tgggccggaa tccaggcgat tccgaggaaa gtgtggctgg acccaagtgg gaagcaactg 1140

ttgcagtggc caatcgagga ggtcgagagg ctgagaggga agtggccggt cattctcaag 1200

gacagggtgg tcaagccagg ggaacacgtc gaggtgaccg ggctacaaac tgcacaggct 1260

gacgtggagg tgagcttcga ggtggggagc ctggaggcgg cggagcggct ggacccggcg 1320

atggcgtacg acgcgcagcg gctgtgcagc gcgcggggcg ccgacgcgag gggcggcgtg 1380

gggccgttcg gcctgtgggt gctcgcgtcc gcggggctgg aggagaagac cgccgtgttc 1440

ttcagggtgt tcaggccggc ggcgcgcggc ggcggcgccg gcaagcccgt cgtgctcatg 1500

tgcaccgacc ccaccaagtc atcgcgcaac ccgaacatgt accagccgac gtttgcaggg 1560

ttcgttgaca cggacatcac caacgggaag atatctctga ggagcctgat cgacaggtcg 1620

gttgttgaga gcttcggggc tggaggaaag gcgtgcatcc tgtcgagggt gtacccgtcg 1680

ctggccatcg gcaagaacgc gcgcctttac gttttcaata acgggaaggc ggagatcaag 1740

gtgtcgcagc tcaccgcgtg ggagatgaag aagccggtca tgatgaatgg agcctaa 1797

<210>2

<211>598

<212>PRT

<213>稻属(Oryza sativa L.)

<400>2

Met Gly Val Leu Gly Ser Arg Val Ala Trp Ala Trp Leu Val Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gln Gln Leu Ala Gly Ala Ser His Val Val Tyr Asp Asp

20 25 30

Leu Glu Leu Gln Ala Ala Ala Thr Thr Ala Asp Gly Val Pro Pro Ser

35 40 45

Ile Val Asp Ser Glu Leu Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln Pro Pro Lys

50 55 60

Asn Trp Ile Asn Asp Pro Asn Ala Pro Met Tyr Tyr Lys Gly Trp Tyr

65 70 75 80

His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Lys Gly Ala Val Trp Gly Asn Ile

85 90 95

Val Trp Ala His Ser Val Ser Arg Asp Leu Ile Asn Trp Val Ala Leu

100 105 110

Lys Pro Ala Ile Glu Pro Ser Ile Arg Ala Asp Lys Tyr Gly Cys Trp

115 120 125

Ser Gly Ser Ala Thr Met Met Ala Asp Gly Thr Pro Val Ile Met Tyr

130 135 140

Thr Gly Val Asn Arg Pro Asp Val Asn Tyr Gln Val Gln Asn Val Ala

145 150 155 160

Leu Pro Arg Asn Gly Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val Lys Pro

165 170 175

Gly His Asn Pro Val Ile Val Pro Glu Gly Gly Ile Asn Ala Thr Gln

180 185 190

Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Arg Gly Ala Asp Gly His Trp Arg

195 200 205

Leu Leu Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Ser Arg Gly Val Ala Tyr Val

210 215 220

Tyr Arg Ser Arg Asp Phe Arg Arg Trp Thr Arg Ala Ala Gln Pro Leu

225 230 235 240

His Ser Ala Pro Thr Gly Met Trp Glu Cys Pro Asp Phe Tyr Pro Val

245 250 255

Thr Ala Asp Gly Arg Arg Glu Gly Val Asp Thr Ser Ser Ala Val Val

260 265 270

Asp Ala Ala Ala Ser Ala Arg Val Lys Tyr Val Leu Lys Asn Ser Leu

275 280 285

Asp Leu Arg Arg Tyr Asp Tyr Tyr Thr Val Gly Thr Tyr Asp Arg Lys

290 295 300

Ala Glu Arg Tyr Val Pro Asp Asp Pro Ala Gly Asp Glu His His Ile

305 310 315 320

Arg Tyr Asp Tyr Gly Asn Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Pro

325 330 335

Ala Lys Arg Arg Arg Ile Leu Trp Gly Trp Ala Asn Glu Ser Asp Thr

340 345 350

Ala Ala Asp Asp Val Ala Lys Gly Trp Ala Gly Ile Gln Ala Ile Pro

355 360 365

Arg Lys Val Trp Leu Asp Pro Ser Gly Lys Gln Leu Leu Gln Trp Pro

370 375 380

Ile Glu Glu Val Glu Arg Leu Arg Gly Lys Trp Pro Val Ile Leu Lys

385 390 395 400

Asp Arg Val Val Lys Pro Gly Glu His Val Glu Val Thr Gly Leu Gln

405 410 415

Thr Ala Gln Ala Asp Val Glu Val Ser Phe Glu Val Gly Ser Leu Glu

420 425 430

Ala Ala Glu Arg Leu Asp Pro Ala Met Ala Tyr Asp Ala Gln Arg Leu

435 440 445

Cys Ser Ala Arg Gly Ala Asp Ala Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Gly

450 455 460

Leu Trp Val Leu Ala Ser Ala Gly Leu Glu Glu Lys Thr Ala Val Phe

465 470 475 480

Phe Arg Val Phe Arg Pro Ala Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Lys Pro

485 490 495

Val Val Leu Met Cys Thr Asp Pro Thr Lys Ser Ser Arg Asn Pro Asn

500 505 510

Met Tyr Gln Pro Thr Phe Ala Gly Phe Val Asp Thr Asp Ile Thr Asn

515 520 525

Gly Lys Ile Ser Leu Arg Ser Leu Ile Asp Arg Ser Val Val Glu Ser

530 535 540

Phe Gly Ala Gly Gly Lys Ala Cys Ile Leu Ser Arg Val Tyr Pro Ser

545 550 555 560

Leu Ala Ile Gly Lys Asn Ala Arg Leu Tyr Val Phe Asn Asn Gly Lys

565 570 575

Ala Glu Ile Lys Val Ser Gln Leu Thr Ala Trp Glu Met Lys Lys Pro

580 585 590

Val Met Met Asn Gly Ala

595

<210>3

<211>6840

<212>DNA

<213>稻属(Oryza sativa L.)

<400>3

gcttgatcgg ccatactccg aagcctcctc tgggtgagcc tcctagtgta cgataggaca 60

cgaccacata tatgaacact caacccctga acacacacaa tctttaacat acgcttgtaa 120

gatactctct ccgtctcata aaaaacgaat ctataaccgg atatgatata ttctagtacg 180

atgaatcttg aaaaatgtat gtccagattc gtagtactag gatgtgtcac atctggtatt 240

atgttggttt tttataggac ggaggtagta tataggtccc ttaatttttt tttaaaaaaa 300

gaggtacact atagacaaat ctatctatta tattattaaa ggaatagaaa aaggagcctc 360

cacgttcgct cttatggtct agaaattctc acattaatca gaaaaaaaga aaaaatagag 420

ttcatataga aatacaattt agaaaaagct gaatttcgga attaaaaaaa tgaatattag 480

aagaggagac tagagtccat atagaaatac aatttagaaa tagttgaaat tcggaattaa 540

aaaataagga atattagaag aggagactag agtccatata aaaatacaat taggaaataa 600

ctgatattca gaatttaaaa taaagaatat tagaagtaga gtatagagtc catatagaaa 660

tacaattagg aaataataga aattcggaat taaaaataag gaatattaga aatagagtat 720

agagtctata tagaaataca attaagaaaa aaaagaaatt cggaattaaa aaataaggaa 780

tattagaaat agagtataga gtctatatag aaatacaatt aagaaaaaaa aatagaaatt 840

cggaattaaa aaaatggaat attagaatta gagtatagag tccatatagg aatttaaaac 900

taactaaaat ttggaataaa cataataaaa ttaaagtaga gtttagagtc cgtataaaaa 960

tacaatttac aaataactaa aattcgagat taagaaaaat atgggaagaa gagtttaaag 1020

tcaatataga aatgcaattt agaagtaact gaaattcgaa attaaaaatt aaagaatatt 1080

gaaagataag tttagagtcc acatagaaat acaattaaaa ataataaaaa ttcagaaata 1140

aaaataaata atattggaag aagagcatag agtctatata gaaatacaat ttacagaaaa 1200

ttcggaatta aaaaatatat attaaaagac gagtctagag tgcatatagg aatatatata 1260

atttacaaat aattaaaaat tgatattaaa ataattaata actaacacgt atataaaata 1320

caatatgaat attacccatt agtagtttcg taaagttatt gcaaaattta aaattatatt 1380

gtcaatttaa tatatttgaa caatatattg agaaaacata tatgctatta tatgagagaa 1440

aatataatag ttcatagtga attgtgaaca ctgatttaaa aacaaacaga ttaacaacca 1500

catcgtttgg cttattcgtg gaataagcta aacggcatat ttgcaaacga aaagtaattt 1560

gtgaataaaa tttttatata cgtgttctta gcaatctaaa atcaaagagt gaaaaataaa 1620

cttcgatgaa aaaaacccaa aatcagcttc aaatttaaag ttaaaaattt aagtttagct 1680

gataagtata agtataaacg aaaagatgat gccgtaattt tctagacatg aaagatcaat 1740

agaacggatt gacattttcg taatggcctg tagatagaga tataagccac gagaaggagc 1800

agtgctgctc tcttctttac aagctaactt cagtgttttt atacatgaaa aatcgaattg 1860

atatctttgg gttggttcgg attgataacg atctccattc aacttttgct ttttgtttcc 1920

caatacgtta tagatggctt tgtgctccat gcggtgacca tgttaggaaa aaaaagtata 1980

tggatttagg cttgtttgag ctccagctta taaatcagag ccaatatgaa gacaaatccc 2040

aatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatatc 2100

aaaaacatga gagaaacatg caggtcacgg acgtcccagg gcacaaataa tgttaggtcg 2160

tccacacagt aatgcggccc gcccgggcct gccattcttc tgcccttttg tccgactcag 2220

caatctttga aatctcaacg cttaggggaa aaaaaacagc gtcttttcca taatgcatct 2280

cttcaccttc gcagtataaa taggaccccc tctcctctgc tcctgctcat cctcctctcc 2340

tcttctcgct ctcacttctt gtgcccaagt gtgagagcaa tgggagttct tggtagtagg 2400

gtcgcttggg catggctggt ccagctgctg ctgctccagc agctcgccgg agcgtcgcac 2460

gtcgtctacg acgacctcga gctgcaggcg gctgctacca cagcggacgg cgtgccgccg 2520

tccatcgtcg actctgagct ccggactggg tatcacttcc agccacccaa gaactggatc 2580

aatggtaatg tgaactaact gaaatgttgc caacttgcca ttgttcatgc cagaacgccg 2640

gtcaggccgt atgatttgca ggtcataggg caccacttgt ggttgtggat actggataga 2700

tgagcaaagg gaacagagtg ctctgttctt gagaattgag acgcagaatc gtgcagagta 2760

actagtacag ttttgacgac gttgttgtgt agaacatcac ctgaactaaa tggctcaact 2820

tgagtaattt atagtcagag ttgaaaatat tgacatcata gtcatatcaa atgtttggca 2880

cacaacataa attacggaca gtacactaag gcatcagttt ttatgtccat tttgtcgggt 2940

cagctagtag agtcaacgtt agcacccacg cggtcacgct gaaagaagta gcttcagaag 3000

catctcacag taaactactg agagtttgcc atctcttttt catgaagctc acacttagtc 3060

ccttcgaact gttaacagat gtactacctt gttctacttt tcttgctaat gattcttgtg 3120

acaaggctta gtcctaaccg gcaattttct tgtgcaatta tttggtgggg gtgtgctctg 3180

ctctacactg tgattgctgc tgcgtcatca acattggaaa cccgcagatc cgaacggtac 3240

gtcgttttcc caccctttat aatatatcct gtcacgaatc tctgtctact agtagtagta 3300

gtagtagtac tagaactttt atgccttgca acttgcaatt tcgttgtacg ggagaggact 3360

gtagttagtg acgcctttca tggtaggatt aaaggttcaa agcacatttt agcacgaaaa 3420

tggtaggcgc actgggactc cacatgcagg cttgcttgtc gaccgtgggg tacctagccc 3480

ctaccacggc tgatgaccac aaagttcaga aaatcttaac ttcctctcag aaagggaatt 3540

agccaaaagt tcaccttttt ctcgtacgaa atgaagcatc tatagttcta taattaatcg 3600

tgagcagtgt agagaaaaat gcaatgtaca cgcgcgatta aactgaaatg gtaattgatt 3660

tcaatgtact actaagactg aagatcattt cttgatttgg tgaaactgaa cgggtgcatg 3720

cagcgccgat gtactacaag gggtggtacc atctgttcta ccagtacaac cccaagggcg 3780

ccgtgtgggg gaacatcgtg tgggcgcact cagtgtcacg tgacctcatc aactgggtgg 3840

cgctcaagcc ggccatcgag cccagcatca gggccgacaa gtacggctgc tggtcggggt 3900

cggcgacgat gatggccgac gggacgccgg tgatcatgta caccggcgtc aaccgccccg 3960

acgtcaacta ccaggtgcag aacgtggcgc tgccgaggaa cgggtcggac ccgctgctgc 4020

gcgagtgggt gaagcccggc cacaacccgg tgatcgtgcc cgagggcggc atcaacgcga 4080

cgcagttccg cgacccgacc accgcgtggc gcggggccga cggccactgg cggctgctcg 4140

tcggcagcct cgcggggcag tcccgcggcg tggcgtacgt gtaccggagc agggacttcc 4200

ggcggtggac gcgcgcggcg cagccgctgc actcggcgcc cacggggatg tgggagtgcc 4260

cggacttcta cccggtcacc gcggacggcc gccgcgaggg cgtcgacacc tcgtccgccg 4320

tcgtcgacgc cgccgcctcg gcgcgcgtca agtacgtgct caagaacagc ctcgacctgc 4380

gccggtacga ctactacacc gtcggaacgt acgaccggaa ggccgagcgg tacgtgccgg 4440

acgaccccgc cggcgacgag caccacatcc gctacgacta cggcaacttc tacgcctcca 4500

agacgttcta cgacccggcg aagcgccgcc gcatcctctg gggatgggcc aacgagtccg 4560

acaccgccgc cgacgacgtg gccaagggct gggccggaat ccaggtaatt aaccgcacgt 4620

cctgactgca tacgtgcatg ccatttacgt gtccaccatg catgctgcca tcttcagata 4680

gtcaatatca ccatatactc cctccgttct aaaatgttta acaccattga ctttttagca 4740

catgtttgac cgttcgtctt attaaaaaaa tatgaaatat ataaaactat atgtatacat 4800

aaaagtatat ttaacaatga atcaaatgat atgaaaagaa caaataatta cttaaatttt 4860

ttgaataaga cgaatggtgt caagtatttt gaaaaaagag agtatatctt aaaagtcaaa 4920

tggaacaaca ctagcagctc aattttgctg gtaatctttg attgaatcgt gtgtttgtga 4980

tgtgatgttt taggcgattc cgaggaaagt gtggctggac ccaagtggga agcaactgtt 5040

gcagtggcca atcgaggagg tcgagaggct gagagggaag tggccggtca ttctcaagga 5100

cagggtggtc aagccagggg aacacgtcga ggtgaccggg ctacaaactg cacaggtatt 5160

cctttttgca tctgtaattc tgtaaaacta ttttttttac cccaaaaggg cattcgaata 5220

aaactgctca cacatccatg gttctgtgca tgacagtagt aattattaat aagttatcct 5280

gtttgttttg ctgtgtcctg gaccgatctt tatcttatct ggcacgcctg aagttgtgtc 5340

cagtgtgcag tgcccactga acaccaccta ctacgtgtgc cgtgtcgctt tcttctcgtc 5400

cccttttacc atctcctgca cactttgctc gtacttaact gatctcactg attctctcgt 5460

catccgcgca tgtcacgtac aacttccagg ttgcagcgtg attagtgcac atatcactaa 5520

gacactaaac aacataatta gagagatagt taaggagctc aattaatgtg ctttgttggt 5580

gacgtacgtg agtaggagct gtgatctctg atagcaagtt taatagtata gctaactact 5640

ggctctaaat tatctatagt caatctaata ataaattcat ataatagtta cctataaaca 5700

tatactaaat aattaataca tggttccaca tgtcatacac atatgcatct taaagtccgt 5760

actataattt gctgtaaatc tatagcttgt tgtttttctc tctcctcttt tatctcctcg 5820

atcgaaatgt gtttatagct ggcttatagt gtgctattgt ccctggtctg atgaagtgat 5880

catgcattct gtttggtggg gtgcaggctg acgtggaggt gagcttcgag gtggggagcc 5940

tggaggcggc ggagcggctg gacccggcga tggcgtacga cgcgcagcgg ctgtgcagcg 6000

cgcggggcgc cgacgcgagg ggcggcgtgg ggccgttcgg cctgtgggtg ctcgcgtccg 6060

cggggctgga ggagaagacc gccgtgttct tcagggtgtt caggccggcg gcgcgcggcg 6120

gcggcgccgg caagcccgtc gtgctcatgt gcaccgaccc caccaagtac gtgcggcttt 6180

tgcactttat cggtgattga tcgcactaca caataaacaa aatattgcct tgactccgtt 6240

tactgatttt ttggtatggt gcgtatgcgt gcaggtcatc gcgcaacccg aacatgtacc 6300

agccgacgtt tgcagggttc gttgacacgg acatcaccaa cgggaagata tctctgagga 6360

gcctggtacg taataggacc aaattatcgg gaaaaaagga aaatgttgca tgacggtatc 6420

ccgttcggat aaaattatac ctcttaaata ttgtccgata cctaataaat attaattggc 6480

taataaacta tttgaatggg atgatatctt tgaggtatcg tctgatacct atctgatagg 6540

tacctcatag gtatcacctc gtccgaacgg gttactgttt tataacattc atctggaaaa 6600

ggttcataaa ttgtagaata tgttttgata tcttgtgtct ctcttgtgca gatcgacagg 6660

tcggttgttg agagcttcgg ggctggagga aaggcgtgca tcctgtcgag ggtgtacccg 6720

tcgctggcca tcggcaagaa cgcgcgcctt tacgttttca ataacgggaa ggcggagatc 6780

aaggtgtcgc agctcaccgc gtgggagatg aagaagccgg tcatgatgaa tggagcctaa 6840

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tataagcttg atcggccata ctcc 24

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

taggatccct ttgctctcac acttg 25

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

cccgccggcg acgagcacca cat 23

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ccgccggcct gaacaccctg aaga 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

gacggacgca ccctggctga ctac 24

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

tgctgccaat taccatatac cacgac 26

Claims

1.一种分离的多核苷酸，其选自下组：

(1)由SEQ ID NO：3的1-2379位所示的序列构成的核苷酸序列；

(2)具有SEQID NO：3中1-2379位所示的核苷酸序列且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；

(6)与(1)(5)任一项所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述目的基因选自：编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白、以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，特异性表达所述目的基因的组织是种子、根部和/或节间。

4.权利要求1所述的多核苷酸作为启动植物组织特异性地表达目的基因的启动子的用途。

5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，作为启动子元件。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的目的基因选自：编码具有SEQID NO：2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白，以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞：

含有权利要求5-7中任一项所述的载体；或

其基因组中整合有外源的权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。

9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(a)提供含有作为启动子元件的权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物；

(b)将所述构建物导入植物细胞、组织或器官；

(d)使所述植物细胞、组织或器官再生成植株。

10.用权利要求9所述的方法制得的转基因植物。

11.含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸或权利要求5-7中任一项所述的载体的植物。

12.如权利要求11所述的植物，其特征在于，所述植物为作物，优选为禾本科植物，更优选所述的禾本科植物选自：水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。