CN107893077B - 一种玉米ZmLTP3基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了玉米ZmLTP3基因启动子序列，本发明以NCBI中公布的ZmLTP3基因上游未测通序列为基础，在未测通序列的缺口上下游合适位置设计引物，成功克隆了启动子序列，填补了NCBI中此序列的缺口，本发明的结果为后续深入研究ZmLTP3基因的作用及上游调控机制奠定了基础。

Description

一种玉米ZmLTP3基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种玉米ZmLTP3基因启动子及其应用。

背景技术

植物转脂蛋白(lipid transfer proteins,LTPs)是植物体内具有结合和转运脂类功能的一类小分子蛋白。又因其对各种脂类(如辅酶A、磷脂和脂肪酸等)都具有较高的亲和力，又被称为非专一性转脂蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)。它们是一类碱性蛋白，分子内部都含有一个由8个半胱氨酸组成的保守基序(C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C)。这8个半胱氨酸形成4对二硫键，所以转脂蛋白分子具有较高的耐高温、耐变性等特性。最初根据分子量的大小，植物LTPs成员被分为两种类型：I型和II型。此后，Edstam等根据半胱氨酸之间的距离、保守内含子的位置以及翻译后糖基磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor)的添加与否，把LTPs重新划分为A、B、C、D、E、F、G、H、J和K型。因为具有膜间转移脂分子的功能，植物LTPs最初被认为参与生物膜系统的生物合成。然而N-端信号肽的发现和胞外定位，使人们开始重新认识LTPs的功能。现有的研究表明LTPs涉及植物多种生理过程：包括参与蜡质的合成和运输、生殖器官的发育、提高植物抗性、促进细胞壁的伸长；调节果胶降解活性等^[7-9]。其中研究较多的是其在蜡质的合成和运输、生殖器官的发育以及在提高植物抗性当中的作用。

之前已有的研究中，从玉米中克隆到一个转脂蛋白家族成员ZmLTP3(GenBankaccession no.JX435819.1)，过量表达ZmLTP3基因的拟南芥表现出明显的抗盐性。但在NCBI数据库中，ZmLTP3基因上游启动子序列并未测通。

发明内容

有鉴于此，为了阐述ZmLTP3基因的作用机制，本发明克隆并测序了ZmLTP3基因上游完整的启动子序列，并对此序列进行生物信息学分析。构建融合GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。对转基因拟南芥纯合体株系进行GUS组织化学染色，验证启动子功能。本发明为深入分析ZmLTP3基因的作用机制奠定了基础。

本发明第一方面提供了玉米ZmLTP3基因启动子，其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO.1所示序列；或者是将SEQ ID NO.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.1所示序列相同启动子活性的由SEQ ID NO.1衍生的启动子序列。

本发明第二方面提供了用于PCR扩增上述玉米ZmLTP3基因启动子的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：5’-ggcgactgtgacactatcc-3’，下游引物序列为5’-aagtagggctatcgaaacagg-3’。

本发明第三方面提供了含有玉米ZmLTP3基因启动子的表达载体。

本发明第四方面提供了玉米ZmLTP3基因启动子在驱动目的基因在植物中特异性表达的应用。

本发明第五方面提供了玉米ZmLTP3基因启动子或上述表达载体在培育植物新品种中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明克隆得到了ZmLTP3基因上游1302bp的启动子序列，并通过Plantcare在线分析发现在克隆序列中含有CAAT-box、TATA-box等启动子必需作用元件，除此之外还含有众多响应生物胁迫、非生物胁迫的元件。将启动子序列与GUS报告基因相连构建植物表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥GUS组织化学染色结果表明，此启动子序列具备启动子活性。本发明以NCBI中公布的ZmLTP3基因上游序列为基础，在序列的缺口上下游合适位置设计引物，成功的克隆了启动子序列，修正了NCBI中原有序列，本发明的结果为后续深入研究ZmLTP3基因的作用及上游调控机制奠定了基础。

附图说明

图1.为NCBI数据库中ZmLTP3基因上游启动子序列，其中灰色碱基片段互为重复序列，灰色碱基片段与单下划线碱基片段互为反向重复序列，双下划线碱基序列为上下游引物序列，atg为ZmLTP3基因的起始密码子。

图2.为不同表达载体GUS基因PCR扩增验证电泳结果；其中，M为分子量标准；1～4为转ZmLTP3基因启动子株系；5为转空载体株系；6～9为转35S启动子株系。

图3.为转基因拟南芥叶片GUS组织化学染色结果图；其中，A为野生型株系；B为转空载体株系；C为转35S启动子株系；D为转ZmLTP3基因启动子株系。

具体实施方式

从现有的资料来看：研究者大多集中在对LTPs生物学功能的探究，而对其作用机理则很少有报道，尤其是对其上游的分子调控机制也鲜有系统的研究；另外，尽管第一条编码植物LTP的cDNA是从玉米中获得的，但是，之后玉米中LTP基因家族及其功能的研究很少有深入报道。本发明的实施例通过对ZmLTP3基因启动子的分析，为进一步阐明的ZmLTP3基因作用机制，尤其是其上游调控机制打下基础。

尽管玉米基因组测序工作的完成，给玉米分子生物学的研究带来了极大的方便，但是由于玉米基因组结构的复杂性，尚有一些未测通的片段，这也给相关工作的开展带来了诸多不便。例如，ZmLTP3基因上游的启动子序列就没有完全测通。本发明的实施例以NCBI中公布的ZmLTP3基因上游序列为基础，在序列的缺口上下游合适位置设计引物，成功的克隆了启动子序列，填补了NCBI中此序列的缺口，为其他研究者进行相关研究提供了便利。Blast结果表明，克隆序列与NCBI中公布的序列一致性为99％。

Plantcare在线分析表明ZmLTP3基因启动子序列除具有TATA-box及CAAT-box等典型的启动子基本顺势作用元件外，还含有多种响应生物胁迫及非生物胁迫的元件，强烈暗示ZmLTP3基因可能参与多种逆境胁迫的信号过程，这也与我们之前的试验结果相吻合。为了验证此启动子序列的功能，构建植物表达载体，转化拟南芥，GUS染色结果初步证明所克隆的序列具有启动子功能。

下面将结合具体实施例对本发明提供的玉米ZmLTP3基因启动子及其应用予以进一步说明。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明的实施例中所用的试验材料如下：

植物材料：拟南芥(Columbia生态型)、玉米B73；

菌株：大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101；

植物表达载体：pGreen0029-GUS。

实施例一

本实施例提供了一种玉米ZmLTP3基因启动子，启动子克隆及序列分析如下：

利用CTAB法提取3叶1心期的玉米叶片基因组DNA。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上下载得到ZmLTP3基因ATG上游2881bp(不包括gap的碱基数)的启动子序列，并在此序列内部缺口的两端设计上下游引物，扩增得到完整的启动子序列。上游引物序列为：5’-ggcgactgtgacactatcc-3’，下游引物序列为5’-aagtagggctatcgaaacagg-3’。得到完整序列后，在NCBI网站比对测序结果与数据库序列的异同。

得到准确、完整的启动子序列，是启动子功能分析的第一步。但是查询NCBI数据库发现，ZmLTP3基因起始密码子ATG上游-1270bp处有未测通的缺口，并且序列内部含有重复序列及反向重复序列(图1)。为了得到准确的序列，我们在缺口较远的距离设计上下游引物，扩增此片段，所述扩增条件如下：

PCR扩增反应体系为：12.5ul max buffer，0.5ul dNTP，1ul玉米B73的全基因组DNA，1ul引物F&引物R，0.5ul保真酶，7.5ul甜菜碱，共计25ul体系。

PCR扩增反应条件：94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃反应3min，35个循环，72℃延伸7min。

将PCR扩增产物切胶纯化回收目的产物，扩增得到的ZmLTP3基因上游启动子序列如序列表SEQ ID NO.1所示。测序结果表明，从上游引物到ATG只有1302bp，而不是NCBI数据库中的2492bp(不包括缺口的碱基数)。Blast结果表明测序的启动子序列与网上序列一致性为99％，序列内部没有重复及反向重复序列。

实施例二

本实施例对实施例一得到的ZmLTP3基因启动子进行了序列分析。在Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站上预测测序启动子序列中所含有的顺式作用元件。

利用Plantcare网站分析发现测序序列含有众多的顺式作用元件，结果如表1所示，包括14个TATA-box，这14个TATA-box当中离ATG最近的位于-149bp处，离ATG最远的位于-1196bp处；还含有7个CAAT-box。除了TATA-box、CAAT-box等启动子必需的元件外，该启动子片段包含许多重要的结合位点及功能元件，例如参与植物防御和逆境响应调控元件(TC-rich repeats)；参与脱落酸响应的作用元件(ABRE)；参与干旱诱导响应的元件(MBS)；参与水杨酸响应元件(TCA-element)；众多的光响应元件等。这些功能元件的存在，说明ZmLTP3基因可以响应多种逆境胁迫(包括生物逆境以及非生物逆境)的诱导，并且在逆境胁迫中发挥作用。

表1ZmLTP3基因启动子区顺式作用元件

实施例三

本实施例把实施例一所得启动子引入到植物表达载体中，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，再将将构建的质粒转入农杆菌GV3101中，然后转化拟南芥，得到转基因植物。

具体的，以测序的启动子序列为模板，在-1301bp处设计上游引物，扩增启动子片段，并把此启动子片段插入到植物表达载体pGreen0029-GUS中GUS的上游。同时，也把本实验室保存的35S启动子片段插入到上述载体中作为阳性对照。拟南芥的培养、基因转化及转基因株系的分子鉴定方法同参考文献Over-expression of ZmPti1,a homologue toPti1,increases salt tolerance of Arabidopsis thaliana(African Journal ofBiology,2010,9(5):656-662)。在GUS基因序列内部设计一对引物，用于对转基因拟南芥的PCR检测，上游引物序列为：5’-ttctgattaaccacaaac-3’，下游引物序列为：5’-cggttcgttggcaatactcc-3’。

花苞浸蘸法(蘸花法)转化拟南芥后，收取T0带种子，消毒后播在含有50μg/L卡那霉素的MS培养基上培养，种子发芽后，选取正常生长状态的幼苗进行PCR鉴定。结果如图2所示，所选择的转基因株系在400bp左右都有一条阳性条带，而野生型株系的对照扩增结果为阴性。表明所采样的拟南芥植株均为成功转化了的阳性株系，可以用来进行下一步试验。

进一步的，对ZmLTP3基因启动子功能进行了分析鉴定，作为对比，分别取转空载体、35S基因启动子载体、ZmLTP3基因启动子载体的阳性植株和野生型拟南芥叶片，参照Jefferson方法进行GUS染色，分别采取成熟阶段的不同拟南芥植株的叶片为试验材料进行GUS染色，结果如图3所示，野生型及空白载体转化的拟南芥植株叶片未显示蓝色，而转35S启动子及ZmLTP3基因启动子的转基因拟南芥株系都呈现不均匀蓝色，且转35S启动子的拟南芥株系染色较转ZmLTP3基因启动子的深，暗示ZmLTP3基因启动子的表达强度不及35S启动子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种玉米ZmLTP3基因启动子及其应用

<141> 2017-11-22

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1480

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aggcgactgt gacactatcc atggagaagg acgcgttgga gtgcgacatc tgctgcctac 60

ccttccagtc cgaagttttc atggcaagtc agattaccat gcatgtatat atacagtaaa 120

tattgatcgg tatatataca aatgtagtta gactacttta tctcttccaa taaaagtagt 180

taaactactt tatctctaac acatggtgaa accctatatc caaaatgtgg ctaaaatgga 240

ggaaaaataa acaaaatttg gcaaaagaaa cataagccaa actttcctag caactaataa 300

acaaaaaaaa attaataccc aaacctatct ttaacatatg gtgaaagcct agtttcaaaa 360

tgtagttaaa attgagcaaa aataaacaat aactaacaat tgaaacataa ttaaactaat 420

cttccataca acacattcac cattcattaa gcaactaaac atgaaaaaga gagggaatag 480

acaaaaacta accatcttat gcaacatcat ttgagaaaat agagaaaatt acctatctat 540

actcttctct ctcacatgtg aaaccctaga tccaaaatgt ggctaaaatt gagcaagaat 600

gaacaaaaat tgacaaagaa acataaacca acctttctta tccaccttct tccaagaaat 660

gaagaccaaa acctcccccc ttatattttt gtgaaatctg gacctccaaa atcgcctcca 720

atggaagctg gctgcgagca tacagttcac tgtcgcgggg aagatgggta ttttataaca 780

gacagttcac tggcggttgg tttgaaaaac cgccagtgga aacctatttc cactggcggt 840

ttttcaaacg aaccgccagt gtaatagggt ctttacactg gcggttctgt tacaccaacc 900

gccagtgaaa ataggtttcc actggcggtt ggtttgaaaa accgccagtg gaaacctatt 960

tccactggcg gttgtgttaa gataaccgcc agtgaaaatg ggtttccact ggcggttcct 1020

aaatcgggtc caccttgttt tttttactgg cgcgtgataa ctgaaaccgc cagtgataat 1080

ttatgggtgc cgcaggcttt gagctctttt ctactagtga aagtagggct atcgaaacag 1140

gtccacatga gccatgacca aacgttgaga gtgcagctag cactgctact ctagctcgct 1200

gttaaaagaa ctcctacagg ctacaggtgg tagtaattca ccggagcgat gcatctacca 1260

gcgaaccatc ttaactcctc ccctgaatgc actcacccac cacccgtaat agtaactttc 1320

cctccgctat ataaccccca cttgtgaaac cctcgtatcc ccacaacacc agaatccgcg 1380

aatcacagac gcgtctatct cagcttgctg cactgcacta ccctgccctg ccatcatatc 1440

gtacgtgagc ccggccgagc gagagcgagg gagaggcatg 1480

Claims (5)

1.玉米ZmLTP3基因启动子，其特征在于：其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列。

2.一种用于PCR扩增权利要求1所述玉米ZmLTP3基因启动子的引物对，其特征在于：所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：5’-ggcgactgtgacactatcc-3’，下游引物序列为5’-aagtagggctatcgaaacagg-3’。

3.一种含有权利要求1所述玉米ZmLTP3基因启动子的表达载体。

4.权利要求1所述的玉米ZmLTP3基因启动子在驱动目的基因在植物中特异性表达的应用。

5.权利要求1所述的玉米ZmLTP3基因启动子或权利要求3所述表达载体在培育植物新品种中的应用。

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