CN103819548A

CN103819548A - 植物耐热相关蛋白TaOPR3及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103819548A
Application number: CN201410053915.9A
Authority: CN
Inventors: 孙其信; 王飞; 彭惠茹; 倪中福; 姚颖垠; 解超杰; 尤明山; 梁荣奇; 杜金昆; 胡兆荣; 刘志勇
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-02-18
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-02-18
Also published as: CN103819548B

Abstract

本发明公开了一种植物耐热相关蛋白TaOPR3及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为TaOPR3蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐热性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述TaOPR3基因导入目的植物中，得到耐热性高于所述目的植物的转基因植株。高温这一非生物逆境是影响植物生长发育的重要因子。本发明对于培育耐高温植物具有重大价值。

Description

植物耐热相关蛋白TaOPR3及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐热相关蛋白TaOPR3及其编码基因和应用。

背景技术

植物在生长发育过程中往往受到各种非生物因子的胁迫，其中温度是影响植物生长的主要因子。从高纬度向低纬度、高海拔向低海拔引种，夏季炎热等高温胁迫往往成为植物生长的限制因子。同时随着“温室效应”的加剧，全球气温上升，植物生长面临着高温胁迫的严峻调整。

小麦是小麦属植物的统称，是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，是世界上最早栽培的农作物之一。小麦的颖果是人类的主食之一，磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干、面条等食物，发酵后可制成啤酒、酒精、伏特加或生物质燃料。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素A及维生素C等。全世界有43个国家，有35%-40%的人口以小麦为主要粮食。2010年，小麦是世界上总产量位居第二的粮食作物(6.51亿吨)，仅次于玉米(8.44亿吨)。

小麦属于喜凉习性作物，在生长季节内（尤其是生育后期）易受到异常高温天气造成的热胁迫影响，导致籽粒产量下降和品质变劣。我国的黄、淮、海河流域和新疆一带等小麦主产区灌浆期间经常出现干热风天气，此时气温高达32℃以上，可使该区域小麦种植面积的三分之二发生危害，一般使小麦减产10%-20%。在我国的北方和长江中下游的冬麦区，也时常发生高温天气，对小麦产量存在明显影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐热相关蛋白TaOPR3及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来自于小麦，命名为TaOPR3蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐热性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK

c-myc

10

EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述TaOPR3蛋白的基因（命名为TaOPR3基因）也属于本发明的保护范围。

所述TaOPR3基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第92-1264位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物耐热性相关蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物耐热性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述TaOPR3基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组载体具体可为将所述TaOPR3基因插入pB2GW7.0载体得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述TaOPR3基因导入目的植物中，得到耐热性高于所述目的植物的转基因植株。所述TaOPR3基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述TaOPR3基因具体可通过所述重组质粒导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如拟南芥突变体opr3。所述耐热性高体现为高温处理后成活率高和/或下胚轴生长能力高。所述耐热性高体现为在高温环境中成活率高和/或下胚轴生长能力高。所述高温具体为45℃以上。

本发明还保护所述TaOPR3蛋白、所述TaOPR3基因、或所述重组载体在培育耐热植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如拟南芥突变体opr3。所述耐热体现为高温处理后成活率高和/或下胚轴生长能力高。所述耐热体现为在高温环境中成活率高和/或下胚轴生长能力高。所述高温具体为45℃以上。

高温这一非生物逆境是影响植物生长发育的重要因子。本发明对于培育耐高温植物具有重大价值。

附图说明

图1为实施例1中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为pDONR221载体的结构示意图。

图3为BP反应的流程示意图。

图4为pB2GW7.0载体的结构示意图。

图5为LR反应的流程示意图。

图6为实施例2中部分植株的PCR鉴定结果。

图7为实施例2中各个株系植株中TaOPR3基因的相对表达量。

图8为实施例2中部分植株的表型照片（成活率实验）。

图9为实施例2中部分植株的表型照片（下胚轴生长活力实验）。

图10为实施例2中各个株系植株的下胚轴伸长百分比结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pDONR221载体（全称为

pDONR^TM221，结构示意图见图2，供体载体，用于BP反应）：Invitrogen Life公司，货号12536-017。pB2GW7.0载体（全称为

pB2GW7.0，结构示意图见图4，目的载体，用于LR反应）：Invitrogen Life公司，货号11791019。BP酶（用于BP反应，

BP

Enzyme Mix）：Invitrogen Life公司，货号11789013。LR酶（用于LR反应，

LR

Enzymemix）：Invitrogen Life公司，货号11791019。

根癌农杆菌GV3101：中国农业大学，参考文献：Tong SM,Ni ZF,Peng HR,DongGQ,Sun QX.Ectopic overexpression of wheat TaSrg6gene confers water stresstolerance in Arabidopsis.Plant science,2007,172(6):1079–1086。

拟南芥突变体opr3(用opr3表示)：TAIR（The Arabidopsis InformationResource），SALK_053805，http://www.arabidopsis.org/。

哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0）：参考文献：Li,Y.,Zheng,L.,Corke,F.,Smith,C.,and Bevan,M.W.(2008).Control of final seed and organ size by the DA1gene family in Arabidopsis thaliana.Genes Dev22,1331-1336。

草甘膦（BASTA）：BIO BASIC INC.公司，货号为LJ1108B0810J。

T₀代种子长成的植株为T₀代植株。T₁代种子长成的植株为T₁代植株。T₂代种子长成的植株为T₂代植株。

实施例1、TaOPR3蛋白及其编码基因的克隆

对小麦品种TAM107热处理前后的基因表达谱进行大规模的分析，获得热胁迫响应的探针号（Ta.1207.1.S1_at）,根据探针序列，以cereal网站提供的小麦基因组序列为基础进行电子克隆，得到一个假设的基因序列，根据此序列设计引物TaOPR3-F和TaOPR3-R。

TaOPR3-F：5′-CCTCCCACAATTGGCTTCT-3′；

TaOPR3-R：5′-CCAACTCCGATCACTAACCT-3′。

生长7天的TAM107幼苗，40℃热处理2h后取叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA。以cDNA为模板，用TaOPR3-F和TaOPR3-R组成的引物对进行PCR扩增（靶序列约1290bp；PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1，M表示marker2000），将PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为TaOPR3蛋白。将编码TaOPR3蛋白的基因命名为TaOPR3基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第92-1264位核苷酸所示。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组质粒的构建（gateway重组的方法构建拟南芥超表达载体）

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子，将其作为模板，采用TaOPR3-attB1和TaOPR3-attB2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

TaOPR3-attB1：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCTCCCACAATTGGCTTCT-3′；

TaOPR3-attB2：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCAACTCCGATCACTAACCT-3′。

TaOPR3-attB1中，下划线标注attB1位点。TaOPR3-attB2中，下划线标注attB2位点。

2、步骤1得到的PCR扩增产物与pDONR221载体发生BP反应（流程示意图见图3），得到含有序列2所示DNA分子的重组质粒pDONR221-TaOPR3（入门载体）。

3、步骤2得到的重组质粒pDONR221-TaOPR3与pB2GW7.0载体发生LR反应（流程示意图见图5），得到含有序列2所示DNA分子的重组质粒pB2GW7-TaOPR3（表达载体）。

二、转基因植株的获得

1、将步骤一得到的重组质粒pB2GW7-TaOPR3导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌，通过浸花法（Clough S.J.and Bent A.F.(1998),Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.，Plant J.16,735-743.）转染拟南芥突变体opr3，然后培育植株并收获种子，即为T₀代种子。

3、取T₀代种子，消毒后平铺于含125μl/L BASTA的MS固体培养基，4℃春化3天，然后在正常条件（22℃/18℃，16h光照/8h黑暗）下培养7天，筛选抗性植株（抗性植株表型：叶片深绿，根系发育正常；敏感植株表型：停止在刚发芽的状态，只有灰色的子叶并且不会变绿，最终均死亡），然后将抗性植株移栽到土壤中并继续在正常条件下培养3周，然后提取植株的基因组DNA并采用TaOPR3-F和TaOPR3-R组成的引物对进行PCR鉴定。部分阳性植株的结果见图6（M表示marker2000，opr3表示拟南芥突变体，1-5表示不同的阳性植株），说明TaOPR3基因已经插入了拟南芥的基因组。

4、取T₀代阳性植株，分别自交并收获种子，即为T₁代种子。

5、取T₁代种子，消毒后平铺于含125μl/L BASTA的MS固体培养基，4℃春化3天，然后在正常条件下培养7天，按照步骤3中的标准鉴定抗性植株和敏感植株，对于T₁代植株来说，如果满足抗性植株：敏感植株=3:1的条件，其T₀代植株为单拷贝插入株。

6、取单拷贝插入株的T₁代阳性植株，分别自交并收获种子，即为T₂代种子。

7、取T₂代种子，消毒后平铺于含125μl/L BASTA的MS固体培养基，4℃春化3天，然后在正常条件下培养7天，按照步骤3中的标准鉴定抗性植株，对于某一T₁代植株来说，如果其抽样检测的T₂代植株均为抗性植株，该T₁代植株为纯合的转基因植株，该T₁代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。

三、转空载体植株的获得

用pB2GW7.0载体代替重组质粒pB2GW7-TaOPR3进行步骤二，得到转空载体植株。

四、TaOPR3基因表达量的鉴定

分别取转基因株系（OE-1株系、OE-2株系、OE-3株系、OE-4株系和OE-5株系）的T₂代植株、哥伦比亚生态型拟南芥植株、拟南芥突变体opr3植株、转空载体植株的T₂代植株，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用TaOPR3-F2和TaOPR3-R2组成的引物对检测TaOPR3基因，采用AtActin8（AT1G49240）基因作为内参基因(用AtActin-F和AtActin-R组成的引物对扩增AtActin8)，得到各个株系植株中TaOPR3基因的相对表达量（3株植株的平均值）。

TaOPR3-F2：5′-GGCCTCAACAAGTACGTGAG-3′;

TaOPR3-R2：5′-CCGATCACTAACCTTGTACACA-3′。

AtActin-F：5′-TGCAGACCGTATGAGCAAAG-3′；

AtActin-R：5′-CCGTCATGGAAACGATGTCT-3′。

结果见图7。

五、耐热性鉴定

1、成活率

分别将转基因株系（OE-1株系、OE-2株系、OE-3株系、OE-4株系或OE-5株系）的T₂代种子（各100粒）、拟南芥突变体opr3的种子（100粒）、哥伦比亚生态型拟南芥的种子（100粒）和转空载体植株的T₂代种子（100粒）进行如下鉴定：取种子，消毒后平铺于MS固体培养基，4℃黑暗培养3天，然后正常培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗）7天，然后45℃光照培养2小时，然后正常培养4天，然后拍照并统计成活率。

部分照片见图8。OE-2株系、OE-3株系、OE-4株系和OE-5株系的表型与OE-1株系一致。转空载体植株的表型与拟南芥突变体opr3一致。成活率结果见表2。结果表明：导入并表达TaOPR3基因可以恢复拟南芥突变体opr3对高温的耐受性，热处理后保持较高的成活率，甚至超出哥伦比亚生态型拟南芥；植株对高温的耐受性与植株中TaOPR3基因的表达量成正比。

表2各个株系的成活率结果（三次重复实验的平均值）

	成活率（%）
		哥伦比亚生态型拟南芥	37.14
拟南芥突变体opr3	24.07
		转空载体植株	24.68
OE-1株系	60.19
		OE-2株系	56.15
OE-3株系	50.75
		OE-4株系	43.36
OE-5株系	40.25

2、下胚轴生长活力

分别将转基因株系（OE-1株系或OE-2株系）的T₂代种子、拟南芥突变体opr3的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子进行如下鉴定：

取种子，消毒后平铺于MS固体培养基（共9个培养皿，每个培养皿15粒种子），4℃黑暗培养3天，然后22℃黑暗培养3天（完成时测量植株的下胚轴长度，L₁），然后分成三组（每组3个培养皿），分别处理如下：

第一组（CK）：22℃黑暗培养，总时间为2天；

第二组（HA；Heat Acclimation，热锻炼）：先37℃黑暗培养2h，然后22℃黑暗培养2h，然后45℃黑暗培养2h，然后22℃黑暗培养，总时间为2天；

第三组（HS；Heat Stress，热激）：45℃黑暗培养2h，然后22℃黑暗培养，总时间为2天；

完成上述分组处理后，拍照并测量植株的下胚轴长度(L₂)。

每组处理都取每个植株L₂-L₁的平均值，第一组记录为CK（L₂-L₁），第二组记录为HA（L₂-L₁），第三组记录为HS（L₂-L₁），然后计算下胚轴伸长百分比，公式如下：

照片见图9。下胚轴伸长百分比结果见图10。结果表明，导入并表达TaOPR3基因可以恢复拟南芥突变体opr3对高温的耐受性，热处理后下胚轴保持较高的生长活力，甚至高于哥伦比亚生态型拟南芥。