CN101585870B

CN101585870B - 与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN101585870B
Application number: CN2009100878956A
Authority: CN
Inventors: 彭惠茹; 周春蕾; 孙其信; 倪中福; 姚颖垠; 梁荣奇; 解超杰; 刘志勇; 杜金昆; 秦丹丹
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: CN101585870A

Abstract

本发明公开了一种与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与植物耐热性相关的蛋白，名称为TaGAST(Triticum aestivum Gibberellin stimulatedtranscript)，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐热性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明提供的植物耐热相关蛋白TaGAST及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因TaGAST与应用。

背景技术

随着全球人口的增加，对粮食的需求日益增加。作为世界范围内主要的粮食作物，小麦是一种喜凉的C₃作物，最适生长温度为23℃-25℃，高温在我国主要麦区使小麦减产10％-20％，是小麦生产中的重要限制因素，特别是生育后期的高温胁迫严重影响了小麦的产量和品质，给人们的生活带来了很大的影响。因此，如何提高小麦的耐热性，探索小麦耐热性的机理，开发耐热相关基因，并将它们应用到小麦育种，从而培育出耐热品种已经成为当今农业科学领域中的重要课题。

GA(赤霉素)调节蛋白GAST是受GA调节并与细胞生长有关的基因。到目前为止，已在不同的植物中如拟南芥、非洲菊、矮牵牛、水稻、马铃薯等克隆了20多个GAST1同源基因，他们编码的蛋白的氨基酸同源性在50％-80％之间(Herzog等，1995)。被称为GASTs多基因家族。并且拟南芥中的GAST家族成员GASA4超表达提高了植株的耐热性，而在小麦中有关该家族成员的研究开展极少。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物耐热性相关的蛋白，名称为TaGAST(Triticum aestivumGibberellin stimulated transcript)，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐热性相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的TaGAST便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的TaGAST可人工合成，也可先合成编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的TaGAST的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第696-992位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物抗逆性相关蛋白的DNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物耐热性相关的蛋白的DNA基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第696-992位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与序列表中序列1的自5′末端第696-992位脱氧核糖核苷酸杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

序列表中的序列1由1059个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第696-992位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的TaGAST蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列1由1059个脱氧核苷酸组成。自5′端第1位至695位脱氧核苷酸为启动子区，自5′端第696位至992位脱氧核苷酸为编码框序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。自5′端第993位至1059位脱氧核苷酸为3′端非翻译区序列。

序列表中的序列2由98个氨基酸残基组成，含有GAST家族保守结构域GASA(序列2的自氨基端第37位至98位氨基酸残基)。序列表中，下划线表示GASA结构域，红色部分表示形成结构域的保守氨基酸。

扩增上述TaGAST基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物耐热性相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到5000个碱基之间；该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。如，引物1：引物1：5’-GACCAGGATGAGCAAGCCAT-3’；引物2：5’-GTGGAGTAGAGGTTGAAGAAGCC-3’。

使用TaGAST基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pCAMBIA-1300的多克隆位点间插入上述与植物耐热相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体，如pCAMBIA-35S-TaGAST。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐热性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐热性提高的转基因植物的方法，是将上述与植物耐热性相关蛋白的编码基因TaGAST导入植物中，得到耐热性提高的转基因植物。

所述与植物耐热性相关蛋白的编码基因TaGAST是通过所述重组表达载体导入植物中的。

携带有本发明的与植物耐热性相关蛋白编码基因TaGAST的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、拟南芥、非洲菊、矮牵牛或马铃薯等。

本发明提供的植物耐热相关蛋白TaGAST及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为TaGAST基因在各种胁迫处理后的表达量。

图2为TaGAST基因在热处理(HS)和赤霉素处理(GA)条件下的动态表达模式。

其中，A：赤霉素处理；B：热处理；C：赤霉素和热处理共同进行，横坐标为处理时间，纵坐标为基因的相对表达量。

图3为TaGAST基因在热处理(HS)和赤霉素处理(GA)条件下的在小麦品系中国春和TAM107中的表达模式。

其中，CK为对照，前期为1.5h，后期为48h，横坐标为处理条件，纵坐标为基因的相对表达量。

图4为转TaGAST基因株系和转空载体株系在45℃高温胁迫前后的表型。

其中，A：5#处理前照片 B：5#处理后照片 C：8#处理前 D：8#处理后 E：13#处理前 F：13#处理后 G：5#处理后的放大图片 H：8#处理后的放大图片 I：13#处理后的放大图片。

具体实施方式

下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、TaGAST基因的克隆

(1)小麦TaGAST基因序列的电子克隆

根据Affymetrixwheat Genome array所给出的探针号为“Ta.11162.1.S1_at”的探针序列，在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)网站上进行Blast比对，得到与之高度同源的小麦EST序列，下载这些EST序列，将结果中有部分重叠的序列用DNAMAN软件的sequence assembly程序进行拼接，得到了具有起始密码子和终止密码子的ORF拼接序列。利用GeneBank中的tblastx验证该片段编码的氨基酸序列是否含有预测的功能域，针对ORF设计PCR特异引物，并进行扩增。所用引物对为：5’-GACCAGGATGAGCAAGCCAT-3’和5’-GTGGAGTAGAGGTTGAAGAAGCC-3’。

(2)小麦TaGAST基因启动子克隆

小麦TaGAST基因启动子的克隆，采用BD GenomeWalker试剂盒(Clontech，CA，USA)，具体过程按说明书进行。其基因内部的引物设计为：J1-1：

5’--GATAAATTCAGACAGTACCGCTC--3’和J2-2：5’--GAAATATTTTCTTTACCAGCCCGGGC--3’。全序列信息见序列分析表中的序列1，登录Plantcare

(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站对该区域所包含的顺式作用成分进行了分析，见表1。

表1 TaGAST启动子区域所包含的顺式作用元件及其数目

实施例2、TaGAST基因的胁迫诱导表达模式

以20％聚乙二醇(PEG-6000)胁迫、250mM氯化钠(NaCl)盐胁迫、100μM H₂O₂氧化胁迫处理，以及植物激素ACC 200μM胁迫、ABA 100μM胁迫、MeJA 100μM胁迫、赤霉素(GA)胁迫和热(HS)胁迫等分别处理小麦品种TAM107(Triticum aestivumL.)和中国春(Chinese Spring，)生长十天的幼苗，并取不同处理时间的小麦叶片，提取RNA反转录cDNA后，用引物1：5’-CCACCGTCTCAAGTCTCAAC-3’和引物2：5’-ACAGGCAGCAAACTCACTC-3’。

采用实时荧光定量PCR检测TaGAST基因的时空表达特征。其中胁迫处理的具体方法为如下：

热处理和赤霉素处理：同时将2个小麦材料移入①40℃光照培养箱进行热处理(HS)；②GA(正常温度，20mg/L)处理；③HS(40℃)和GA(20mg/L)共同处理。0.5h、1h、2h、12h后迅速剪取叶片放入液氮中速冻，-70℃保存备用。

高盐(NaCl)处理：在培养瓶中加入NaCl溶液至终浓度为250mM。

聚乙二醇(PEG-6000)处理：在培养瓶中加入PEG-6000溶液至终浓度为20％(质量百分含量)。

植物激素ABA处理：把ABA(分析纯，购自Sigma-aldrich)溶解在DMSO中制成10mM贮存液，然后加入到培养瓶中至终浓度为100uM。

植物激素ACC处理：把ACC(购自Sigmal公司)溶解在水中制成10mM母液，然后加到培养瓶中至终浓度200uM。

植物激素MeJA处理：吸取一定体积的MeJA(分析纯，购自Sigma-aldrich)加入水中制成10mM母液，然后加入到培养瓶中至终浓度100μM。

氧化处理：吸取一定体积的30％的H₂O₂(购自北京化工厂)加入水中制成100uM的工作液。

在加入上述溶液以后，分别在处理0、0.5、1、6、12小时选取小麦的叶片，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存，待用。其中0小时的样品为每种处理的对照CK，同时以未处理的小麦叶片(即只生长在水中)，作为对光周期响应的对照组。

TaGAST基因在转录水平上受ABA、ACC、MeJA、H₂O₂、PEG-6000和NaCl处理的诱导。从图1可以看出在植物激素ABA处理后中国春(CS)中TaGAST基因的表达量随着处理时间的延长逐渐升高到最高水平；TAM107中TaGAST基因在12h才达到最高水平。乙烯前体ACC的处理后，中国春中TaGAST基因的表达在处理的初期(0.5小时)迅速增加到最高水平，然后随着处理时间的延长表达量下降；TAM107中TaGAST基因在2h时达到最高水平而后下降。MeJA处理初期(0.5h)，中国春中TaGAST基因的表达量迅速增加到最高水平，随后一直保持下降趋势；TAM107中TaGAST基因的表达量在12h才达到最高水平。氧化胁迫H₂O₂处理后中国春中TaGAST基因的表达量在2h增加到最高水平，随后迅速下降，TAM107中TaGAST基因的表达量先在0.5h有一显著升高，在12h才达到最高水平。干旱胁迫PEG处理后，中国春中TaGAST基因在处理的初期(0.5h)表达到最高水平；TAM107中TaGAST基因的表达量在12h才达到最高水平。高盐NaCl处理时，中国春和TAM107中TaGAST基因表达量都在1h时升到最高，然后开始下降，中国春中表达量下降较剧烈，TAM107中表达量下降较缓慢。

从图2中可以看出中国春中TaGAST基因在仅赤霉素处理(GA)时，48h时才有较高表达量；TAM107中TaGAST基因一直保持一定的较低水平，到48h升高到较高的表达量。仅热处理(HS)时，中国春前期1.5h就达到最高表达量，随后下降；TAM107中基因表达随着处理时间的增加缓慢升高到3.5h最高，然后下降到后期48h时，表达量依然高于本底水平。在热处理(HS)和赤霉素处理(GA)同时进行时，中国春TaGAST基因表达量在前期0.5h迅速升高，后稍有些起伏，到24h达到最高，后迅速下降；TAM107中基因表达量随着处理时间的延长升高，在前期1.5h达到最高，随后迅速下降，表达量维持在较高的稳定水平直到后期48小时。

图3中可以看出中国春中TaGAST基因在前期(1.5h)仅热胁迫处理条件下表达量最高，热胁迫和赤霉素GA同时处理的条件下表达量较高；后期(48h)GA处理的表达量最高，其他处理的表达量维持在较低水平。TAM107中前期(1.5h)TaGAST基因表达量在赤霉素GA处理、热胁迫处理和赤霉素与热胁迫同时处理条件下依次增高；后期(48h)GA处理的表达量最高，其他处理的表达量维持在较低水平。

实施例3、野生型和转基因植物在高温胁迫处理条件下的表型及生理鉴定

1、转基因植株的获得

(1)pCAMBIA-35S-TaGAST表达载体的构建

以小麦品种TAM107(Triticum aestivum L.)叶片的cDNA为模板，利用引物3：5’-GCTCTAGAATGGCGCAGCGGGATCACA-3’和5’-GGGGTACCTCAGAACCTGACGAGCTTG-3’，PCR扩增得到包含TaGAST编码序列(序列表中序列1的自5′端第696位至992位脱氧核苷酸)的核苷酸序列，将得到的TaGAST片段经限制性内切酶XbaI和KpnI消化后，插入质粒pCAMBIA-1300(购自CAMBIA公司)的限制型内切酶XbaI和KpnI酶切位点之间，得到含有TaGAST编码区片段的表达载体pCAMBIA-TaGAST；以限制性内切酶Hind III和Xba I消化质粒pBI121(购自Clontech公司)，回收CaMV35S片段，并插入质粒pCAMBIA-TaGAST(购自CAMBIA公司)的限制型内切酶Hind III和XbaI酶切位点之间，得到含有CaMV35S启动子和TaGAST编码区片段的超表达载体pCAMBIA-35S-TaGAST。

用pCAMBIA-35S-TaGAST转化根癌农杆菌GV3101(菌种购自上海坤肯生物化工有限公司)，利用农杆菌侵染方法转化Columbia生态型拟南芥(购自拟南芥生物资源中心Arabidopsis Biological Resource Center)经50ug/l潮霉素和PCR筛选共得到了6个转pCAMBIA-35S-TaGAST株系(简称转TaGAST基因株系)。对这6个株系(5#、6#、7#、8#、13#、14#)进行下述步骤2的转基因植株耐热性鉴定。其中，得到的第一代转基因植株为T1代，T1代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T2代，依此类推，T3表示转基因植株第3代。

同时，用pCAMBIA-1300空载体转化根癌农杆菌GV3101(菌种购自上海坤肯生物化工有限公司)，利用农杆菌侵染方法转化Columbia生态型拟南芥(购自拟南芥生物资源中心Arabidopsis Biological Resource Center)作为转空载体对照组，进行与实验组相同的胁迫处理。

2、转基因后代耐热性鉴定方法

(1)成活率的测定

制备MS培养基平板，经过筛选确定为纯系的T2代种子消毒后，用无菌水清洗6～7次，将种子平铺在MS培养基上，4℃春化5天后，移入22℃/18℃，15h光/9h暗的培养室中培养十天后移入土壤中。种在土壤中的小幼苗生长14天后，选择生长一致，发育良好的转基因植株和野生型植株，进行热胁迫45℃，2h处理，胁迫处理恢复生长4天后统计成活率。

选取5#、8#、13#转基因纯系进行热胁迫处理后成活率统计实验，结果见表2。5#与转空载体的成活率差异达显著水平；8#与转空载体的成活率差异达极显著水平，明显表现出较转空载体更耐热；13#与转空载体的成活率差异也达到显著水平，如图4。

表2转空载体拟南芥转系和转TaGAST基因株系在高温条件下的成活率统计结果

*差异显著，**差异极显著

(2)电导率的测定

将所收获的转TaGAST基因纯系的拟南芥种子4℃春化3天后平铺在MS培养基上，移入22℃/18℃，15h光/9h暗培养室中培养10天后移入土壤中。种在土壤中的小幼苗生长14天后，选择生长一致，发育良好的转基因植株和野生型植株，进行如下的处理：

①用打孔器从转基因植株和野生型植株的第5片和第6片叶子上打取(每个基因型做3个重复，分别取自三株不同的植株，每株取下两片叶子)分别打出1片，用蒸馏水冲洗3次，置于20ml试管中，在试管中加入13ml的蒸馏水(使整个叶片全部浸没于水中)。

②把试管放在42℃水浴锅中放置1h后取出，室温放置24h，然后用电导率仪测定每个试管中溶液的电导率，记下此时电导率的读数为T1，然后离心管用锡箔纸包紧，在15Psi，121℃条件下灭菌15min，放置24h后，再用电导率仪测定此时溶液的电导率，记为T2。

③按照公式计算CMS(Cell membrane thermostability)值，即细胞膜的稳定性。CMS＝T1/T2。结果见表3。

表3转空载体株系和转TaGAST基因株系在高温条件下的电导率测定结果

结果显示1个株系与野生型相比差异不显著，1个株系差异显著，有4个株系与野生型相比呈现极显著性差异，这也从一个方面说明此基因很有可能与耐热相关。

序列表

<110>中国农业大学

<120>与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用

<160>1

<210>1

<211>1059

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtaaag aaaatatttc tatcctgatc 60

ctgtgaggag gcgttaaagt ttcgccgctc tagcacgata gtgatccgtt gttcgagtac 120

aacaaagagc ggtactgtct gaatttatcg gcacatgcac gggcgttcgt cctctccggg 180

ccctgcatat ttctgggaac catgcagggc gaaacgccaa acgcctgcac gacgacaata 240

tggcacgtcg accctgacgg aacccgacac gggcgccggg ccatgcacag agccgacacc 300

accacggccg cccgcgcgcg ccactgatca tcatacacgg tggtcacgga ccggctcctc 360

ctctgccgcg gcgcagtgca gcacacacct agcagaccag cagccctgcc ccctccgtcg 420

ccgtgttatt actatcgtcg ccgtgcatta actcgaatcc gggcaccaac gagaccccat 480

caattctagg agcaggtgca cgtgaccgcg cgacacgtcg cccgttctcc agaggcttcc 540

cgatcgaccg gtacaaaggt gcccggacct gagctacatc atcctcactc gttcactccc 600

taccctcaca cccacactcc cactctgcta ccaccttatc tagctcctcc tgcaagctcc 660

tgcatcccag ctagcagagc ttgaagctcg accagatgag caagccatcc aggtgcaggg 720

cgctgcggac gcaggtcgcc ctgctcctcg tcttgctcgt cgctgcctcc ctgctcccgg 780

ctggcgacgc tgcttcaggg ttctgcgcgg gcaagtgcgc ggtgcggtgc gggcggtcgc 840

gcgcgaagcg gggggcgtgc atgaagtact gcgggctgtg ctgcgaggag tgcgcctgcg 900

tgcccacggg gaggagcggc agccgcgacg agtgcccctg ctaccgcgac atgctcaccg 960

ccggccccag gaagaggccc aagtgcccct gaccgcccta tcgtcggccc accgtctcaa 1020

gtctcaacgc accaacggct tcttcaacct ctactccac 1059

<210>2

<211>98

<212>PRT

<213>普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Met Ser Lys Pro Ser Arg Cys Arg Ala Leu Arg Thr Gln Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Leu Val Ala Ala Ser Leu Leu Pro Ala Gly Asp Ala

20 25 30

Ala Ser Gly Phe Cys Ala Gly Lys Cys Ala Val Arg Cys Gly Arg Ser

35 40 45

Arg Ala Lys Arg Gly Ala Cys Met Lys Tyr Cys Gly Leu Cys Cys Glu

50 55 60

Glu Cys Ala Cys Val Pro Thr Gly Arg Ser Gly Ser Arg Asp Glu Cys

65 70 75 80

Pro Cys Tyr Arg Asp Met Leu Thr Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro Lys

85 90 95

Cys Pro

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的DNA基因为如下1)或2)所述的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pCAMBIA-1300的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.扩增权利要求2或3所述基因全长的引物对。

9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入植物中，得到耐热转基因植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入植物中。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：所述植物为小麦。