CN102168097A - 编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因及其所编码的蛋白质以及用途。本发明要解决的技术问题是提供一类能编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因。该编码提高植物或微生物耐热性蛋白质的基因含有编码下述肽段的核苷酸序列：N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’所示的结构，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。本发明为本领域提供了能够有效提高植物和微生物的耐热性的备选基因，具有很好的应用前景。

Description

编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因及其用途
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因及其所编码的蛋白质以及用途。
背景技术
由于二氧化碳排气量增加，因而地球的温室效应不断加剧，导致全球性气候变暖，预计未来100年全球平均气温可能上升1.4-5.8℃。全球性的气候变暖，造成农业生态环境日趋恶化。专家预测：气候变暖可能使作物减产17％。IRRI(国际水稻研究所)研究证实：1998-2003年，气温升高了1℃，产量降低了10％。在中国，专家们认为，到2050年，全国平均气温将上升2.2℃。在自然环境下生长的植物都受到温度升高的影响，使植物的生长出现障碍，特别是一些大春作物，如水稻、玉米等在抽穗、灌浆期间，很容易受到高温天气的影响，造成农作物的减产。另一方面，根据FAO(国际粮农组织)分析，到2050年，世界人口将突破100亿。随着人口的进一步增加，农业面临的人口压力进一步增加，世界范围内的粮食短缺状况将长期存在。受到全球气候变暖的影响，大量的草本植物会出现生长障碍、甚至死亡，从而破坏生态平衡。因此，各国科学界都在努力寻找提高植物热耐受性的相关基因。迄今为止，仅发现少数的热激蛋白基因以及它们的转录因子与耐热相关，未见到任何一个单独的基因能增加细菌和植物耐热性的报道。本领域目前急需寻找能够提高植物的耐热性基因。
泛素是一个由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽，因其广泛分布于各类细胞中而得名，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并被迅速降解。研究显示，泛素介导引起的蛋白质降解是生物体维持自身正常生长发育和在逆境条件下生长的重要生理生化过程。
蛋白质的泛素化修饰主要发生在赖氨酸残基的侧链，且通常是多聚化过程。被多泛素化修饰的蛋白质会被蛋白酶体识别进而被降解。三种关键的酶共同介导了这一多泛素化过程，包括泛素活化酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。它们的作用机制现已基本研究清楚：首先由E1通过其活性中心的Cys残基与泛素的C端形成硫酯键活化单个游离的泛素(此步骤需要ATP)，然后E1将活化的泛素递交给E2，最后由E3募集特异的底物和E2，并介导泛素从E2转移到靶蛋白。由于蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此，E3在整个蛋白质的降解过程中发挥了至关重要的作用，决定了反应的特异性。通常情况下，泛素化反应包含一个E1，少数几个E2和众多E3。现已发现的E3家族主要有两类，包括占多数的RING-finger家族和HECT家族。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质(本发明中有时简称为耐热蛋白质)的基因(本发明中有时简称为耐热基因)。
该编码提高植物或微生物耐热性蛋白质的基因含有编码下述肽段的核苷酸序列：
N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’所示的结构(SEQ ID NO：68)，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。
进一步的，该肽段的核苷酸序列为：
N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24 -C’(SEQ ID NO：69)，其中X为任意氨基酸残基，下标表示氨基酸残基的数量。
其中，上述的蛋白质为泛素连接酶(Ubiquitin ligase，E3)。
其中，上述的蛋白质为跨膜蛋白，还含有跨膜区。
其中，上述基因来源于植物的基因组。
其中，上述植物为拟南芥、水稻、玉米(Zea mays L.)或蓖麻。
其中，上述基因(1)：具有SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、或SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列；
或者(2)：上述基因具有在(1)所述的任一条核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且编码具有相同或相似的功能的蛋白质。
进一步的，所述基因具有(1)：所述基因具有SEQ ID NO：57中的第158～1018位、SEQID NO：45中的第96～848位、SEQ ID NO：47中的291～1127位或SEQ ID NO：39中的第68～946位所示的核苷酸序列；
或者(2)：所述基因具有在(1)所述的任一条核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且编码具有相同或相似的功能的蛋白质。
本发明同时提供了上述编码基因编码的蛋白质。
本发明还提供一类提高植物或微生物耐热性的蛋白质。该类蛋白质含有下述肽段：
N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27 -C’所示的结构，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。
进一步的，该肽段的核苷酸序列为：
N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24 -C’，其中X为任意氨基酸。
其中，上述的蛋白还含有跨膜区，为跨膜蛋白。上述的蛋白含有1-6个跨膜区。进一步的，所述的蛋白含有2-3个跨膜区。
其中，上述的跨膜区的结构为N’-A X2-6 CRS X2-8 LIL X2-4 LL X1-4 LR X1-10 -C’(SEQ IDNO：70)，或者N’-L X2-4 R X1-5 GFLL X1-7YIMAW X1-15 -C’(SEQ ID NO：71)所示的至少一种，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。其中，上述的每个跨膜区之间有一段柔性连接。其中，上述的跨膜区接近C端。其中，上述跨膜区与锌指结构区直接由柔性连接段连接。其中，上述蛋白在N端还有信号肽。其中，上述的信号肽为膜定位信号肽。
其中，上述的蛋白质为泛素连接酶Ubiquitin ligase。
其中，上述的蛋白质来源于植物。
其中，上述蛋白具有由SEQ ID NO：1(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：2)、SEQ ID NO：57中的第158～1018位(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：58)、SEQ ID NO：45中的第96～848位(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：46)、SEQ ID NO：47中的291～1127位(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：48)或SEQ ID NO：39中的第68～946位(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：40)所示的核苷酸序列所编码得到的氨基酸序列；
或者(2)：所述基因具有在(1)所述的任一条氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且具有相同或相似的功能。
本发明还提供了编码上述耐热蛋白质的基因。
本发明另提供了一段肽段。所述肽段含有N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27 -C’所示的结构域，其中X为任意氨基酸，下标数字表示氨基酸残基的数量。
进一步的，该结构域的氨基酸序列为：
N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24 -C’所示的结构域，其中X为任意氨基酸残基，下标数字为氨基酸残基的数量。
其中，上述肽段来源于植物。所述植物可为拟南芥、水稻、玉米或蓖麻。
其中，上述肽段能形成锌指结构。即N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’或N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24-C’所示的结构域为能形成锌指结构的结构域，其中X为任意氨基酸，下标数字表示氨基酸残基的数量。
其中，上述肽段能赋予蛋白质提高植物或微生物耐热性的功能。
进一步的，以上所述的抗逆性为耐热性。更进一步的，所述的蛋白质为泛素连接酶。
更进一步的，上述的肽段具有如下多肽序列：
(1)：如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列；
或者，在(1)所述的任一条多肽的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且具有相同或相似的功能。
其中的，上述的“至少一个”是指一个或几个(10个以内)。上述的“相同或相似的功能”是指能提高植物或微生物的耐热性。
本发明另提供了编码上述肽段的核苷酸序列。
本发明另提供了将编码非耐热蛋白质的基因改造为编码耐热蛋白质的基因的方法，其步骤为将上述肽段的编码核苷酸序列添加入编码非耐热蛋白质的基因或替换其中的一段核苷酸序列。当然这样的添加或替换是发生在密码子之间而非之内，以使整个改造后的基因仍然具有编码完整蛋白质的能力。即，该方法的步骤为将编码上述的肽段的核苷酸序列添加入编码非耐热蛋白质的基因中或替换掉编码非耐热蛋白质的基因其中的一段核苷酸序列，所述的添加或替换是发生在密码子之间，以使整个改造后的基因仍然具有编码完整蛋白质的能力。
其中，上述的被替换的一段核苷酸序列为编码锌指结构域的核苷酸序列。即上述编码非耐热蛋白质的基因中被替换的一段核苷酸序列为编码锌指结构域的核苷酸序列。
其中，上述的非耐热蛋白质为泛素连接酶Ubiquitin ligase(E3连接酶)。
在上述发明的基础上，本发明还提供了一种提高植物耐热性或制备高耐热性植物的的方法。该方法包括以下步骤：
a、将上述的编码耐热蛋白质的基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成可表达该基因的重组载体；
b、将步骤a中的重组载体转入植物细胞；
c、经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因植株或其后代，所述后代包括植物种子或植物组织。进一步的，上述方法中的抗逆性为耐热性。
本发明也提供了上述的基因序列或核苷酸序列的载体。其中，所述的载体为表达载体。
进一步的，所述的表达载体为真核表达载体。
本发明还提供了含有上述所述的载体的宿主细胞。所述的宿主细胞主要为植物细胞或微生物。
本发明所述重组载体，是将基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如pBI121或pCAMBIA2301)。本发明可用上述重组载体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后使用各种上述的逆境条件进行筛选。
在本发明中，类似于“在SEQ ID NO：1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”表述的基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO：1所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO：1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO：1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物或微生物的耐热性。
该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO：1相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“在所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列”的表述包括但并不限于若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述蛋白的活性片段和活性衍生物。在本发明中的相同功能是指提高植物的耐热性或者赋予其他蛋白质提高植物或微生物耐热性的功能。
“在所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列”的表述还包括但并不限于有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，即保守性变异多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1氨基酸替换表
  最初的残基 代表性的取代   优选的取代
  Ala(A) Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R) Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N) Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D) Glu   Glu
  Cys(C) Ser   Ser
  Gln(Q) Asn   Asn
  Glu(E) Asp   Asp
  Gly(G)  Pro；Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu
本发明还包括所要求保护的蛋白或者多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO：2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白或者肽段并不限于上述例举的代表性的蛋白或者多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明的有益效果在于：主要提供了一类编码耐热蛋白质的基因及其所编码的蛋白质，以及一类能够起类似作用的多肽及其编码基因，以及这些基因和蛋白质在提高植物和微生物的耐热性中的用途。本发明为本领域提供了新能够有效提高植物和微生物的耐热性的备选基因，具有很好的应用前景。
附图说明
图1转AtTR1基因及其突变基因的大肠杆菌的生长曲线。图中标示AtTR1为过量表达AtTR1基因的大肠杆菌，MT1～6分别为过量表达AtTR1突变基因的大肠杆菌，WT为非转基因的大肠杆菌。
图2转AtTR1基因蓖麻同源基因RcTR1的大肠杆菌的生长曲线。
图3转AtTR1基因水稻同源基因OsTR1-1、OsTR1-2的大肠杆菌的生长曲线。
图4转AtTR1基因玉米同源基因ZmTR1的大肠杆菌的生长曲线。
图5替换或缺失AtTR1蛋白跨膜区的大肠杆菌的生长曲线。
图6替换或缺失OsTR1-1蛋白跨膜区的大肠杆菌的生长曲线。
图7替换或缺失ZmTR1蛋白跨膜区的大肠杆菌的生长曲线。
图8AtTR1蛋白的E3泛素连接酶活性检测(+表示加入；-表示未加入)。
图9OsTR1-1蛋白的E3泛素连接酶活性检测(+表示加入；-表示未加入)。
图10ZmTR1蛋白的E3泛素连接酶活性检测(+表示加入；-表示未加入)。
具体实施方式
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J，Russell D.W.，2001，Molecular Cloning：A laboratory manual(3rd ed)，Spring Harbor Laboratory Press中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用载体pET28，pGEX-2T，pGEM-T购自于Qiagen公司，菌株BL21购自于Qiagen公司，菌株EHA105、载体pBI121购自于Clontech公司。
使用基因工程技术对植物进行改良是近年来的热点。使用基因工程技术以期提高植物的抗逆性，培育出耐逆性系也是一个可行之道。但是，目前还鲜见有能综合提高植物和微生物的多种抗逆性的单个基因的报道。申请人从拟南芥中克隆到的一个可提高植物热胁迫抗性(耐热性)的基因AtTR1。
研究发现，所述基因AtTR1表达的蛋白具有泛素蛋白系统中泛素E3连接酶活性；通过将AtTR1基因转化拟南芥、油菜、大肠杆菌，实验结果发现转基因生物的耐热性均有所提高。该基因可用于提高植物、微生物对高温的耐受程度，降低高温引起的减产损失，同时降低成本，具有重要的经济意义和应用前景。
为了探寻AtTR1基因的作用机理，查找AtTR1蛋白的关键作用位点，对AtTR1蛋白的一些保守氨基酸进行突变，来研究其功能变化情况。
表2  AtTR1与MARCH家族蛋白序列比对
  蛋白   关键序列(指环结构)
  AtTR1 69 CRICQE.EDSTKNLEAPCACNGSLKYAHRKCVQRWCNEKGDITCEIC 114
  MARCH2 64 CRICHE.GANGECLLSPCGCTGTLGAVHKSCLEKWLSSSNTSYCELC 109
  MARCH4 163 CRICFQ.GPEQGELLSPCRCDGSVKCTHQPCLIKWISERGCWSCELC 208
  MARCH6 9 CRVCRSEGTPEKPLYHPCVCTGSIKFIHQECLVQWLKHSRKEYCELC 55
通过蛋白结构比对(见表2)，发现AtTR1蛋白与参与人类免疫调节的MARCH(MembraneAssociated Ring-CH)蛋白结构相似，都具有典型的指环(Ring-CH)结构域。将比对结果中所示的几个关键位点进行定点突变，结果表明这些突变体的耐热性发生变化，比非转基因型耐热性或高或低，但都低于转AtTR1基因型。说明这些关键位点决定了AtTR1蛋白提高生物耐逆性的功能活性。
在上述研究结果的的基础上，在其它植物中找到了AtTR1基因的多个同源基因。这些同源基因具有一些高度保守的区域，也具有增强植物耐热性的作用(核心序列分析参见表3)。
表3  AtTR1及其同源蛋白的功能结构位点比对
Figure BDA0000045818820000081
最后确定，要具有耐热性能，那么应具有一个保守的RINGv区域，其氨基酸序列如下：
Figure BDA0000045818820000082
进一步的该区域为：
Figure BDA0000045818820000083
斜体部分氨基酸为突变试验所选出的不能突变的位点，突变后会失去或明显减少耐热功能，其中X为任意氨基酸(优选为天然氨基酸)，下标数字表示氨基酸残基的数量。
表4  常见锌指蛋白的模式表
Figure BDA0000045818820000091
从表4可看出，其中上述的1、2和5、6位点氨基酸形成锌指结构，其中的x可以为任意氨基酸，第3行为本发明蛋白特有锌指结构(RINGv)，在植物中特有，和本发明蛋白的抗热功能密切相关。
实施例一  拟南芥中耐热基因AtTR1的克隆及过量表达重组载体的构建
1、从拟南芥中筛选获得一段基因AtTR1，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，
上游引物(SEQ ID NO：3)：5’-ATGGCTGATCATTTGAGTTTATGT-3’，
下游引物(SEQ ID NO：4)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGATA-3’。
然后经PCR从拟南芥cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到序列SEQ ID NO：1的基因片段。
2、根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物
上游引物(SEQ ID NO：5)：5’-CGCGGATCC ATGGCTGATCATTTGAGTTTATGT-3’，
下游引物(SEQ ID NO：6)：5’-CCGGAGCTC TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGATA-3’。
经PCR，将从拟南芥cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列扩增出酶切位点。对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。
实施例二  AtTR1基因的定点突变及突变基因过量表达重组载体的构建
1、随机选取数个位点，根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计包含突变位点的引物(下划线碱基为突变位点)，构建定点突变序列(Stratagene公司
Figure BDA0000045818820000092
Site-DirectedMutagenesis Kit)。
蛋白序列第69位氨基酸突变引物：
上游引物(SEQ ID NO：7)：5’-TTCTC CAATC TGTTG AGAGT CGTAT TTGCC-3’
下游引物(SEQ ID NO：8)：5’-GGCAA ATACG ACTCT CAACA GATTG GAGAA-3’
蛋白序列第72位氨基酸突变引物：
上游引物(SEQ ID NO：9)：5’-AGTGT CGTAT TGGCC AAGAG GAAGA TAGTA CT-3’
下游引物(SEQ ID NO：10)：5’-AG TACTA TCTTC CTCTT GGCCA ATACG ACACT-3’
蛋白序列第85位氨基酸突变引物：
上游引物(SEQ ID NO：11)：5’-CTTGA AGCTC CTAGT GCTTG TAA-3’
下游引物(SEQ ID NO：12)：5’-TTA CAAGC ACTAG GAGCT TCAAG-3’
蛋白序列第87位氨基酸突变引物：
上游引物(SEQ ID NO：13)：5’-GAAGC TCCTT GTGCT CGTAA TGGTA GTTTA AA-3’
下游引物(SEQ ID NO：14)：5’-TT TAAAC TACCA TTACG AGCAC AAGGA GCTTC-3’
蛋白序列第95位氨基酸突变引物：
上游引物(SEQ ID NO：15)：5’-TAAAG TATGC TAACC GCAAG TGTGT TC-3’
下游引物(SEQ ID NO：16)：5’-GA ACACA CTTGC GGTTA GCATA CTTTA-3’
蛋白序列第98位氨基酸突变引物：
上游引物(SEQ ID NO：17)：5’-ACCGC AAGTA TGTTC AGCGT TGGTG TA-3’
下游引物(SEQ ID NO：18)：5’-TA CACCA ACGCT GAACA TACTT GCGGT-3’
以连接有SEQ ID NO：1的载体pET28做模板，PCR扩增出含有SEQ ID NO：19序列(SEQ IDNO：2序列N端第69位半胱氨酸替换成丝氨酸)、SEQ ID NO：20序列(SEQ ID NO：2序列N端第72位半胱氨酸替换成甘氨酸)、SEQ ID NO：21序列(SEQ ID NO：2序列N端第85位半胱氨酸替换成丝氨酸)、SEQ ID NO：22序列(SEQ ID NO：2序列N端第87位半胱氨酸替换成精氨酸)、SEQ ID NO：23序列(SEQ ID NO：2序列N端第95位组氨酸替换成天冬酰胺)、SEQ ID NO：24序列(SEQ ID NO：2序列N端第98位半胱氨酸替换成酪氨酸)的突变质粒的克隆。
2、通过扩增引物，从突变质粒中扩增完整的SEQ ID NO：19～24所示的核苷酸序列。
上游引物(SEQ ID NO：5)：5’-CGCGGATCC ATGGCTGATCATTTGAGTTTATGT-3’，
下游引物(SEQ ID NO：6)：5’-CCGGAGCTC TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGATA-3’。
对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI 121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：19～24的过量表达重组质粒，记为MT1～6。
实施例三  过量表达AtTR1及其突变基因大肠杆菌的耐热性能鉴定
1、转化大肠杆菌
将重组质粒转化大肠杆菌，涂布于含Amp的LB固体培养基上，经测序验证，得到含重组质粒的大肠杆菌pET28菌株。
2、配制培养基
配制LB液体培养基，加入抗生素Kan 50ug/ml，Cam 50ug/ml后，分装24管，每管10ml，待用。
3、制备细菌悬液
取过量表达AtTR1及6种突变基因大肠杆菌(MT1～6)和非转基因大肠杆菌(共8种)单菌落37℃过夜活化。
4、滴加供试菌
向每管LB液体培养基中接入活化菌液0.05ml，每种菌接3支试管，摇匀后振荡培养3小时(37℃，225rpm)。
5、培养与观察
37℃培养3小时后，再加0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，42℃培养10小时观察结果。以目测来判断过量表达AtTR1及6种突变基因大肠杆菌(MT1～6)和非转基因大肠杆菌的生长情况，同时定时多次测定OD600值(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，用以绘制不同种大肠杆菌的生长曲线，结果见图1(图中标示AtTR1为过量表达AtTR1基因的大肠杆菌，MT1～6分别为过量表达AtTR1突变基因的大肠杆菌，WT为非转基因的大肠杆菌)。
结果发现，过量表达AtTR1突变基因的大肠杆菌，虽表现出一定的耐热性，但可看出其生长曲线斜率明显小于过量表达AtTR1的大肠杆菌，说明该6个位点发生突变后，会造成该基因的耐热功能有所降低，该6个位点对于AtTR1蛋白在生物体内行使耐热功能有及其重要作用。
实施例四  过量表达AtTR1及其突变基因的油菜的耐热性能鉴定
1、胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜
1-1、无菌苗的获取
选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4℃过夜春化(保持种子发芽同步)，然后取出，用70％乙醇浸泡30s，0.1％的升汞(HgCl2)溶液浸泡8～10分钟，无菌水冲洗5次，滤纸吸干，接种于MS固体培养基上。置培养室中24℃，暗培养2-3天，然后取出光照16h/d继续萌发。取5-7厘米(约7-8天)无菌苗下胚轴作为转化受体。
1-2、下胚轴的预培养
将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均匀置于预培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/L AgNO3，19.62mg/L乙酰丁香酮)中进行2～3天的预培养(可见下胚轴变粗)。
1-3、下胚轴的浸染及共培养
挑取含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：19～24的过量表达重组质粒的农杆菌，接种于含20mg/L链霉素，50mg/L卡那霉素，40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜后收集菌体，重悬于含100mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中至OD600＝0.4～0.6，28℃摇菌1-2小时。
将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：19～24的过量表达重组质粒的农杆菌菌液中30秒～1分钟，此期间不断振荡使菌液与油菜下胚轴充分接触。用无菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L2，4-D，2.5mg/L AgNO3，19.62mg/L乙酰丁香酮)上，共培养2天。
1-4、筛选培养与芽的诱导
将共培养后的七种油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/L AgNO3，19.62mg/L乙酰丁香酮)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4周，得到愈伤芽。
1-5、生根
在筛选培养基(MS+2mg/L 6-BA，2.5mg/L AgNO3，500mg/L羧苄青霉素，10mg/L卡那霉素)上待愈伤芽长至有4～6片真叶时，将芽从愈伤组织中切下，移入生根培养基(1/2MS，0.15mg/L NAA，250mg/L头孢霉素)中。待再生苗根系生长发达时，将培养罐移至室外2～3天，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2～3天。
1-6、盆栽培养
将含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：19～24基因序列的过量表达转基因植株分别在生根培养基上发育出完整根系，将其转入盆栽。
2、转基因油菜的PCR检测
待土壤中再生植株长大后，各取叶片少量抽提总DNA，以提取的DNA做模板，分别进行PCR检测。
检测AtTR1引物：
上游引物(SEQ ID NO：25)：5’-TGATCATTTGAGTTTATGTACCGA-3’
下游引物(SEQ ID NO：26)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGAT-3’
检测MT1引物：
上游引物(SEQ ID NO：27)：5’-AATCTGTTGAGAGTCGTATTTGCCAA-3’
下游引物(SEQ ID NO：28)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGAT-3’
检测MT2引物：
上游引物(SEQ ID NO：29)：5’-GTCGTATTGGCCAAGAGGAAGATAG-3’
下游引物(SEQ ID NO：30)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGAT-3’
检测MT3引物：
上游引物(SEQ ID NO：31)：5’-CTTGAAGCTCCTAGTGCTTGTAAT-3’
下游引物(SEQ ID NO：32)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGAT-3’
检测MT4引物：
上游引物(SEQ ID NO：33)：5’-CTTGTGCTCGTAATGGTAGTTTAAAGT-3’
下游引物(SEQ ID NO：34)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGAT-3’
检测MT5引物：
上游引物(SEQ ID NO：35)：5’-AAGTATGCTAACCGCAAGTGTGTTCT-3’
下游引物(SEQ ID NO：36)：5’-TCAAACTGGTGTTGGGACATTGGAT-3’
检测MT6引物：
上游引物(SEQ ID NO：37)：5’-TATGCTCACCGCAAGTATGTTCAGCGTTT-3’
下游引物(SEQ ID NO：38)：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’
然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现(条带大小约为860bp)，若有则代表目的基因已转入甘蓝型油菜，经过检测，得到了转入相应基因的油菜。
3、转基因油菜耐热性能鉴定——热激条件下的种子萌发情况
3-1、种子春化
选取7种转基因甘蓝型油菜种子(AtTR1、MT1、MT2、MT3、MT4、MT5、MT6)及非转基因的野生甘蓝型油菜种子(WT)共8种，每种各200颗，加水4℃浸泡过夜。
3-2、热激处理
将8种油菜种子分别装入标记的试管中，每种2管，每管100颗，将其分为A、B两组，A组45℃水浴3小时，B组常温浸泡2小时。
3-3、结果观察
2小时后，将种子置于铺有滤纸的平皿中，放入培养室(光照6000～8000lux，16h/8h光暗周期)培养，每24小时观察一次，统计种子相对萌发率(相对发芽率＝热激后发芽率/常温发芽率×100％)，结果见表5。
表5油菜种子热激后相对发芽率(单位：％)
  AtTR1   MT1   MT2   MT3   MT4   MT5   MT6   WT
  1天后   0   0   0   0   0   0   0   0
  2天后   32.48   20.00   14.68   13.75   10.06   10.11   16.94   12.82
  3天后   68.52   41.97   38.55   35.69   30.17   26.96   40.00   32.22
  4天后   74.13   57.43   41.26   44.20   42.88   40.25   47.86   40.85
  5天后   84.00   62.35   47.87   50.00   51.25   47.01   49.96   46.87
  6天后   86.17   69.02   56.95   62.75   60.77   59.20   62.45   59.50
  7天后   93.55   70.38   65.82   70.13   69.00   62.85   68.29   64.00
4、转基因油菜耐热性能鉴定——热激条件下的苗期生长情况
将7种转基因甘蓝型油菜种子(AtTR1、MT1、MT2、MT3、MT4、MT5、MT6)及非转基因的野生甘蓝型油菜种子(WT)分别放置于湿润的滤纸上萌发，待破壳后移入腐殖土中，22℃培养15天左右(两片真叶长成)，然后转入34℃热胁迫，条件为日照14h、黑暗10h。观察各种油菜的生长情况。
结果发现，热胁迫3天后，甘蓝型油菜生长受到抑制，甘蓝型油菜转基因株系MT1-6及野生型WT均出现发黄、萎蔫现象，其中MT1、MT2、MT6的黄化、萎蔫程度相对较轻，WT、MT3、MT4、MT5相对较严重，而AtTR1生长正常。热胁迫5天后，甘蓝型油菜转基因株系MT1-6及野生型WT都已经死亡，而AtTR1尚存活，生长正常。
实施例五  AtTR1的蓖麻同源基因RcTR1的获取及转RcTR1大肠杆菌的耐热性实验
1、蓖麻同源基因的克隆及获取
用TRIzol法提取蓖麻总RNA(Invitrogen公司TRIzol试剂)，然后反转录(promega公司反转录试剂盒)成cDNA，分别根据SEQ ID NO：39所示蓖麻RcTR1核苷酸序列(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：40)设计引物：
上游引物(SEQ ID NO：41)：5’-GTGGTGTAGCAGGATTTTTAATC-3’
下游引物(SEQ ID NO：42)：5’-GCATCCCCATTCATTTCAT-3’
经PCR从蓖麻cDNA中扩增SEQ ID NO：39所示核苷酸序列中37-964位序列。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，经测序验证，得到所需序列。
2、根据上述扩增到的序列片段设计带酶切位点的引物，构建重组质粒。
上游引物(SEQ ID NO：43)：5’-CCGGAATTCATGAGTGATCAACTAGTTTTG-3’
下游引物(SEQ ID NO：44)：5’-CCCAAGCTTTCATTGAAGTGGCTCTTG-3’
经PCR，从步骤1的PCR产物中扩增出SEQ ID NO：39所示核苷酸序列中68-946位序列(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：40)。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用EcoR1和HindIII酶切，胶回收片段后分别与载体pET28连接，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌JM109中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，经测序验证，得到含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株。
3、重组质粒在大肠杆菌JM109菌株中繁殖后，提取质粒(见Qiagen公司所公开的资料)，将重组质粒转化大肠杆菌BL21Rosset细胞里，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，放入含100mg/L卡那霉素和氯霉素的LB培养基中37℃、225rpm过夜活化培养。活化培养后，按1∶250的比例将菌液加入新鲜LB培养基中(含100mg/L卡那霉素和氯霉素)，测定OD600值(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，将初始OD调一致，振荡培养(37℃，225rpm)3h后，加1Mm IPTG，测OD值，再振荡培养(42℃，225rpm，10h)，每小时一次测OD值。
结果发现，转蓖麻同源基因RcTR1的大肠杆菌比非转基因的大肠杆菌有较高的耐热性。OD值越大，表明菌液浓度越大，即生长情况越好，如图2可见，随时间变化，转蓖麻同源基因RcTR1的大肠杆菌(RcTR1)的生长曲线斜率明显大于非转基因大肠杆菌(对照)，说明转蓖麻同源基因RcTR1的大肠杆菌的生长速度和生长状况明显优于非转基因大肠杆菌。
实施例六、AtTR1的水稻同源基因OsTR1-1、OsTR1-2序列的获取及OsTR1-1、OsTR1-2的大肠杆菌的耐热性实验
1、水稻同源基因OsTR1-1、OsTR1-2的克隆及获取
用TRIzol法提取水稻总RNA(Invitrogen公司TRIzol试剂)，然后反转录(promega公司反转录试剂盒)成cDNA，分别根据SEQ ID NO：45(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：46)、SEQ ID NO：47(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：48)所示核苷酸序列设计引物：
OsTR1-1序列(SEQ ID NO：45)扩增引物：
上游引物(SEQ ID NO：49)：5’-AAACTTTTTTGGGTGATTTGC-3’
下游引物(SEQ ID NO：50)：5’-CAAATTCTATTGCCCTTGTTCT-3’
OsTR1-2序列(SEQ ID NO：57)扩增引物：
上游引物(SEQ ID NO：51)：5’-GGAATTTGGGATGGGCGACCA-3’
下游引物(SEQ ID NO：52)：5’-AGAGACGCTACTGAAGTAACTAGCTAT-3’
经PCR从水稻cDNA中扩增OsTR1-1序列(SEQ ID NO：45)中71-854位序列(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：46)、OsTR1-2序列(SEQ ID NO：47)中281-1150位序列(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：48)。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，经测序验证，得到所需序列。
2、根据上述扩增到的序列片段设计带酶切位点的引物，构建重组质粒。
OsTR1-1序列(SEQ ID NO：45)带酶切位点扩增引物：
上游引物(SEQ ID NO：53)：5’-CGCGGATCCATGGGGGATCATGTTGCGGTGGAT-3’
下游引物(SEQ ID NO：54)：5’-CCGGAGCTCCTATTGCCCTTGTTCTGGATGAGGT-3’
OsTR1-2序列(SEQ ID NO：47)带酶切位点扩增引物：
上游引物(SEQ ID NO：55)：5’-CGCGGATCCATGGGCGACCATGTGGTGGT-3’
下游引物(SEQ ID NO：56)：5’-CCGGAGCTCGACGCTACTGAAGTAACTAGCTAT-3’
经PCR，从步骤1的PCR产物中扩增出表达序列(SEQ ID NO：45中96-848位序列、SEQ ID NO：47中291-1147位序列)。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与xhol1酶切，胶回收片段后分别与载体pET28连接，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌JM109中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，经测序验证，得到含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株。
3、重组质粒在大肠杆菌JM109菌株中繁殖后，提取质粒(见Qiagen公司所公开的资料)，将重组质粒转化大肠杆菌BL21Rosset细胞里，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，放入含100mg/L卡那霉素和氯霉素的LB培养基中37℃、225rpm过夜活化培养。活化培养后，按1∶250的比例将菌液加入新鲜LB培养基中(含100mg/L卡那霉素和氯霉素)，测定OD600值(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，将初始OD调一致，振荡培养(37℃，225rpm)3h后，加1mMIPTG，测OD值，再振荡培养(42℃，225rpm，10h)，每小时一次测OD值。
结果发现，两种转水稻同源基因OsTR1-1和OsTR1-2的大肠杆菌比非转基因的大肠杆菌有较高的耐热性。OD值越大，表明菌液浓度越大，即生长情况越好，如图3可见，随时间变化，转水稻同源基因的大肠杆菌(OsTR1-1和OsTR1-2)的生长曲线斜率明显大于非转基因大肠杆菌(对照)，说明转水稻同源基因OsTR1-1和OsTR1-2的大肠杆菌的生长速度和生长状况明显优于非转基因大肠杆菌。
实施例七  AtTR1的玉米同源基因ZmTR1的获取及转玉ZmTR1的大肠杆菌的耐热性实验
1、玉米同源基因ZmTR1的克隆及获取
用TRIzol法提取玉米总RNA(Invitrogen公司TRIzol试剂)，然后反转录(promega公司反转录试剂盒)成cDNA，根据SEQ ID NO：57(其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：58所示)所示核苷酸序列设计引物：
上游引物(SEQ ID NO：59)：5’-TTGGGATGGCTGGTGACG-3’
下游引物(SEQ ID NO：60)：5’-GTGAGCAACTACTGGGGATGTG-3’
经PCR从玉米cDNA中扩增SEQ ID NO：54核苷酸序列中153-1051位序列。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，经测序验证，得到所需序列。
2、根据上述扩增到的序列片段设计带酶切位点的引物，构建重组质粒。
上游引物(SEQ ID NO：61)：5’-CCGGAATTCATGGCTGGTGACGACC-3’
下游引物(SEQ ID NO：62)：5’-CCCAAGCTTCTATTGCTGTTGCTGCGAC-3’
经PCR，从步骤1的PCR产物中扩增出表达序列(SEQ ID NO：54中158-1018位序列，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：58)。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用EcoR1与HindIII酶切，胶回收片段后分别与载体pET28连接，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌JM109中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，经测序验证，得到含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株。
3、重组质粒在大肠杆菌JM109菌株中繁殖后，提取质粒(见Qiagen公司所公开的资料)，将重组质粒转化大肠杆菌BL21Rosset细胞里，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，放入含100mg/L卡那霉素和氯霉素的LB培养基中37℃、225rpm过夜活化培养。活化培养后，按1∶250的比例将菌液加入新鲜LB培养基中(含100mg/L卡那霉素和氯霉素)，测定OD600值(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，将初始OD调一致，振荡培养(37℃，225rpm)3h后，加1mMIPTG，测OD值，再振荡培养(42℃，225rpm，10h)，每小时一次测OD值。
结果发现，转玉米同源基因ZmTR1的大肠杆菌比非转基因的大肠杆菌有较高的耐热性。OD值越大，表明菌液浓度越大，即生长情况越好，如图4可见，随时间变化，转玉米同源基因ZmTR1的大肠杆菌(ZmTR1)的生长曲线斜率明显大于非转基因大肠杆菌(对照)，说明转ZmTR1玉米同源基因的大肠杆菌的生长速度和生长状况明显优于非转基因大肠杆菌。
实施例八  AtTR1结构研究
本实施例采用PTP跨膜区、BOR5跨膜区替换AtTR1自身跨膜区(SEQ ID NO.2中180-239位氨基酸)，同时缺失AtTR1自身跨膜区，以此研究AtTR1、替换跨膜区的AtTR1、仅含有RINGv结构(SEQ ID NO.2中69-120，其氨基酸序列见SEQ ID NO.63)且缺失跨膜区的AtTR1的耐热性。
1、蛋白片段碱基序列的扩增
由于上述两种跨膜区均来源于拟南芥，因此以拟南芥cDNA为模板，用PCR分别扩增上述两种跨膜区蛋白的碱基片段，同时从拟南芥cDNA中PCR扩增出可表达SEQ ID NO.2中1-179位氨基酸的肽段、69-120位氨基酸的肽段的碱基片段。
2、载体构建及重组菌的获得
用EcoRI、Ecl136II酶切上述扩增出的基因片段及pET28a载体，胶回收，连接后转入大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，提取质粒。将质粒转入大肠杆菌Rosseta细胞里，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落。至此共获得四种重组菌：
含有AtTR1全长蛋白的重组菌，记为AtTR1；
将AtTR1自身跨膜区替换为PTP跨膜区的重组菌，记为AtTR1+PTP；
将AtTR1自身跨膜区替换为BOR5跨膜区的重组菌，记为AtTR1+BOR5；
含有AtTR1(69-120aa)的重组菌，即仅含有RINGv结构、无跨膜区的重组菌，记为AtTR1(69-120)。
3、耐热性测定
挑取单菌落，放入含50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的LB培养基中37℃、225rpm过夜活化培养。活化培养后，按1∶100的比例将菌液加入新鲜LB培养基中(含50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素)，37℃、225rmp培养2小时，测定OD600值(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)至0.2左右，加入IPTG至终浓度1mM，之后将菌液至42℃，225rpm振荡培养，每1小时测一次OD值，根据测定OD值绘制生长曲线。生长曲线测定结果如表6及图5。
表6生长曲线测定结果(OD600值)
Figure BDA0000045818820000181
由结果可以看出，表达全长蛋白的AtTR1组耐热性最好，明显高于AtTR1+PTP、AtTR1+BOR5、AtTR1(69-120)及空载体对照；替换了跨膜区的AtTR1+PTP、AtTR1+BOR5组及AtTR1(69-120)组虽仍具有一定的耐热性，但明显低于AtTR1组；空载体对照的耐热程度最差，基本不能在42℃的高温环境中生长。
实施例九  AtTR1水稻同源蛋白OsTR1-1结构研究
本实施例采用PTP跨膜区、BOR5跨膜区替换OsTR1-1自身跨膜区(SEQ ID NO.45序列合成蛋白第145-203位氨基酸)，同时缺失OsTR1-1自身跨膜区，以此研究OsTR1-1、替换跨膜区的OsTR1-1、仅含有RINGv结构且缺失跨膜区的OsTR1-1(SEQ ID NO.45序列合成蛋白第32-81aa，其氨基酸序列见SEQ ID NO.66)的耐热性。
实验方案参见实施例八，最终获得四种重组菌：
含有OsTR1-1全长蛋白的重组菌，记为OsTR1-1；
含有将OsTR1-1自身跨膜区替换为PTP跨膜区的重组菌，记为OsTR1-1+PTP；
含有将OsTR1-1自身跨膜区替换为BOR5跨膜区的重组菌，记为OsTR1-1+BOR5；
含有OsTR1-1(32-81aa)的重组菌，即仅含有RINGv结构、无跨膜区的重组菌，记为OsTR1-1(32-81)。
IPTG 1mM、42℃、225rpm振荡培养10小时，生长曲线测定结果如表7及图6。
表7生长曲线测定结果(OD600值)
Figure BDA0000045818820000191
由结果可以看出，表达全长蛋白的OsTR1-1组耐热性最好，明显高于OsTR1-1+PTP、OsTR1-1+BOR5、OsTR1-1(32-81)及空载体对照；替换了跨膜区的OsTR1-1+PTP、OsTR1-1+BOR5组及OsTR1-1(32-81)组虽仍具有一定的耐热性，但明显低于OsTR1-1组；空载体对照的耐热程度最差，基本不能在42℃的高温环境中生长。
实施例十  AtTR1玉米同源蛋白ZmTR1结构研究
本实施例采用PTP跨膜区、BOR5跨膜区替换ZmTR1自身跨膜区(SEQ ID NO.57序列合成蛋白第175-234位氨基酸)，同时缺失ZmTR1自身跨膜区，以此研究ZmTR1、替换跨膜区的ZmTR1、仅含有RINGv结构(SEQ ID NO.57序列合成蛋白第68-118位氨基酸)且缺失跨膜区的ZmTR1(其氨基酸序列见SEQ ID NO.65)的耐热性。
实验方案参见实施例八，最终获得四种重组菌：
含有ZmTR1全长蛋白的重组菌，记为ZmTR1；
含有将ZmTR1自身跨膜区替换为PTP跨膜区的重组菌，记为ZmTR1+PTP；
含有将ZmTR1自身跨膜区替换为BOR5跨膜区的重组菌，记为ZmTR1+BOR5；
含有ZmTR1(68-118aa)的重组菌，即仅含有RINGv结构、无跨膜区的重组菌，记为ZmTR1(68-118)。
IPTG 1mM、42℃、225rpm振荡培养10小时，生长曲线测定结果见表8及图7。
表8生长曲线测定结果(OD600值)
Figure BDA0000045818820000201
由结果可以看出，表达全长蛋白的ZmTR1组耐热性最好，明显高于ZmTR1+PTP、ZmTR1+BOR5、ZmTR1(68-118)及空载体对照；替换了跨膜区的ZmTR1+PTP、ZmTR1+BOR5组及ZmTR1(68-118)组虽仍具有一定的耐热性，但低于ZmTR1组；空载体对照的耐热程度最差，基本不能在42℃的高温环境中生长。
实施例十一  过表达AtTR1、OsTR1-2、ZmTR1、RcTR1基因及其关键段的拟南芥的耐热性鉴定
将AtTR1基因(SEQ ID NO：1)、OsTR1-2基因(SEQ ID NO：47)、ZmTR1基因(SEQ IDNO：57)、RcTR1基因(SEQ ID NO：39)及其内挑选出的编码各自关键肽段SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：64的编码核苷酸序列转入拟南芥中，研究转AtTR1、OsTR1-2、ZmTR1、RcTR1基因及其关键肽段基因拟南芥的耐热性。
载体构建方法参见实施例二，利用花序浸染法转化拟南芥。详细步骤如下：
1、挑取含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：39，及SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：64的过量表达重组质粒的农杆菌接种于含20mg/L Str，50mg/L Kan，40mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜后收集菌体，重悬于含0.01％表面活性剂silwet-77的MS液体培养基中至OD600＝0.4-0.6，28℃摇菌1-2h，菌液待用。
2、将培养60天的拟南芥已长出的花序剪掉，用含有重组质粒的农杆菌菌液浸泡花序2分钟，之后暗培养48小时，暗培养后的拟南芥苗即可移入正常光照环境生长，随后长出的荚果即为转基因T0代种子。
3、将收获的种子栽种，长至50天左右，通过PCR鉴定，获得以下表达的阳性植株：
含有AtTR1(SEQ ID NO：1)的转基因拟南芥记为AtTR1，
含有AtTR1基因关键肽段(SEQ ID NO：63)编码序列的转基因拟南芥记为R-AtTR1，
含有OsTR1-2(SEQ ID NO：47)的转基因拟南芥记为At-OsTR1-2，
含有OsTR1-2基因关键肽段(SEQ ID NO：67)编码序列的转基因拟南芥记为At-R-OsTR1-2，
含有ZmTR1(SEQ ID NO：57)的转基因拟南芥记为At-ZmTR1，
含有ZmTR1基因关键肽段(SEQ ID NO：65)编码序列的转基因拟南芥记为At-R-ZmTR1，
含有RcTR1(SEQ ID NO：39)的转基因拟南芥记为At-RcTR1，
含有RcTR1基因关键肽段(SEQ ID NO：64)编码序列的转基因拟南芥记为At-R-RcTR1，
转基因植株成熟后，收集种子备用。
4、种子热胁迫萌发实验
配制好的MS培养基(配方见表8，pH用KOH调至5.8)，高压蒸汽灭菌后分装到培养皿中。培养基凝固后用2mL无菌水悬浮种子转入培养基上，待种子均匀播种后除去多余无菌水，打开皿盖，于无菌环境中放置1h至表面干燥，封口。
实验处理分两组，第一组为热激组：将播种后的培养皿放到培养室(50℃，光照强度6000～8000lx，16h/8h光暗周期，相对湿度70％)热激处理2小时，之后移至常温环境生长(22℃，光照强度6000～8000lx，16h/8h光暗周期，相对湿度70％)，每天观察萌发及其他表型，统计萌发率。第二组为未热激对照组：将播种后的培养皿放到培养室(22℃，光照强度6000～8000lx，16h/8h光暗周期，相对湿度70％)生长，每天观察萌发及其他表型，统计萌发率。实验结果见表9。
表8  MS培养基配方
Figure BDA0000045818820000221
表9  拟南芥种子热激后萌发率
  50℃热激后22℃第5天   未热激生长第5天
  AtTR1   74％   100％
  R-AtTR1   62％   100％
  At-OsTR1-2   56％   96％
  At-R-OsTR1-2   40％   98％
  At-ZmTR1   60％   100％
  At-R-ZmTR1   42％   98％
  At-RcTR1   48％   100％
  At-R-RcTR1   30％   100％
  WT   6％   98％
结果发现，通过热激处理后，拟南芥种子的萌发受到了影响，无论是转基因型还是非转基因对照，热激后的萌发率均低于未热激处理的常温生长组。通过对比发现，转入AtTR1、OsTR1-2、ZmTR1、RcTR1全序列的转基因拟南芥AtTR1、At-OsTR1-2、At-ZmTR1、At-RcTR1受热激的影响程度最小，萌发率74％-48％；转入AtTR1、OsTR1-2、ZmTR1、RcTR1关键序列的转基因拟南芥R-AtTR1、At-R-OsTR1-2、At-R-ZmTR1、At-R-RcTR1受热激的影响程度较小，较非转基因对照而言，仍具有一定的耐热性，萌发率62％-30％，而非转基因型WT的萌发率仅为6％。
将热激处理后的拟南芥继续至于22℃，光照强度6000～8000lx，16h/8h光暗周期，相对湿度70％环境中生长，结果发现，随着时间延长，非转基因对照无法生长出绿色基叶，苗色为黄色或白色，最终死亡；而转基因型均能长出绿色基叶，且生长状况良好，可开花结实。
说明，AtTR1基因、OsTR1-2基因、ZmTR1基因、RcTR1基因无论是全序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：39)还是关键序列(SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：64)均可以提高植物对高温的耐受性，使其萌发、生长维持良好状态。
实施例十二  AtTR1、OsTR1-1、ZmTR1蛋白的E3泛素连接酶活性
配制20ul反应体系：1ug E1蛋白，2ug E2蛋白，4ug AtTR1蛋白(或OsTR1-1蛋白、或ZmTR1蛋白)，0.1mmol/L泛素(Ub)，2mmol/L ATP，5mmol/L MgCl2，50mmol/L Tris，pH7.5。于30℃条件下反应。反应90min之后加入6×SDS-PAGE上样缓冲液中止反应，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳。
电泳后电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，随后用抗Ub的单克隆抗体(购自Santa Cruz)和碱性磷酸酶(AP)偶联的鼠抗鼠二抗(购自Promega)进行Western Blot检测。
结果如图8、9、10显示，体外蛋白反应中，AtTR1、OsTR1-1、ZmTR1蛋白在合适的E1、E2、ATP及Ub共同作用下，Ub可与AtTR1、OsTR1-1、ZmTR1蛋白连接，并形成多聚链，从图中可看出，同时加入E1、E2、ATP及Ub的泳道中出现多条信号带，而对照没有任何信号带，表明AtTR1、OsTR1-1、ZmTR1蛋白具有泛素E3连接酶活性，能催化单体或多聚泛素的形成。
由上述实例可见，本发明蛋白质AtTR1及其在玉米、水稻、蓖麻等植物中的同源蛋白都具有提高植物或微生物耐热性的功能。研究发现，此类蛋白均含有RINGv型的锌指结构，且均属于E3连接酶，通过本发明的研究，找出了此类蛋白发挥作用的关键区域——RINGv锌指结构，含有此结构的E3连接酶蛋白即可使植物、微生物的耐热性有所提高，去除此结构的蛋白则完全失去提高植物、微生物耐热性的作用。除此之外还对此类蛋白的跨膜区进行研究，研究发现蛋白自身的跨膜结构能更好的提高植物、微生物的耐热性，但替换成其他跨膜结构后，仍具有一定耐热性，且耐热程度高于非转基因型。综上可见，RINGv的锌指结构才是AtTR1此类蛋白发挥功效的关键结构，即具有N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’或者进一步具有N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24-C’(其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量)的肽段是带来耐热性的关键肽段。本发明提供的这一类编码耐热蛋白质的基因及其所编码的蛋白质，还有能带来耐热作用的多肽，以及这些基因、蛋白质和多肽在提高植物和微生物的耐热性中的用途。为本领域提供了新的备选基因，具有很好的应用前景。
Figure IDA0000045818910000011
Figure IDA0000045818910000021
Figure IDA0000045818910000041
Figure IDA0000045818910000051
Figure IDA0000045818910000061
Figure IDA0000045818910000071
Figure IDA0000045818910000081
Figure IDA0000045818910000091
Figure IDA0000045818910000101
Figure IDA0000045818910000111
Figure IDA0000045818910000121
Figure IDA0000045818910000131
Figure IDA0000045818910000141
Figure IDA0000045818910000151
Figure IDA0000045818910000161
Figure IDA0000045818910000171
Figure IDA0000045818910000181
Figure IDA0000045818910000191
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Figure IDA0000045818910000241
Figure IDA0000045818910000251
Figure IDA0000045818910000261
Figure IDA0000045818910000271
Figure IDA0000045818910000281

Claims (43)

1.编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于含有编码下述肽段的核苷酸序列：
N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’，其中X为任意氨基酸，下标的数字表示氨基酸残基的数量。
2.根据权利要求1所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于所述的肽段为：N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24-C’，其中X为任意氨基酸，下标的数字表示氨基酸残基的数量。
3.根据权利要求1所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于所述的蛋白质为泛素连接酶。
4.根据权利要求1所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的蛋白为跨膜蛋白。
5.根据权利要求1所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的蛋白还含有跨膜区。
6.根据权利要求4所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的蛋白还含有1～6个跨膜区。
7.根据权利要求4所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的蛋白还含有2～3个跨膜区。
8.根据权利要求7所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的跨膜区的结构为N’-A X2-6 CRS X2-8 LIL X2-4 LL X1-4 LR X1-10-C’或者N’-L X2-4 R X1-5GFLL X1-7 YIMAW X1-15-C’所示的至少一种，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。
9.根据权利要求4所述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的蛋白还含有信号肽。
10.权利要求9述编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述的信号肽为膜定位信号肽。
11.根据权利要求1～4任一项所述的编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述基因来源于植物的基因组。
12.根据权利要求5所述的编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：所述植物为拟南芥、水稻、玉米或蓖麻。
13.根据权利要求1～12任一项所述的编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：(1)：所述基因具有SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列；
或者(2)：所述基因具有在(1)所述的任一条核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且编码具有相同或相似的功能的蛋白质。
14.根据权利要求11所述的编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因，其特征在于：(1)：所述基因具有、SEQ ID NO：57中的第158～1018位、SEQ ID NO：45中的第96～848位、SEQ ID NO：47中的291～1127位或SEQ ID NO：39中的第68～946位所示的核苷酸序列；
或者(2)：所述基因具有在(1)所述的任一条核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且编码具有相同或相似的功能的蛋白质。
15.提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于含有下述肽段：
N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。
16.根据权利要求15所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的肽段的结构为：N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2 SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24-C’，其中X为任意氨基酸。
17.根据权利要求15所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白还含有跨膜区。
18.根据权利要求17所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白还含有1～6个跨膜区。
19.根据权利要求18所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白含有2～3个跨膜区。
20.根据权利要求17所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的跨膜区的结构为N’-A X2-6 CRS X2-8 LIL X2-4 LL X1-4 LR X1-10-C’或者N’-L X2-4 R X1-5 GFLL X1-7YIMAW X1-15-C’所示的至少一种，其中X为任意氨基酸，下标的数字表示氨基酸残基的数量。
21.根据权利要求15所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质为泛素连接酶。
22.根据权利要求15所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白还含有信号肽。
23.权利要求22所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的信号肽为膜定位信号肽。
24.根据权利要求15～23任一项所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质来源于植物。
25.根据权利要求15～24任一项所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质，其特征在于：(1)所述蛋白质具有由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：57中的第158～1018位、SEQ ID NO：45中的第96～848位、SEQ ID NO：47中的291～1127位或SEQ ID NO：39中的第68～946位所示的核苷酸序列所编码得到的氨基酸序列；
或者(2)：所述基因具有在(1)所述的任一条氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且具有相同或相似的功能。
26.编码权利要求15～25任一项所述的提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因。
27.肽段，其特征在于：含有N’-CRICQE X7-45 PCAC X6 AHR X1 CVQ X13-27-C’所示的结构域，其中X为任意氨基酸，下标表示氨基酸残基的数量。
28.根据权利要求27所述的肽段，其特征在于：含有N’-CRICQEED X3-20 NL X3-20 PCAC X2SLK X1 AHR X1 CVQRWC X10-24-C’所示的结构域，其中X为任意氨基酸下标为氨基酸残基的数量。
29.根据权利要求27所述的肽段，其特征在于：来源于植物。
30.根据权利要求27所述的肽段，其特征在于：所述植物为拟南芥、水稻、玉米或蓖麻。
31.根据权利要求27或28所述的肽段，其特征在于：所述肽段能形成锌指结构。
32.根据权利要求27或28所述的肽段，其特征在于：所述肽段能赋予蛋白质提高植物或微生物耐热性的功能。
33.根据权利要求27～32任一项所述的肽段，其特征在于：具有如下多肽序列：
(1)：如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列；
或者，在(1)所述的任一条多肽的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且具有相同或相似的功能。
34.编码权利要求27～33任一项所述的肽段的核苷酸序列。
35.将编码非耐热蛋白质的基因改造为编码耐热蛋白质的基因的方法，其特征在于具有以下步骤：将编码权利要求27～33任一项所述的肽段的核苷酸序列添加入编码非耐热蛋白质的基因中或替换掉编码非耐热蛋白质的基因其中的一段核苷酸序列，所述的添加或替换是发生在密码子之间，以使整个改造后的基因仍然具有编码完整蛋白质的能力。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于所述的编码非耐热蛋白质的基因中被替换的一段核苷酸序列为编码锌指结构域的核苷酸序列。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其特征在于：所述的非耐热蛋白质为泛素连接酶。
38.提高植物耐热性或制备高耐热性植物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、将权利要求1～14任一项所述的基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成可表达该基因的重组载体；
b、将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；
c、经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因植株或其后代，所述后代包括植物种子或植物组织。
39.含有权利要求1～14任一项所述的编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因的载体。
40.根据权利要求39所述的载体，其特征在于：所述的载体为表达载体。
41.根据权利要求40所述的载体，其特征在于：所述的表达载体为真核表达载体。
42.含有权利要求1～14任一项所述的编码提高植物或微生物耐热性的蛋白质的基因的宿主细胞。
43.根据权利要求40所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为植物细胞或微生物。
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