CN102112613B

CN102112613B - 提高植物和微生物抗逆性的基因、多肽、载体及其应用

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Publication number: CN102112613B
Application number: CN2009801190462A
Authority: CN
Inventors: 杨毅
Original assignee: SICHUAN BIODESIGN BIOLOGY GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SICHUAN BIODESIGN BIOLOGY GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2009-07-23
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2029-07-23
Also published as: EA024524B1; US8586830B2; WO2010020143A1; CN101638658A; CA2732493A1; AU2009284619A1; EP2319930A4; CN102112613A; CA2732493C; US20110258740A1; EP2319930A1; EA201170263A1; AU2009284619B2; BRPI0916604A2

Abstract

一种新的基因、含有该基因的重组表达载体、该基因编码的多肽及其用途。该基因能够有效提高植物和微生物的多种抗逆性，如抗旱性、耐酸碱性、耐盐碱性和耐热性。本发明还提供了制备转基因植物和微生物的方法。该方法简便有效，所得转基因植物和微生物显示出良好的抗逆性。

Description

提高植物和微生物抗逆性的基因、多肽、载体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种新的基因、该基因编码的多肽、含有该基因的重组载体及其在改良植物和微生物抗逆性上的应用。

背景技术

随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善，植物和微生物基因工程研究正向纵深发展，抗性基因研究已由抗生物逆性(如抗病、抗虫)向抗寒、抗旱、抗热、抗盐碱、耐酸碱等抗非生物逆性研究转移。

由于二氧化碳排气量增加，因而地球的温室效应不断加剧，导致全球性气候变暖，预计未来100年全球平均气温可能上升1.4-5.8℃。全球性的气候变暖，造成农业生态环境日趋恶化。专家预测：气候变暖可能使作物减产17％。IRRI(国际水稻研究所)研究证实：1998-2003年，气温升高了1℃，产量降低了10％。在中国，专家们认为，到2050年，全国平均气温将上升2.2℃。在自然环境下生长的植物都受到温度升高的影响，使植物的生长出现障碍，特别是一些大春作物，如水稻、玉米等在抽穗、灌浆期间，很容易受到高温天气的影响，造成农作物的减产。另一方面，根据FAO(国际粮农组织)分析，到2050年，世界人口将突破100亿。随着人口的进一步增加，农业面临的人口压力进一步增加，世界范围内的粮食短缺状况将长期存在。受到全球气候变暖的影响，大量的草本植物会出现生长障碍、甚至死亡，从而破坏生态平衡。因此，各国科学界都在努力寻找提高植物热耐受性的相关基因。迄今为止，仅发现少数的热激蛋白基因以及它们的转录因子与耐热相关，未见到任何一个单独的基因能增加细菌和植物耐热性的报道。

目前世界上有100多个国家存在不同类型盐碱地10亿hm²，约占全球可耕地面积的10％。仅中国盐碱地面积就达9913万hm²，主要分布在华北、西北和东北等干旱、半干旱地区。中国东北西部松嫩平原有盐碱地面积370余万hm²，是世界上三大苏打盐碱地集中分布区之一。同时，由于工业污染、不合理灌溉和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积也在迅速增加。盐碱地影响植被生长，使农作物减产或绝收，并间接造成生态环境恶化，且能腐蚀损坏工程设施，所造成的损失每年达25.11亿元。因此，如何减轻土壤盐碱化对作物的危害，充分利用有限的土地资源成为农业可持续发展亟待解决的重要课题之一。除利用传统的物理、化学、生物等措施进行综合治理外，应用最新的分子生物学方法，通过基因工程提高作物耐性将是最经济有效的方法之一。

盐碱土是含过多的NaCl、Na₂SO₄、Na₂CO₃和NaHCO₃等盐类的土壤。盐碱土对植物的毒害主要包括盐胁迫和高pH胁迫及这两种因素相互作用产生的复合毒害。盐碱胁迫对植物造成的主要伤害表现在以下三个方面：一是细胞质中金属离子(主要是Na)的大量积累，它会破坏细胞内离子平衡并抑制细胞内生理生化代谢过程，使植物光合作用能力下降，最终因碳饥饿而死亡；二是盐碱土壤是一个高渗环境，它能阻止植物根系吸收水分，从而使植物因“干旱”而死亡；三是盐碱土壤pH值较高，这使得植物体与外界环境酸碱失衡，进而破坏细胞膜的结构，造成细胞内溶物外渗而使植物死亡。因而，受盐碱胁迫的植物一方面要降低细胞质中离子积累，另一方面还通过积累过程产生某些特殊的产物，如蛋白质、氨基酸、糖类等来增强细胞的渗透压，阻止细胞失水，稳定质膜及酶类的结构。

由于盐碱地广泛存在，该领域的研究正在成为一个新的热点。现在的研究主要集中在盐碱地植物如何响应pH胁迫，对生理表型和基因表达都仅是初步探索，主要的研究对象是一些耐盐碱植物，如星星草、羊草、向日葵、白刺等。但在分子水平上研究植物响应高pH胁迫的进程进展。本领域需要开发出能够提高植物耐盐碱性的备选基因，以及运用基因工程技术提高植物的耐盐碱性的方法。

环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即pH值来表示。环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：由于pH的变化引起微生物体表面的电荷变化，进而影响微生物对营养物的吸收；pH除了对微生物细胞有直接影响外，还可以影响培养基中有机化合物的离子化作用，从而对微生物有间接影响，因为多数非离子状态化合物比离子状态化合物更容易渗入细胞；酶只有在最适宜的pH值时才能发挥最大活性，不适宜的pH值使酶的活性降低，进而影响微生物细胞内的生物化学过程；过高或过低的pH都降低微生物对高温的抵抗能力。

微生物在基质中生长，代谢作用会改变基质中氢离子浓度。随着环境pH值的不断变化，微生物生长受阻，当超过其能耐受的最低或最高pH值时，将引起微生物的死亡。随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善，因工程研究正向纵深发展，培育出抗性微生物品种也是一个可行之道，其关键是寻找到有效的能够提高微生物抗酸碱性的抗性基因。

水资源短缺是目前制约农业发展的一个全球性问题。据统计，全球约43％的耕地受到干旱、半干旱的威胁。干旱胁迫不仅严重影响作物生长发育、降低作物的产量，同时还限制优良作物品种的推广。因此，提高作物的抗旱能力是现代农业研究工作中的热点问题之一。

植物抗旱方面的研究涉及植物的形态、生理生化及分子生物学等诸多领域。植物在干旱条件下根系及叶片结构的变化，脱落酸(ABA)和气孔关闭的关系，渗透调节物质甘露醇、脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖、肌醇、多胺等小分子化合物与植物抗旱的关系，水孔蛋白、活性氧清除及胚胎发育晚期丰度蛋白对植物抗旱性的影响等抗旱方面的研究一直受到人们的关注。

随着分子生物学研究的发展，人们相继发现并克隆出了一些重要的耐旱基因，获得了烟草、水稻等抗旱转基因植株。并已在水稻上成功的进行了转抗旱基因水稻品系的培育，这为其他植物的转抗旱基因的研究带来了广阔的应用前景。目前利用基因工程技术培育抗旱品种主要有两种策略：增加植物渗透性代谢产物的合成能力，使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质(如甘露醇、甜菜碱、海藻糖等)，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性；增强植物对活性氧自由基的清除能力，使植物在水分胁迫下过度表达一些酶(如SOD，POD，CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，从而提高细胞耐脱水的能力。由于渗透调节是植物主要的耐旱机制，近年来人们已利用植物基因工程手段来增加目标植物中脯氨酸和甜菜碱的合成，在以渗透调节为主的耐旱性转基因植物培育方面取得了可喜的进展。

脯氨酸是水溶性很大的氨基酸。它具有偶极性使其疏水端与蛋白质联结。而亲水端与水分子结合，从而使蛋白通过脯氨酸束缚更多的水分子，因此可增加蛋白质的可溶性，使更多的可溶性蛋白加入到渗透调节的行列中。同时束缚水含量的增加也能避免或减少因细胞脱水引起的蛋白质变性。因而增加脯氨酸的合成能力，可提高植物的抗旱性，在这方面有一些成功的报道。

总的来说，使用基因工程技术对植物进行改良是近年来的热点。使用基因工程技术以期提高植物的抗逆性，培育出耐逆性系也是一个可行之道。但是，目前还鲜见有能综合提高植物和微生物的多种抗逆性的单个基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供能提高植物和微生物抗逆性的基因、所编码的多肽及其装载该基因的载体。本发明的再一目的是提供植物或细菌转基因的方法和检测所述基因是否转入宿主的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明基因具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

或者，本发明基因具有在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸所得的衍生序列，且该衍生序列与SEQ ID NO：1的序列编码功能相同的多肽。

其中，上述的功能为提高植物或微生物的抗逆性。

其中，上述的抗逆性为抗旱性、耐酸碱性，耐盐碱性或耐热性中的至少一种。

进一步的，上述基因具有序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

本发明多肽：(1)氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示；

或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸形成的衍生氨基酸序列。

其中，上述的多肽具有能提高植物或微生物的抗逆性的功能。所述抗逆性为抗旱性、耐酸碱性，耐盐碱性或耐热性中的至少一种。

本发明提供了编码上述多肽的基因。同时也提供了针对上述多肽的单克隆抗体。

本发明还提供了上述的基因在提高植物和微生物抗逆性中的应用。其中，所述抗逆性为抗旱性、耐酸碱性，耐盐碱性或耐热性中的至少一种。当然，本发明多肽也能用于提高植物和微生物抗逆性。

为了更好地实现上述的用途，本发明还提供了一种重组载体，该重组载体含有上述的基因。进一步的，上述的重组载体可以表达本发明基因。更进一步的，上述的重组载体为重组质粒。

本发明也提供了含有上述重组载体的宿主细胞，以及含有上述重组载体的转基因植物或转基因微生物。

基于上述产品和用途，本发明提供了一种植物转基因的方法，其步骤如下：

(1)将上述的基因可操作地连于表达载体上的植物表达调控序列，形成含SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的重组表达载体；

(2)将步骤(1)中的重组表达载体转入植物细胞；

(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞再生形成转基因植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

同时本发明也提供了一种微生物转基因的方法，其步骤如下：

(1)将上述的基因可操作地连于表达载体上的微生物表达调控序列，形成含SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的重组表达载体；

(2)将步骤(1)中的重组表达载体转入微生物；

(3)经筛选获得转化的微生物。

通过使用上述方法，可以制备抗逆性提高的植物或微生物。

为了更好的实施上述技术方案，本发明还提供了一种样品中是否含有上述基因的序列的检测方法，该方法用待检测的目标基因制备的探针与样品进行杂交，然后检测样品与探针是否发生结合，若样品与探针结合，则样品中含有SEQ ID NO：1所述基因的序列；所述样品是被检测植株基因组经PCR扩增后的产物。

进一步的，上述PCR扩增引物对应于上述基因的核苷酸序列的两侧或中间，引物长度为15～50个核苷酸。

其中，上述探针具有目标基因的核苷酸序列中的8～100个连续核苷酸。优选的，上述的探针具有目标基因的核苷酸序列中的15～50个连续核苷酸。

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT1基因在提高植物抗旱性方面的用途，在本发明的实施例中也通过实验证明转入了TT1基因并过表达的植物在干旱环境下其种子萌发率有了明显提高，生长后的植株中的脯氨酸含量也有提高，其幼苗的生长情况也更有证明了TT1基因能有效的提高植物抗旱性。本发明培育出抗旱植物的方法也简便而有效，为提高植物耐盐碱性提供了新的有效选择，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是含SEQ ID NO：1重组质粒的大肠杆菌和含pET28的大肠杆菌(E.colipET28)在42℃的生长状况图。图1-A：E.coli pET28菌株在42℃的生长状态图；图1-B：含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株在42℃的生长状态图；图1-C：两种菌株在同一个培养平板上于42℃的生长状态图。

图2是含SEQ ID NO：1重组质粒的大肠杆菌和含pET28的大肠杆菌(E.colipET28)在44℃生长条件下的生长曲线比较图。其中，矩形符号所示曲线为含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28(简写为Zn-PET28)菌株在44℃的生长曲线，表明含SEQID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株在44℃条件下生长正常；三角形符号所示的曲线为E.coli pET28(简写为PET28)菌株在44℃的生长曲线，表明E.coli pET28菌株在44℃条件下不能生长。

图3是PCR检测SEQ ID NO：1过量表达甘蓝型油菜转基因株系和SEQ ID NO：1抑制表达甘蓝型油菜转基因株系的结果图。图3-A：SEQ ID NO：1过量表达甘蓝型油菜转基因株系的检测结果图，图中，M：marker，1、2、3、4：SEQ ID NO：1过量表达甘蓝型油菜转基因株系；图3-B：SEQ ID NO：1抑制表达甘蓝型油菜转基因株系的检测结果图，图中，M：marker，1、2：SEQ ID NO：1抑制表达甘蓝型油菜转基因株系。如图所示，所检测出目的条带的大小和预期SEQ ID NO：1大小一致，约为860bp。

图4是SEQ ID NO：1过量表达甘蓝型油菜转基因株系和SEQ ID NO：1抑制表达甘蓝型油菜转基因株系与甘蓝型油菜的高温耐受能力对比图。

其中，图4-A：正常生长温度情况下(22℃)，转基因甘蓝型油菜和甘蓝型油菜的生长状态图，如图所示，转基因甘蓝型油菜和甘蓝型油菜均生长正常；图4-B：当温度提高到34℃，生长3天后，转基因甘蓝型油菜和甘蓝型油菜的生长状态图，如图所示，SEQ ID NO：1过量表达甘蓝型油菜转基因株系(Zn-OE)生长正常，甘蓝型油菜(WT)生长延缓，SEQ ID NO：1抑制表达甘蓝型油菜转基因株系(Zn-DN)生长出现较大的延缓；图4-C：当温度提高到34℃，生长5天后，转基因甘蓝型油菜和甘蓝型油菜的生长状态图，如图所示，SEQ ID NO：1过量表达甘蓝型油菜转基因株系(Zn-OE)生长正常，甘蓝型油菜(WT)死亡，SEQ ID NO：1抑制表达甘蓝型油菜转基因株系(Zn-DN)死亡。

图5是在34℃处理3-5天后，SEQ ID NO：1核苷酸序列过量表达和抑制表达的转基因甘蓝型油菜与甘蓝型油菜的高温耐受能力的对比情况图。图5-A：三种植株在34℃处理3天后的生长状态图，如图所示，SEQ ID NO：1核苷酸序列过量表达转基因甘蓝型油菜(Zn-OE)生长正常，甘蓝型油菜(WT)生长延迟，植株叶片出现黄色、卷曲的特征，SEQ ID NO：1核苷酸序列抑制表达的转基因甘蓝型油菜(Zn-DN)发黄、叶片明显卷曲、生长停顿等特征；图5-B：三种植株在34℃处理5天后的生长状态图，如图所示，SEQ ID NO：1核苷酸序列过量表达转基因甘蓝型油菜(Zn-OE)生长正常，SEQ ID NO：1核苷酸序列抑制表达的转基因甘蓝型油菜(Zn-DN)和甘蓝型油菜(WT)死亡。

图6是SEQ ID NO：1核苷酸序列过量表达和抑制表达的转基因甘蓝型油菜与甘蓝型油菜在转录水平上SEQ ID NO：1核苷酸序列表达差异的比较分析图。如图所示，SEQ ID NO：1核苷酸序列过量表达甘蓝型油菜(Zn-OE)中，SEQ ID NO：1基因表达量增加，是甘蓝型油菜的2.5倍；在SEQ ID NO：1核苷酸序列抑制表达甘蓝型油菜(Zn-DN)中，SEQ ID NO：1基因表达量减少，只有野生型甘蓝型油菜(WT)的一半。

图7是含有SEQ ID NO：1核苷酸序列的pGEX-2T(GTK-Zn)重组质粒在E.coli 中诱导表达结果图。图中：1：GTK(空载体pGEX-2T)在E.coli中的表达情况，2：Marker。3-7：GTK-Zn(带有SEQ ID NO：1核苷酸序列的蛋白质重组质粒)在E.coli中的表达情况；3、4：IPTG诱导两小时，5、6：IPTG诱导三小时，7：IPTG诱导四小时；黑色箭头代表表达出的蛋白质为58KD。如图所示，在E.coli中，含有SEQ ID NO：1序列的pGEX-2T重组质粒(GTK-Zn)在E.coli中诱导表达出与预期一致的蛋白质条带(58KD)。

图8是含有SEQ ID NO：1替换和缺失所衍生核苷酸序列(SEQ ID NO：4所示序列)的重组质粒的大肠杆菌和含pET28的大肠杆菌在42℃的生长状况图，证明SEQ IDNO：1替换或缺失的衍生核苷酸序列同样提高细菌对高温的耐受性。图8-A：含pET28的大肠杆菌在42℃的生长状态图；图8-B：含SEQ ID NO：4重组质粒的大肠杆菌在42℃的生长状态图。

图9是干旱胁迫后转TT1基因油菜脯氨酸(Pro)含量测定结果图。其中OE(1)、OE(2)、OE(3)为3个TT1基因过量表达转基因甘蓝型油菜株系，WT为野生型甘蓝型油菜；纵坐标为脯氨酸含量，单位为μg/g。

图10是停止浇水当天的照片，左为野生型，右为转基因型。

图11是停止浇水5天后的照片，左为野生型，右为转基因型。

图12是停止浇水8天后的照片，左为野生型，右为转基因型。

图13是琼脂糖电泳检测目的基因是否已转入拟南芥图，1～12道为转基因拟南芥基因组DNA，13道为含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒DNA。

图14是不同浓度(mmol/L)NaCl对非转TT1基因拟南芥种子萌发率的影响图。

图15是不同浓度(mmol/L)NaCl对过表达TT1基因拟南芥种子萌发率的影响图。

图16是不同处理组的脯氨酸含量(μg/g)图。其中RLD为野生型，OEa、OEb、OEc、OEd为过表达TT1基因拟南芥株系，纵坐标为脯氨酸含量(μg/g)。

图17是不同处理组脯氨酸红色甲苯溶液在比色杯中的颜色图。其中RLD为野生型，OEa、OEb、OEc、OEd为过表达TT1基因拟南芥株系。

图18是pH4.0，37℃转TT1基因大肠杆菌和非转基因大肠杆菌的生长情况图。纵坐标为OD600值，横坐标为培养时间。

图19是pH值分别为4.0、5.5、7.0、8.5、10.0时，在37℃下14h后，转TT1基因(T)和非转基因大肠杆菌(C)的生长情况图。

具体实施方式

本发明中所述的基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，该基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜(Brassica napus)，以油菜中的atp6基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法，筛选到油菜中的一个EST序列，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE的方法获得序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。然后根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列设计一对PCR引物，从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明所述重组载体，是将TT1基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如pBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组载体转化宿主细胞或宿主微生物，这些宿主包括原核宿主和真核宿主。常用的真核宿主包括酵母和其它植物细胞，常用的原核宿主为大肠杆菌等。

本发明所述提高植物和微生物耐热性的多肽，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，或SEQ ID NO：2中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所得的衍生序列，且该衍生序列与SEQ ID NO：2的序列功能相同。

本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明的一个实施例中，将步骤(1)中的重组质粒转入农杆菌，将含重组质粒的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选(如抗生素筛选)，获得含有SEQ ID NO：1所示核苷酸的转化细胞，并再生转基因植株及其后代。

在本发明中，“SEQ ID NO：1”指编码具有SEQ ID NO：1蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO：1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的同源性至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物的抗旱性。

该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO：1相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，SEQ ID NO：2蛋白或多肽指具有SEQ ID NO：1编码的蛋白活性多肽。这些变异形式包括但并不限于若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SEQ ID NO：2蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的SEQ ID NO：2多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与SEQ ID NO：1杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用SEQ ID NO：2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SEQ ID NO：2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括SEQ ID NO：2多肽的可溶性片段。该片段可具有SEQ ID NO：2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“SEQ ID NO：2保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1氨基酸替换表

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu

[0073]

Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括SEQ ID NO：2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO：2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

还可用Northern印迹法技术分析SEQ ID NO：1基因产物的表达，即分析SEQ IDNO：1的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。SEQ ID NO：1RNA的Northern印迹分析和SEQ ID NO：2特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实SEQ ID NO：1在生物样本中的表达。

此外，根据本发明的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选SEQ ID NO：1同源基因或同源蛋白。

为了得到与SEQ ID NO：1基因相关的油菜oDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对SEQQID NO：1所示的核苷酸序列的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与SEQ ID NO：1相关的基因家族的核苷酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照生产制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用载体pET28，pGEX-2T，pGEM-T购自于Qiagen公司，菌株BL21购自于Qiagen公司，菌株EHA105、载体pBI121购自于Clontech公司。其余化学试剂均为市售分析纯。下述实施例中，“SEQ ID NO：1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ ID NO：l所示核苷酸序列”的简称，“SEQ ID NO：4”单独出现时，本领域技术人员可理解其为“SEQ ID NO：4所示核苷酸序列”的简称。

实施例一：本发明新基因的克隆及获取

以油菜中的atp6(genebank gi：89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法(见C1ontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID NO：3所示，编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列)，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE(见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明所述基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物：

上游引物(SEQ ID NO：7)：5’-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO：8)：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2～4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到序列SEQ ID NO：1的基因片段。

实施例二：表达SEQ ID NO：1的大肠杆菌的构建

1、构建重组质粒及分子验证

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO：9)：5’-CGCGGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO：10)：5’-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒说明书)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与原核表达载体PET28连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获得含有SEQ ID NO：1序列的重组质粒，将重组质粒转化E.coli，涂布于含Amp的LB固体培养基上，经测序验证，得到含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株。

实施例三：表达SEQ ID NO：1的大肠杆菌中的耐热性能试验

含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株的高温耐受性验证：将OD值为0.3的含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株、OD值为0.3的宿主菌株E.colipET28，以1％的接菌量分别涂布于LB固体培养基中，42℃培养过夜。实验显示：宿主菌株E.coli pET28在42℃处理后不能生长(见图1-A)；含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株在42℃的生长良好(见图1-B)。

按上述实验操作比较含SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株与宿主菌株E.coli pET28在44℃温度条件下的生长情况。实验显示：含SEQ ID NO：1重组质粒的Ecoli pET28菌株的生长曲线呈对数增长(见图2，Zn-pET28)，说明在44℃温度条件下生长正常；宿主菌株E.colipET28在44℃温度条件下不能生长(见图2，pET28)。

实验结果表明：含有SEQ ID NO：1重组质粒的E.coli pET28菌株具有高温耐受性。

实施例四：SEQ ID NO：1在油菜细胞中表达及转基因植株的制备

1、目的基因过量表达重组质粒和抑制表达重组质粒的构建

(1)目的基因过量表达重组质粒的构建

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO：11)：5’-CGCGGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’；

下游引物(SEQ ID NO：12)：5’-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。将含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌中，利用下胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜。

(2)目的基因抑制表达重组质粒的构建

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO：13)：5’-CCGGAGCTCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO：14)：5’-CGCGGATCCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的抑制表达重组质粒。将含SEQ ID NO：1的抑制表达重组质粒转入农杆菌中，利用下胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜(见步骤2)。

2、胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜

(1)无菌苗的获取

选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4℃过夜春化(保持种子发芽同步)，然后取出，用70％乙醇浸泡30s，0.1％的升汞(HgCl₂)溶液浸泡8-10min，无菌水冲洗5次，滤纸吸干，接种于MS固体培养基上。置培养室中24℃，暗培养2-3天，然后取出光照16h/d继续萌发。取5-7cm(约7-8天)无菌苗下胚轴作为转化受体。

(2)下胚轴的预培养

将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均匀置于预培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L2，4-D，2.5mg/L AgNO₃，19.62mg/L AS)中进行2～3天的预培养(可见下胚轴变粗)。

(3)下胚轴的浸染及共培养

挑取含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌、含SEQ ID NO：1的抑制表达重组质粒的农杆菌，分别接种于含20mg/L Str，50mg/L Kan，40mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜后收集菌体，重悬于含100mg/L AS的MS液体培养基中至OD₆₀₀＝0.4-0.6，28℃摇菌1-2h。

将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌和含SEQ ID NO：1的抑制表达重组质粒的农杆菌的菌液中30s-1min，此期间不断振荡使菌液与油菜下胚轴充分接触。用无菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/L AgNO₃，19.62mg/L AS)上，共培养2d。

(4)筛选培养与芽的诱导

将共培养后的两种油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/L AgNO₃，19.62mg/L AS)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4周，得到愈伤芽。

(5)生根

在筛选培养基(MS+2mg/L 6-BA，2.5mg/L AgNO₃，500mg/L Carb，10mg/L Kan)上待两种愈伤芽长至有4-6片真叶时，将芽从愈伤组织中切下，移入生根培养基(1/2MS，0.15mg/L NAA，250mg/L Cef)中。待再生苗根系生长发达时，将培养罐移至室外2-3d，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2-3d。

(6)盆栽培养

将含SEQ ID NO：1的过量表达和含SEQ ID NO：1的抑制表达转基因植株分别在生根培养基上发育出完整根系，将其转入盆栽。

(7)转基因油菜的PCR检测

待土壤中两种再生植株长大后，各取叶片少量抽提总DNA，以提取的DNA做模板，分别进行PCR检测。

I.目的基因过量表达甘蓝型油菜转基因株系检测

上游引物(SEQ ID NO：15)：5’ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3’

下游引物(SEQ ID NO：16)：5’TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT 3’

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环37次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现，若有则代表目的基因已转入甘蓝型油菜。检测结果见图3-A。

II.目的基因抑制表达甘蓝型油菜转基因株系检测

上游引物(SEQ ID NO：17)：5’ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3’

下游引物(SEQ ID NO：18)：5’ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG 3’

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环37次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现，若有则代表目的基因已转入甘蓝型油菜。检测结果见图3-B。

3、利用RT-PCR检测SEQ ID NO：1在转基因油菜植株中的表达

(1)含SEQ ID NO：1的过量表达和含SEQ ID NO：1的抑制表达转基因植株以及甘蓝型油菜的RNA制备与定量：制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。

(2)将含SEQ ID NO：1的过量表达和含SEQ ID NO：1的抑制表达转基因植株以及甘蓝型油菜的RNA分别反转录成单链cDNA。

分别取上述三种植物材料2ug总RNA，置65℃变性5min。在1.5ml Eppendorf管中依次加入下列物质：热变性RNA，4ul 5×lst Strand Synthesis Buffer，lul DNTP，lul RNase Inhibitor，lul Oligo(dT)18(0.5g/L)，1ul M-MLV，H₂O补足到20ul，混合均匀后，于42℃保温1h。

(3)半定量PCR反应

1)模板量的确定

先用actin基因作为内参，以反转录产物单链cDNA为模板进行PCR扩增，使上述三种反转录的单链cDNA所扩增的actin的量一致(以电泳条带的光密度值计量)，进一步确定所需的单链cDNA的模板量。

PCR扩增程序：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环27次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

2)循环数的确定

以上述三种反转录的单链cDNA为模板，分别对actin基因与SEQ ID NO：1基因进行PCR扩增，分别在15、18、21、24、27、30循环时取样跑电泳以确定指数增长期和平台期。在指数增长期进行样品的半定量PCR反应(21个循环)。

PCR扩增程序：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环21次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

试验结果证实：在SEQ ID NO：1过量表达转基因甘蓝型油菜(Zn-OE)中，SEQ IDNO：1基因表达量增加，是对照植株(甘蓝型油菜：WT)的2.5倍；在SEQ ID NO：1抑制表达转基因甘蓝型油菜(Zn-DN)中，SEQ ID NO：1基因表达量减少，只有对照植株(甘蓝型油菜：WT)的一半。检测结果见图6。

实施例五：含SEQ ID NO：1的转基因植株温度耐受性鉴定

将实施例四所获含SEQ ID NO：1的过量表达和抑制表达的甘蓝型油菜转基因株系的种子分别放置于湿润的滤纸上萌发，待破壳后移入腐殖土中，22℃培养15天左右(两片真叶长成)，然后转入34℃热胁迫，条件为日照14h、黑暗10h。热胁迫3天后，甘蓝型油菜生长受到抑制，含SEQ ID NO：1的抑制表达甘蓝型油菜转基因株系开始死亡，含SEQ ID NO：1的过量表达甘蓝型油菜转基因植株生长正常(见图4-B，图5-A)。热胁迫5天后，甘蓝型油菜和含SEQ ID NO：1的抑制表达甘蓝型油菜转基因株系都已经死亡，而含SEQ ID NO：1过量表达的甘蓝型油菜转基因植株尚存活，生长正常(见图4-C，图5-B)。

耐热性试验结果证实：含SEQ ID NO：1过量表达的甘蓝型油菜转基因植株对温度的耐受性提高，而含SEQ ID NO：1抑制表达的甘蓝型油菜转基因植株对热的耐受能力降低，说明SEQ ID NO：1的表达产物在功能上与耐热相关。

实施例六：SEQ ID NO：2所示多肽的表达和检测

1、含目的基因重组质粒的构建

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO：19)：5’-CCGGAATTCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO：20)：5’-GCTCTAGATC AGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用EcoR1与Xbal1酶切，胶回收，与原核表达载体pGEX-2T连接(连接位点：EcoR1与Xbal1)，获含SEQ ID NO：1基因的重组质粒，将上述重组质粒转化到E.coli菌株BL21。

2、诱导和纯化靶蛋白表达

(1)分别挑取对照菌(BL21+p6EX-2T：定义为GTK)和含有重组质粒菌(BL21+pGEX-2T-SEQ ID NO：1：定义为GTK-Zn)的1个单菌落，接入含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养液，37℃培养过夜。

(2)取5ml接入含氨苄青霉素(50ug/ml)的诱导培养液，37℃震荡培养至OD＝0.6-0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，30℃继续培养4h。

(3)5000g离心10min收集细胞。

(4)每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS。

(5)超声波破碎至重悬物澄清。

(6)4℃10000g离心30min，上清转移到一个新管中。

(7)细胞裂解物与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温轻摇30min。

(8)混合物于4℃以500g离心5min，去掉上清。

(9)沉淀中加入10倍柱床体积的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。

(10)4℃以500g离心5min，去掉上清。

(11)结合的GST融合蛋白用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱。

(12)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。

试验结果证实：在E.coli中，含SEQ ID NO：1基因的pGEX-2T(GTK-Zn)重组质粒在E.coli中诱导表达出与预期一致的蛋白质条带(58KD)，见图7。

实施例七：SEQ ID NO：1的替换与缺失及在大肠杆菌中的表达和耐热性能分析

1.核苷酸序列SEQ ID NO：1的替换与缺失

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，设计引物：

上游引物(SEQ ID NO：21)：5’-ATGGCTGATGATTTCAGTTTATGTAC-3’；

下游引物(SEQ ID NO：22)：5’-TTGGGTTGGATATTGGCGGCGGCTG-3’。

以连接有SEQ ID NO：1的载体pET28做模板，PCR扩增出SEQ ID NO：5序列(SEQID NO：2序列N端的第二个丝氨酸替换成丙氨酸以及第五位的亮氨酸替换成苯丙氨酸，并且C端缺失三个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)，然后连接pGEM-T入载体。

2.构建含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的重组质粒及分子验证

设计扩增出完整编码SEQ ID NO：5序列的引物

上游引物(SEQ ID NO：23)：5’-CCGGAATTCATGGCTGATGATTTCAG TTTATGTAC-3’，

下游引物(SEQ ID NO：24)：5’-CCGGAGCTCTTGGGTTGGATATTGGCGGCGGCTG-3’

经PCR从连接有SEQ ID NO：5的pGEM-T载体中扩增SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2-4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与pET28连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：5的重组质粒。将含SEQ ID NO：5的重组质粒转化E.coli，涂布于含Amp的LB固体培养基上。经测序验证，得到含SEQ ID NO：4的重组质粒的E.colipET28菌株。

3.含SEQ ID NO：5重组质粒的E.colipET28菌株的高温耐受性验证

将含SEQ ID NO：5重组质粒的E.colipET28菌株，对照宿主菌株E.coli pET28以相同的接菌量(OD₆₀₀＝0.3)分别涂布于加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的固体培养基中，42℃培养过夜。对照宿主菌株E.coli pET28在42℃处理后不能生长(见图8-A)；含有SEQ ID NO：5的重组质粒E.coli pET28菌株在42℃的生长良好(见图8-B)。

实验结果证实：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的替换与缺失，例如SEQ ID NO：5核苷酸序列在大肠杆菌中的表达同样具有耐热的功能。

实施例八干旱胁迫对转基因油菜种子萌发及幼苗存活的影响

在实验室内一般可以采用PEG、甘露醇、蔗糖等溶液模拟干旱条件以测试植物的生长情况。Hohl等对上述胁迫剂研究的多项结果都支持用PEG作为渗透剂，研究植物的水分关系。分子量6000的PEG比分子量较低的PEG，如PEG1000、2000等的效果更好。可能是因为PEG6000的分子量较大，不会进入植物细胞造成伤害。蔗糖溶液易诱发霉菌，一般不用作渗透剂。因此，本实施例采用PEG 6000模拟干旱胁迫条件。

选三个株系上述制备的转基因型(OE)油菜与非转基因的野生型(WT)各100粒大小均匀、饱满、无病虫的油菜种子进行发芽。将8层吸水纸放入培养皿中，再放一层滤纸作为发芽床，处理组发芽床加10mL 10％的PEG6000溶液。对照组则分别选取三个株系转基因型(OE)与非转基因的野生型(WT)各100粒大小均匀、饱满、无病虫的油菜种子进行发芽，则加10mL蒸馏水，置于恒温25℃室内在自然光照下进行发芽。7d后测定存活幼苗数、计算成苗率，随机选取10株幼苗测定苗高、主根长、单株鲜重。试验重复3次。计算和测定方法如下：

相对发芽率＝(处理发芽率/对照发芽率)×100％；

相对苗高＝(处理苗高/对照苗高)×100％；

相对鲜重＝(处理鲜重/对照鲜重)×100％；

相对活力指数＝(处理成苗率×处理幼苗苗高)/(对照成苗率×对照幼苗苗高)×100％；

实验结果(见表2)表明转TT1基因油菜种子萌发率和幼苗生长情况优于野生型。

表2干旱胁迫对转TT1基因油菜种子萌发及幼苗存活的影响

实施例九干旱胁迫对转基因油菜脯氨酸(Pro)含量的影响

1、标准曲线的绘制

(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

(2)取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

(3)冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

(4)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

(5)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/2ml)。

2、样品的测定

(1)脯氨酸的提取：准确称取在相同正常培养条件下培养30天后的油菜(上述制备的转基因油菜三个株系以及野生型油菜各3株)叶片0.2～0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。

(3)冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。

(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。

3、结果计算

从标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式：脯氨酸含量(μg/g)＝[X×5/2]/样重(g)。求得平均值，结果见图9：

经过测算，发现转SEQ ID NO：1基因的油菜OE(1)、OE(2)、OE(3)，其脯氨酸的含量确实大于野生型油菜，其中OE(3)的含量极高。由于脯氨酸在植物细胞适应胁迫过程中起重要作用，其作用主要表现为细胞内的渗透调节剂、还原剂或能量来源、N素储藏物质、羟基自由基清除剂、细胞内酶的保护剂以及降低细胞内酸度和调节氧化还原电势等。因此在正常培养条件下，转TT1基因油菜的应对干旱引起的渗透胁迫的能力比野生型油菜强。

实施例十转SEQ ID NO：1油菜幼苗期植株抗旱能力测试

将正常条件下共培养20天的油菜幼苗(野生型与转基因型)进行干旱处理，停止浇水8天，期间定期观察其生长情况。结果如下：停止浇水当天基本无区别(参见图10)；停止浇水5天后，野生型幼苗已停止生长，所有叶片均已干枯萎蔫(参见图11)；而转TT1基因型幼苗仍能生长，且保持1-2片绿叶。停止浇水8天后，野生型幼苗彻底干枯死亡；而转TT1基因型幼苗仍能存活生长，甚至仍保持1-2片鲜绿叶(参见图12)。

实施例十一、转SEQ ID NO：1拟南芥植株制备和种子的获得

1、转基因拟南芥植株和种子的获得

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO：25)：5’-CGCGGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO：26)：5’-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2～4步骤循环30次

6.72℃ 5min (终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒说明书)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。将含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌中，利用花序浸染法转化拟南芥。详细步骤如下：

A、挑取含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌接种于含20mg/L Str，50mg/LKan，40mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜后收集菌体，重悬于含0.01％表面活性剂silwet-77的MS液体培养基中至OD₆₀₀＝0.4-0.6，28℃摇菌1-2h，菌液待用。

B、将培养60天的拟南芥已长出的花序剪掉，用含有SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌菌液浸泡花序2分钟，之后暗培养48小时，暗培养后的拟南芥苗即可移入正常光照环境生长，随后长出的荚果即为转TT1基因T0代种子。

2、转基因鉴定

将收获的种子栽种，长至50天后，取少许叶片进行PCR检测

上游引物(SEQ ID NO：27)：5’ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3’

下游引物(SEQ ID NO：28)：5’TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT 3’

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

PCR程序如下：

1.95℃ 4min (预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2～4步骤循环37次

6.72℃5min(终延伸)

7.4℃ 保存。

然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现，若有则代表目的基因已转入拟南芥。检测结果见图13：

从图13可见，1～12道为转基因拟南芥基因组DNA，13道为含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒DNA，待检测DNA的目的条带与过量表达质粒DNA的带一致，说明为SEQ ID NO：1核苷酸过量表达转基因阳性植株并制得其种子。

3、转基因阳性植株成熟后，收集种子备用。同理，制得SEQ ID NO：3序列过表达的拟南芥植株制备和种子备用。

实施例十二、不同浓度NaCl对拟南芥种子萌发率的影响

盐碱土的盐类通常为NaCl、Na2SO、Na2CO和NaHCO3等，盐胁迫除了也能造成水势降低外还有Na离子升高造成的离子胁迫，影响了植物对K离子和Ca离子等营养的吸收，从而对植物造成伤害。因此，本实验采用NaCl模拟盐胁迫条件。

配制好的MS培养基(配方见表3，pH用KOH调至5.8)在灭菌之前分别将NaCl添加进去，使得NaCl终浓度分别为0mmol/L(对照组)、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L，高压蒸汽灭菌后分装到培养皿中。培养基凝固后用2mL无菌水悬浮种子转入培养基上，待种子均匀播种后除去多余无菌水，打开皿盖，于无菌环境中放置1h至表面干燥，封口，然后放到培养室(22℃，光照强度6000～8000lx，16h/8h光暗周期，相对湿度70％)培养，每个处理3个重复，每天观察萌发及其他表型，统计萌发数，取其平均值。

表3MS培养基配方

实验结果表明：非转基因拟南芥种子对NaCl的浓度变化较敏感(见图14)，甚至在250mM、300mM都基本不发芽；而转TTl基因拟南芥种子对NaCl的耐受性较好(见图15)，在50mM、100mM、150mM浓度下，种子最终的萌发率都较高，即使在200mM、250mM、300mM浓度下，仍保持一定的萌发率，且其萌发率明显高于非转基因型。

实施例十三、不同浓度NaCl对拟南芥脯氨酸(Pro)含量的测定

1.茚三酮溶液显色法标准曲线的绘制

(4)用注射器轻轻吸取各管上层晡氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)。

2.样品的测定

(1)脯氨酸的提取：准确称取在同一生长条件下培养20天后的拟南芥(转基因四个株系以及野生型)幼苗0.2～0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

3.结果计算

从标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式：脯氨酸含量(μg/g)＝[X×5/2]/样重(g)。求得平均值，平均值结果见图16。

实验结果如下：如图17可以直观看出，茚三酮显色后，RLD比OEa、OEb、OEc、OEd颜色浅，其中OEa和OEd的颜色明显比其他颜色深，即过量表达株系的脯氨酸表达量比野生RLD型的高。

经过测算，发现转TT1基因的拟南芥，其脯氨酸的含量确实大于野生RLD型，其中OEa和OEd的含量极高(结果见图16)。

由于脯氨酸在植物细胞适应胁迫过程中起重要作用，其作用主要表现为细胞内的渗透调节剂、还原剂或能量来源、N素储藏物质、羟基自由基清除剂、细胞内酶的保护剂以及降低细胞内酸度和调节氧化还原电势等。因此在正常培养条件下，转TT1基因拟南芥的应对盐碱引起的渗透胁迫的能力比野生RLD型强。

实施例十四转SEQ ID NO：1基因微生物在各种PH条件下的生长实验

配制培养基：配制LB液体培养基，加入抗生素Kan 50ug/ml，Cam 50ug/ml及0.1mMIPTG后，分装，分别调pH至4.0、5.5、7.0、8.5、10.0后再分装试管，每种pH装2管，每管5ml，待用。

制备细菌悬液：取转TT1基因E.coli pET28和非转基因大肠杆菌单菌落37℃过夜活化。

滴加供试菌：在各pH水平的每管LB液体培养基中接入活化菌液0.05ml，摇匀后振荡培养(37℃，225rpm，14h)。

培养与观察：37℃培养14h后观察结果。以目测来判断转TT1基因大肠杆菌在各档pH条件下的生长情况(以“-”表示不生长，“+”表示稍有生长，“++”表示生长好，“+++”表示高浓度菌液)，结果见图19。同时定时多次测试OD值，用以绘制不同pH 值下的生长曲线，结果见图18。

结果发现转有TT1耐热基因的大肠杆菌比非转基因的大肠杆菌有较高的酸碱耐受性。正常pH条件下(pH7.0)，转TT1基因(T)和非转基因(C)的生长情况基本相同，如图可见，菌液浓度基本一致。而在酸性条件下，转TT1基因(T)和非转基因(C)的生长情况出现差异，如图可见，pH5.5时，转TT1基因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)菌液浓度较低；pH4.0时，转TT1基因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)细菌几乎不生长。而在碱性性条件下，转TT1基因(T)和非转基因(C)的生长情况也存在差异，如图可见，pH8.5时，转TT1基因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)菌液浓度较低；pH10时，转TT1基因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)细菌几乎不生长。

定时多次对37℃、pH4.0条件下，转TT1基因大肠杆菌和非转基因大肠杆菌的生长情况进行测定(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，OD值越大，表明菌液浓度越大，如图可见，随时间变化，转TT1基因大肠杆菌的生长曲线斜率明显大于非转TT1基因大肠杆菌，说明转TT1基因大肠杆菌的生长速度明显大于非转TT1基因大肠杆菌。

实施例十五SEQ ID NO：1基因提高抗逆性的初步机理研究

本发明使用宝生物工程(大连)有限公司销售的E.coliCHIP Version 2.0基因芯片，按其说书进行操作(基因筛选标准见表4)，对过表达TT1基因的大肠杆菌与空白对照的大肠杆菌的基因组表达进行比较，以初步探讨TT1基因提高微生物耐酸碱性和植物抗盐碱性的机理。

参照组：转入空载pET28a的大肠杆菌(Cy3)，实验组：转入TT1-pET28a的大肠杆菌(Cy5)。

表4基因筛选标准

基因芯片检测数据分析：E coli.全基因组约有4400个不同的编码基因，为了研究大肠杆菌中与TT1基因相互作用的基因，本发明进行基因芯片分析。分析发现，其中yabF，rhsE，yhcP，yzpK，yhiR基因由于TT1而受到上调表达。通过深入研究，发现上调表达的这些基因中yabF，rhsE，yhcP为与离子通道相关的基因，即TT1有可能是通过与调控某些离子通道相关蛋白的作用，而使细胞内外离子渗透平衡，降低离子过多而造成的损害。上述结果为揭示微生物耐酸碱和植物耐盐碱的机理提供了依据。

SEQUENCE LISTING

<110>四川贝安迪生物基因工程有限公司

<120>提高植物和微生物抗逆性的基因、多肽、载体及其应用

<130> G09P0008K

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>Brassica napus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(861)

<223>提高植物和微生物抗逆性的基因cDNA序列

<400>1

atg tcg gat gat ttg agt tta tgt acc gat cgt ctg ata acg gcc gag48

Met Ser Asp Asp Leu Ser Leu Cys Thr Asp Arg Leu Ile Thr Ala Glu

151015

agc ttg gaa tca gaa aag gat tct gga gaa agt tcc agg ctt caa ggc96

Ser Leu Glu Ser Glu Lys Asp Ser Gly Glu Ser Ser Arg Leu Gln Gly

202530

aaa gat gtg gct tct tct tca tct gcg gat gaa gct gaa gat gct agg144

Lys Asp Val Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asp Glu Ala Glu Asp Ala Arg

354045

aag tac tat gct gtt gtt gca gaa gag gag ccg ctt ctg caa tct gtt192

Lys Tyr Tyr Ala Val Val Ala Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val

505560

gag tgc cgt att tgc cag gag gaa gat atc act aag aac ttg gag act240

Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr

65707580

cct tgt gct tgc aat ggc agt ttg aag tat gct cac cgc aag tgt gtt288

Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val

859095

cag cgt tgg tgt aat gag aaa ggc gac ata atc tgc gaa ata tgc cac336

Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His

100105110

cag cct tat caa tct gga tat aca gca cct cca cct cct cct cct gat384

Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

115120125

gaa act ata att cac att ggt gac gac tgg gag gat gga gtt cac ttg432

Glu Thr Ile Ile His Ile Gly Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu

130135140

gac tcg agc gac ccg cgc att cta gca atg gct gcg gcg gaa cga cat480

Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His

145150155160

ttc ttg gaa gct gac tat gac gag tac tct gag tct aac tct agc ggt528

Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly

165170175

gct gcc ttc tgt cgc tct gct gct ctc atc ctg atg gca ctt tta ctg576

Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu

180185190

tta cgt gat gca cta aac ctc aca act aac cca gat gac gag gac gat624

Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp

195200205

ccc act gcc ttc ttc tct ctt ttc ctt ctt cgt gct gct ggt ttt ctc672

Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu

210215220

ctc cca tgt tat atc atg gca tgg gcc atc ggt att ctc cag cgc cgg720

Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg

225230235240

agg caa aga cag gaa gca gct gcg cta gct gcg gcg gaa gtt gcc ttc768

Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe

245250255

atg ata cac ggt ggt gtg cca caa cgc agg gga cta cac ttt gct gta816

Met Ile His Gly Gly Val Pro Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val

260265270

gca cca gag cag ccg ccg cca ata tcc aac cca aca cca gtc tga861

Ala Pro Glu Gln Pro Pro Pro Ile Ser Asn Pro Thr Pro Val

275280285

<210>2

<211>286

<212>PRT

<213>Brassica napus

<400>2

Met Ser Asp Asp Leu Ser Leu Cys Thr Asp Arg Leu Ile Thr Ala Glu

151015

Ser Leu Glu Ser Glu Lys Asp Ser Gly Glu Ser Ser Arg Leu Gln Gly

202530

Lys Asp Val Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asp Glu Ala Glu Asp Ala Arg

354045

Lys Tyr Tyr Ala Val Val Ala Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val

505560

Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr

65707580

Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val

859095

Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His

100105110

Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

115120125

Glu Thr Ile Ile His Ile Gly Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu

130135140

Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His

145150155160

Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly

165170175

Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu

180185190

Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp

195200205

Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu

210215220

Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg

225230235240

Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe

245250255

Met Ile His Gly Gly Val Pro Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val

260265270

Ala Pro Glu Gln Pro Pro Pro Ile Ser Asn Pro Thr Pro Val

275280285

<210>3

<211>696

<212>DNA

<213>Brassica napus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(696)

<223>筛选到的编码与atp6相互作用蛋白的核苷酸序列

<400>3

gaa gag gag ccg ctt ctg caa tct gtt gag tgc cgt att tgc cag gag48

Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu

151015

gaa gat atc act aag aac ttg gag act cct tgt gct tgc aat ggc agt96

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202530

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354045

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505560

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65707580

gac gac tgg gag gat gga gtt cac ttg gac tcg agc gac ccg cgc att288

Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile

859095

cta gca atg gct gcg gcg gaa cga cat ttc ttg gaa gct gac tat gac336

Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp

100105110

gag tac tct gag tct aac tct agc ggt gct gcc ttc tgt cgc tct gct384

Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala

115120125

gct ctc atc ctg atg gca ctt tta ctg tta cgt gat gca cta aac ctc432

Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu

130135140

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145150155160

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Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala

165170175

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180185190

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Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe Met Ile His Gly Gly Val Pro

195200205

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<210>4

<211>231

<212>PRT

<213>Brassica napus

<400>4

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202530

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354045

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala

165170175

Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala

180185190

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195200205

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<210>5

<211>852

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(852)

<223>经过缺失和替换后得到的能提高植物和微生物抗逆性的基因序列

<400>5

atg gct gat gat ttc agt tta tgt acc gat cgt ctg ata acg gcc gag48

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151015

agc ttg gaa tca gaa aag gat tct gga gaa agt tcc agg ctt caa ggc96

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202530

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354045

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Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr

65707580

cct tgt gct tgc aat ggc agt ttg aag tat gct cac cgc aag tgt gtt288

Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val

859095

cag cgt tgg tgt aat gag aaa ggc gac ata atc tgc gaa ata tgc cac336

Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His

100105110

cag cct tat caa tct gga tat aca gca cct cca cct cct cct cct gat384

Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

115120125

gaa act ata att cac att ggt gac gac tgg gag gat gga gtt cac ttg432

Glu Thr Ile Ile His Ile Gly Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu

130135140

gac tcg agc gac ccg cgc att cta gca atg gct gcg gcg gaa cga cat480

Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His

145150155160

ttc ttg gaa gct gac tat gac gag tac tct gag tct aac tct agc ggt528

Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly

165170175

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Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu

180185190

tta cgt gat gca cta aac ctc aca act aac cca gat gac gag gac gat624

Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp

195200205

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Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg

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<223>Synthetic Construct

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His

145150155160

Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly

165170175

Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu

180185190

Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp

195200205

Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu

210215220

Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg

225230235240

Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe

245250255

Met Ile His Gly Gly Val Pro Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val

260265270

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275280

<210>7

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<220>

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<220>

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<211>32

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<223>artificial

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cgcggatcca tgtcggatca tttgagttta tg32

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>12

ccggagctct cagactggtg ttgggttgga tat33

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>13

ccggagctca tgtcggatca tttgagttta tg32

<210>14

<211>33

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>14

cgcggatcct cagactggtg ttgggttgga tat33

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>15

atttcatttg gagagaacac gg22

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>16

tcagactggt gttgggttgg atat24

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>17

atttcatttg gagagaacac gg22

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>18

atgtcggatc atttgagttt atg23

<210>19

<211>32

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>19

ccggaattca tgtcggatca tttgagttta tg32

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>20

gctctagatc agactggtgt tgggttggat at32

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>21

atggctgatg atttcagttt atgtac26

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>22

ttgggttgga tattggcggc ggctg25

<210>23

<211>35

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>23

ccggaattca tggctgatga tttcagttta tgtac35

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>24

ccggagctct tgggttggat attggcggcg gctg34

Claims

1.一种多肽，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示。

2.编码权利要求1所述多肽的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：5所示。

4.权利要求1所述多肽的单克隆抗体。

5.一种重组载体，其特征在于它含有权利要求2或3所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于可表达权利要求2或3所述的基因。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体为重组质粒。

8.含有权利要求5、6或7任一项所述重组载体的宿主细胞。

9.含有权利要求5、6或7任一项所述重组载体的转基因微生物。

10.核苷酸序列为SEQ ID NO:1所述的基因或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽在提高油菜的耐热或抗旱性中的用途。

11.核苷酸序列为SEQ ID NO:1所述的基因或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽在提高拟南芥耐盐中的用途。

12.核苷酸序列为SEQ ID NO:1所述的基因或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽在提高大肠杆菌耐热、耐酸性或耐碱性中的用途。

13.核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的基因或氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的多肽在提高大肠杆菌耐热性中的用途。